Los autores desean agradecer a los participantes del estudio y sus padres. También nos gustaría dar las gracias a la Dra. Réjean Lapointe (CHUM Notre-Dame, Montreal, Canadá) para el acceso a su lector ELISpot, Dr. Lubo Alexandrov para el análisis estadístico, y Denis Blais, Sandra Caron, Silvie Valois y Martine Caty como experto técnico ayuda. Con el apoyo de subvenciones de Le Fonds d&#39;opération pour les projets de recherche clinique et d&#39;Evalution des tecnologías (CHU Sainte-Justine) a HS y PO, por la Fundación Centro de cancérologie Charles-Bruneau, y por la Sociedad de Leucemia y Linfoma de Canadá. ISF fue apoyado por becas de la Fundación CHU Sainte-Justine y le Fonds de la recherche du Québec-santé (FRQS). AJG fue el destinatario de becas del Departamento de Microbiología, Infectología e Inmunología, Universidad de Montreal (Gabriel-Marqués de Becas), FRQS, y los Institutos Canadienses de Salud Iesearch (CIHR). NM fue apoyado por la Fundación CHU Sainte-Justine, la Fundación Cole y FRQS.

Este protocolo de investigación fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de Ética del CHU Sainte-Justine, Montreal, Quebec, Canadá, donde se realizó el estudio. El consentimiento informado se solicitó y obtuvo de todos los participantes en el estudio, sus padres o tutores legales. Todos los procedimientos realizados en los días 1 y 2 deberán llevarse a cabo en condiciones estériles (es decir, bajo una campana de flujo laminar). Procedimientos de seguridad estándar para la manipulación de sangre humana deben ser estrictamente observados. 1. Recubrimiento de las placas <ol><li> Permeabilizar las difluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas en la parte inferior de 96 y placas de ELISPOT blanco MultiScreen IP mediante la adición a cada pocillo 20 l de etanol 35% durante 1 min. Las membranas deben hacerse ligeramente translúcida. </li><li> Inmediatamente lavar los pocillos 3 veces con 200 l de 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS; NaCl 137 mM, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na 2 HPO 4, 2 mM de KH 2 PO 4, pH 7,4) utilizando un multichannel pipeta o un dispositivo similar. Este paso es fundamental, dado que los residuos de etanol pueden afectar la viabilidad celular y la unión del anticuerpo de captura. Placas ELISpot son frágiles y deben manejarse con cuidado: no se recomienda el uso de un lavador de placas automatizado. </li><li> Recubrir los pocillos con 10 l de ratón purificada anticuerpo de captura de IFN-γ anti-humano diluido en 1x PBS a una concentración final de 10 mg / ml. Se cubren las placas con una envoltura de plástico normal y se incuba durante la noche a 4 ° C. </li></ol> 2. Placas de bloqueo <ol><li> Vaciar los pocillos, tocándolos seco, y lavar las placas 5 veces con 200 l de PBS 1x. </li><li> Llenar los pocillos con 200 l de medio completo RPMI 1640 y se incuban las placas durante 2 horas a 37 ° C (el bloqueo de paso). </li><li> Lavar las placas 5x con 200 l de 1x PBS y se mantienen los pozos llenos de 1x PBS hasta que las células están listas para ser chapada. </li></ol> 3. Plating celular y estimulación <ol><li> Preparar pcélulas mononucleares de sangre eripheral (PBMC) a partir de muestras de sangre venosa humana por centrifugación en gradientes de Ficoll-Paque utilizando procedimientos estándar. Por otra parte, el uso de métodos estándar, descongelar alícuotas de PBMC congelados en nitrógeno líquido. Después de los últimos centrifugación, las células se resuspenden a una concentración final de 2 x 10 6 células / ml y se incuba durante la noche a 37 ° C bajo una atmósfera de CO2 al 5% en una incubadora con camisa de agua. </li><li> Eliminar PBMC de la incubadora y resuspender en un volumen final de 5 ml de medio RPMI 1640 completo. </li><li> Incubar las PBMC en presencia de 10 l de endonucleasa de ingeniería genética a partir de Serratia marcescens durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Quitar una alícuota de 50 l de PBMC y mezclar con 50 l de colorante azul de tripano. Contar las células y estimar% de viabilidad usando un hemocitómetro y el examen microscópico (método de exclusión del colorante). Varios métodos automatizados para el recuento de células y la evaluación de la viabilidad celular puede colpor lo que se utilizará. PBMC debe ser&gt; 95% viables. Desechar la muestra cuando la viabilidad es más baja que 95%. </li><li> Centrífuga de PBMC a 700 xg durante 5 min, el sobrenadante de descarte, y volver a suspender las células en medio AIM-V complementado con 2% (v / v) de suero humano inactivado (SU) a una concentración final de 2 x 10 6 células / ml. Mantener a 37 ° C hasta que se agreguen las mezclas de estimulación a la placa. </li><li> Añadir a los pocillos, una gota a la vez, 100 l de la mezcla de la estimulación apropiada. Tres mezclas de estimulación deben ser utilizados como se describe a continuación: <ol><li> Uso medio AIM-V complementado con 2% (v / v) de suero humano inactivado (IHS) como control negativo. </li><li> Use anticuerpo anti-CD3 monoclonal (clon OKT3) diluido en medio AIM-V complementado con 2% (v / v) de IHS a una concentración final de 0,5 mg / ml como control positivo). </li><li> Utilice antígeno de VZV, en la forma de cualquiera de γ-irradiados (10.000 Gy; 30 min de tiempo de exposición) vivo atenuado de la vacuna de VZV (1350 unidades formadoras de placas [PFU] / ml) diluciónTed 1:200 en medio AIM-V complementado con 2% (v / v) de IHS) o 1 g de una mezcla equimolar de 67 péptidos (15 residuos de aminoácidos) sintetizado basado en la secuencia de la VZV inmediatamente temprano (IE63) fosfoproteína . Controlar la eficacia de la irradiación mediante el control de la ausencia de signos visibles de efectos citopáticos después de 4 días en cultivos de PBMC. </li><li> Preparar todos los pocillos por duplicado. </li></ol></li><li> Añadir a los pocillos, una gota a la vez, 100 l de células preparadas en el paso 5.4 a los pocillos apropiados. Dos pozos deben dejarse sin células (control negativo). Incubar durante 20 horas a 37 º C en una atmósfera de CO2 al 5% en una incubadora con camisa de agua. No agitar, mover o colocar las placas en la parte superior de uno al otro durante la incubación. </li></ol> 4. Punto de Desarrollo y Detección <ol><li> Desechar las células y lavar las placas 10 veces con 1x PBS suplementado con 0,05% (v / v) de Tween 20 (PBST). Tween 20 ayuda a desprender las células que se han adherido a la PVDF mímbrane después de la incubación durante toda la noche. </li><li> Usando una pipeta multicanal, añadir 100 l de 0,5 mg / ml de biotina conjugado anticuerpo monoclonal anti-IFN-γ (clon 4S.B3) diluida en 1X PBS que contenía 0,5% (w / v) de albúmina de suero bovino (BSA). Incubar las placas durante 2 horas a temperatura ambiente. </li><li> Lavar los pocillos 6x con PBST y añadir cada pocillo 100 l de conjugatd estreptavidina con fosfatasa alcalina diluido 1:1.000 en 1X PBS que contenía 0,5% (w / v) de BSA. Cubrir las placas e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Lavar las placas 3 veces con PBST y 3 veces con 1 × PBS. Añadir 100 l de un fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP) solución de sustrato / cloruro de nitro azul tetrazolio (NBT) e incubar 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Lave los platos bajo el chorro de agua destilada. Retire la sección inferior de la placa de ELISPOT y lavar ambos lados de la membrana con agua destilada. Secar las placas. </li><li> Examinar los pozos y enumerar las manchas utilizando un d estereoscópicamicroscopio issection o escanear las placas utilizando un contador punto automatizada. Mantener las placas protegidas de la luz, si no pueden ser examinados en el mismo día. <ol><li> La media de los números de manchas contadas en pocillos duplicados correspondientes y restar el número de manchas contadas en los pocillos de control negativo (sin células) desde el número de manchas contadas en los pocillos de ensayo. </li><li> Expresar la producción de IFN-γ como el número de unidades formadoras de puntos (SFU) por 10 6 PBMC. </li><li> Tenga en cuenta que las muestras de la prueba son positivos si el número de SFU es&gt; 50 por 10 6 PBMC y 2 desviaciones estándar (SD) por encima del control negativo (células + medio AIM-V complementado con 2% (v / v) de IHS). </li><li> Utilice un valor de 400 SFU por pozo cuando las manchas son demasiado numerosos para ser contados. </li></ol></li><li> Comprobar si los datos ELISpot normalmente se distribuyen o no mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov. Cuando los datos se distribuyen normalmente, realizar comparaciones estadísticas mediante la t de Student test (2 grupos) o ANOVA y el post-test de Bonferroni (comparaciones múltiples). Si los datos no se distribuyen normalmente, utilice la prueba de Mann-Whitney U (2 grupos) o la prueba de Kruskal-Wallis y post-test de Dunn (comparaciones múltiples). </li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Modificaciones y solución de problemas: los ensayos de IFN-γ ELISPOT se han utilizado para examinar las respuestas inmunes mediadas por células dirigidos contra una variedad de patógenos microbianos, incluyendo virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) 24,25, virus de la hepatitis C (VHC) 26, 27, y Mycobacterium tuberculosis 28,29, sólo para nombrar unos pocos. Aquí describimos el desarrollo de un ensayo ELISPOT IFN-γ para medir la inmunidad celular contra, con ...

Por primera vez en 1989, UCBT se utiliza cada vez más como parte del tratamiento de diversos trastornos de la sangre neoplásicas y no neoplásicas en niños 1. VZV es un herpesvirus alfa humana citopático que hace que dos enfermedades diferentes de la varicela, (después de la infección primaria) y el herpes zóster (después de la reactivación). Después de la infección primaria, el VZV persiste durante toda la vida del huésped protegida dentro de los nervios sensoriales de los ganglios de la raíz dorsal. Una de las complicaciones infecciosas más amenazantes siguientes UCBT se asocia con VZV 2-4. En nuestro centro clínico, en ausencia de profilaxis VZV, la incidencia acumulada de la enfermedad por VZV enfermedad VZV a los 3 años fue del 46% postUCBT 2. En estos pacientes, la infección de novo con o reactivación de VZV se asocia a menudo con la difusión visceral al sistema nervioso central, pulmones y el hígado 5-7. Como profilaxis resultado, aciclovir, valaciclovir o famciclovir se administra comúnmente UBDestinatarios CT 8,9. Sin embargo, esta estrategia de tratamiento no tiene en cuenta el potencial de protección de VZV linfocitos T específicos o la cinética de la reconstitución de las respuestas de células T específicas para VZV. Los problemas potenciales asociados con la expansión del uso de la profilaxis a largo plazo incluyen antiherpéticos a) sobretratamiento paciente; b) el desarrollo de resistencia a los medicamentos antivirales 10,11; y c) el deterioro de VZV reconstitución inmune específica 12,13. Dado que la detección de linfocitos T funcionales específicos de VZV se correlaciona con la presencia de la protección a largo plazo de la infección por VZV y el resultado clínico mejorado 4,14,15, el seguimiento de células mediada por las respuestas inmunes dirigidas contra VZV durante el período después del trasplante podría dar lugar a un uso más racional de antivirales tratamiento al permitir a los médicos a distinguir a los pacientes que se beneficiarían de VZV profilaxis de aquellos cuyo sistema inmunológico es capaz de controlar la replicación del VZV 4,13. El ensayo ELISPOT de IFN-γ se utiliza ampliamente para las respuestas inmunes mediadas por células de vigilancia en una variedad de sistemas experimentales y las condiciones clínicas. Las manchas se generan después de la escisión de un sustrato cromogénico, la generación de un precipitado visible y estable en el sitio de la reacción. Cada foco de ese modo representa la huella de una célula productoras de citoquinas individuales. IFN-γ ELISPOT no sólo mide la capacidad de las células individuales ex vivo para producir IFN-γ en respuesta a la estimulación in vitro con antígeno afín, sino que también proporciona una estimación de la frecuencia de responder las células en una población de células dada 16,17. Además de su alta sensibilidad, IFN-γ ELISPOT es sencillo de realizar, haciendo su uso posible en el contexto de protocolos clínicos personalizados destinados a guiar la iniciación o el cese del tratamiento antiviral. El procedimiento se detalla a continuación describiendoES un ensayo ELISPOT que está diseñado específicamente para detectar y medir la producción de IFN-γ por las células mononucleares de sangre periférica después de la estimulación in vitro con antígenos de VZV derivados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="857">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Leucocep tube</td>
			<td style="width:101px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">89048-936/89048-932</td>
			<td style="width:397px;">12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ficoll-Paque</td>
			<td style="width:101px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:143px;">17-1440-02</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benzonase nuclease</td>
			<td style="width:101px;">Novagen</td>
			<td style="width:143px;">70746-3</td>
			<td>Keep at -20 C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MultiScreenHTS-IP Filter Plate</td>
			<td style="width:101px;">Millipore</td>
			<td style="width:143px;">MSIPS4W10</td>
			<td>Sterile with pore size of 0.45 &#181;m.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mouse anti-human IFN-&#947; capture antibody</td>
			<td style="width:101px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:143px;">551221</td>
			<td>NIB42 clone.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pepmix VZV IE63&#160;</td>
			<td style="width:101px;">JPT Peptide Technologies</td>
			<td style="width:143px;">PM-VZV-IE63</td>
			<td>Dissolve contents of one vial in 40 &#956;L of DMSO. Use within 6 months.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biotin-conjugated anti-IFN-&#947; monoclonal antibody</td>
			<td style="width:101px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:143px;">554550</td>
			<td>4SB3 clone.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Bio-Rad Life Science</td>
			<td style="width:143px;">170-3554</td>
			<td>Dilute for use on the same day.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BCIP/NBT</td>
			<td style="width:101px;">Bio-Rad Life Science</td>
			<td style="width:143px;">170-6432</td>
			<td>Protect from light.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an ifn-&#947; elispot assay to assess varicella-zoster virus-specific cell-mediated immunity following umbilical cord blood transplantation

Varicela zoster (VZV) es una causa importante de morbilidad y mortalidad después del trasplante de sangre de cordón umbilical (UCBT). Por esta razón, la profilaxis antiherpético se administra sistemáticamente a los destinatarios UCBT pediátricos para prevenir complicaciones asociadas con la infección por VZV, pero no existe un consenso fuerte, basada en la evidencia que define su duración óptima. Debido a inmunidad mediada por células T es responsable para el control de la infección por VZV, la evaluación de la reconstitución de respuestas de células T específicas de VZV siguiente UCBT podría proporcionar indicaciones en cuanto a si la profilaxis deben ser mantenidas o pueden ser interrumpidos. Para este fin, un interferón gamma específica de VZV (IFN-γ) inmunospot ligado a enzima (ELISPOT) ensayo fue desarrollado para caracterizar la producción de IFN-γ por los linfocitos T en respuesta a la estimulación in vitro con la vacuna de VZV viva atenuada irradiado. Este ensayo proporciona una medición rápida, reproducible y sensible de VZV C específicaELL inmunidad adecuada para el seguimiento de la reconstitución de la inmunidad específica de VZV en un entorno clínico y la evaluación de la respuesta inmune a los antígenos de VZV mediada.

El protocolo de ELISPOT de IFN-γ se detalla más arriba fue desarrollado y optimizado en nuestro laboratorio para medir la magnitud y la calidad de las respuestas inmunes mediadas por células dirigidos contra VZV 4. Diversas fuentes de antígeno de VZV se pueden utilizar para la etapa de estimulación. Estos incluyen: a) de detergente disponible comercialmente extractos inactivadas de VZV infectaron células Vero 18; b) piscinas de péptidos sintéticos superpuestos de proteínas de VZV codificad...

Watch this Scientific Journal Video about Development of an IFN-Î³ ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation at Jo

Development of an IFN-&amp;#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Novel generaciones de ensayos funcionales tales como el interferón gamma (IFN-γ) ELISPOT, que detectan la producción de citoquinas en el nivel de células individuales y proporcionar tanto la caracterización cuantitativa y cualitativa de las respuestas de células T pueden ser usados ​​para evaluar las respuestas inmunes mediadas por células dirigidas contra la varicela zoster (VZV).

Desarrollo de un Varicela-Zoster inmunidad mediada por células específicas del virus de IFN-γ ELISPOT ensayo para evaluar la raíz del cordón umbilical de Trasplante de Sangre

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

development-an-ifn-elispot-assay-to-assess-varicella-zoster-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

15.5K vistas.  Université de Montréal.  Novel generaciones de ensayos funcionales tales como el interferón gamma (IFN-γ) ELISPOT, que detectan la producción de citoquinas en el nivel de células individuales y proporcionar tanto la caracterización cuantitativa y cualitativa de las respuestas de células T pueden ser usados ​​para evaluar las respuestas inmunes mediadas por células dirigidas contra la varicela zoster (VZV). 

Video: Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens. The ability to detect and quantify these responses in humans is an important diagnostic tool. The enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT) is gaining popularity for its ability to identify cellular immune responses against microbial antigens, including immunosuppressed populations such as those with HIV infection, transplantation, and steroid use. This assay has the capacity to quantify the immune responses against specific microbial antigens, as well as distinguish if these responses are Th1 or Th2 in character. ELISPOT is not limited to the site of inflammation. It is versatile in its ability to assess for immune responses within peripheral blood, as well as sites of active involvement such as bronchoalveolar lavage, cerebral spinal fluid, and ascites. Detection of immune responses against a single or multiple antigens is possible, as well as specific epitopes within microbial proteins. This assay facilitates detection of immune responses over time, as well as distinctions in antigens recognized by host T cells. Dual color ELISPOT assays are available for detection of simultaneous expression of two cytokines. Recent applications for this technique include diagnosis of extrapulmonary tuberculosis, as well as investigation of the contribution of infectious antigens to autoimmune diseases.

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Identification of microbial targets of adaptive immunity in idiopathic diseases can be accomplished by the use of the enzyme-linked immunospot assay.

Enzima-inmunoensayo de ensayo (ELISPOT): La cuantificación de la Th-1 respuesta inmune celular contra antígenos microbianos

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Investigación

Inmunología e Infección

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

La expansión de los linfocitos T citotóxicos sangre del cordón umbilical que Citomegalovirus Target, Virus de Epstein-Barr, adenovirus y

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

Aplicación clínica de<em&gt; La Bella Durmiente</em&gt; Artificial y células presentadoras de antígenos para modificar genéticamente las células T de la sangre del cordón umbilical y periférica

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

Aislamiento de los precursores de células B subconjuntos de Sangre del Cordón Umbilical

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

La investigación de los efectos de los probióticos en antineumocócica Colonización El uso de un<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensayo de adherencia

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Un ensayo de adhesión de flujo para estudiar Leucocyte Reclutamiento para hepático humano sinusoidales endotelio en condiciones de estrés de cizalla

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are used for host defense. For the quantitative determination of the functional status of the humoral immune response of an individual, both serum Abs and circulating ASCs are commonly measured as functional readouts. In humans, peripheral blood is the most convenient and readily accessible sample that can be used for the determination of the humoral immune response elicited by host B cells. Distinct B-cell subsets, including ASCs, can be isolated directly from peripheral blood via selection with lineage-specific Ab-conjugated microbeads or via cell sorting with flow cytometry. Moreover, purified na&#239;ve and memory B cells can be activated and differentiated into ASCs in culture. The functional activities of ASCs to contribute to Ab secretion can be quantified by ELISpot, which is an assay that converges enzyme-linked immunoabsorbance assay (ELISA) and western blotting technologies to enable the enumeration of individual ASCs at the single-cell level. In practice, the ELISpot assay has been increasingly used to evaluate vaccine efficacy because of the ease of handling of a large number of blood samples. The methods of isolating human B cells from peripheral blood, the differentiation of B cells into ASCs in vitro, and the employment of ELISpot for the quantification of total IgM- and IgG-ASCs will be described here.

Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.

El aislamiento, diferenciación y cuantificación de Human secretoras de anticuerpos células B de sangre: ELISpot como una lectura funcional de la inmunidad humoral

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express Fc&#947;Rs (e.g., Fc&#947;RI, Fc&#947;RIIA, Fc&#947;RIIB, and Fc&#947;RIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of Fc&#947;R-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate Fc&#947;Rs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out Fc&#947;R-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo Fc&#947;R-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of Fc&#947;R-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&amp;#947; Receptor-mediated Phagocytosis

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis.

El uso de una monocapa de monocitos Ensayo para evaluar la fagocitosis mediada por el receptor Fc gamma

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

La neuraminidasa Ensayo de inhibición basado en la fluorescencia para evaluar la susceptibilidad de los virus de la influenza a El Inhibidor de la neuraminidasa clase de antivirales

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for drug discovery, therapeutic target identification, and developing of diagnostics. Here, we present a protocol to discover specific Zika virus (ZIKV) diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. A human serum sample validated for ZIKV infection was incubated with a high-density peptide microarray containing the entire ZIKV protein translated into 3,423 unique 15 linear amino acid (aa) residues with a 14-aa residue overlap printed in duplicate. Staining with different secondary antibodies within the same array, we detected peptides that bind to Immunoglobulin M (IgM) and Immunoglobulin G (IgG) antibodies present in serum. These peptides were selected for further validation experiments. In this protocol, we describe the strategy followed to design, process, and analyze a high-density peptide microarray.

In this protocol, we describe a technique to discover Zika virus specific diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. This protocol can readly be adapted for other emerging infectious diseases.

Zika Virus específico diagnóstico del epítopo descubrimiento

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...