La investigación fue apoyada por el USDA, ARS Cris: 3625-32000-104 y Alimentación y la Agricultura Iniciativa de Investigación Competitiva subvención no. 2011-67015-30736 del Instituto Nacional del USDA de la Agricultura y la Alimentación. Damos las gracias a Jessica Pollock, Emma Frimml-Morgan, Shelly Zimmerman, Kristin Bass, Bruce Pesch, Molly Stafne, Allen Jensen, y Tracy Porter por su excelente asistencia técnica, así como Rebecca Madison, Doug Ewing, Katie Pille, Jay Steffen, David Lubbers , Robin Zeisness, y David Panthen por el excelente cuidado y manejo de animales.

1. Prepare las soluciones Siguiendo <ol><li> Preparar RPMI completo (cRMPI) mediante la adición de suero bovino fetal (FBS) a una concentración de 10% (volumen / volumen), glutamina (2 mM), piruvato de sodio (1 M), aminoácidos no esenciales (0,1 mM), penicilina -streptomycin (100 unidades / ml de penicilina y 0,1 mg / ml de estreptomicina) y 2-mercaptoetanol (50 mM) en RPMI 1640. </li><li> Preparar 2 X dextrosa citrato ácido, mediante la mezcla de citrato de sodio (77 mM), ácido cítrico (38 mM), y dextrosa (122 mM), en agua destilada. </li><li> Preparar Ca 2 + Mg 2+ fosfato libre de solución salina tamponada (PBS) pH 7,2: NaCl (137 mM), KCl (2,7 mM), Na 2 HPO 4 (dibásico, 10 mM), KH 2 PO 4 (monobásico, 2 mM) en agua destilada; ajustar el pH a 7,2. </li><li> Preparar PBS 1% (PBS 1% BSA) mediante la adición de albúmina de suero bovino en PBS (volumen / peso, 1 g / 100 ml de PBS). </li><li> Preparar PBS + 0,05% de Tween 20(PBST) mediante la adición de 0,05% de Tween 20 en PBS (volumen / volumen, 500 l de tween 20/1 L de PBS). </li><li> Preparar 100 mM tampón Tris HCL pH 8,2 mediante la mezcla de Tris (100 mM), HCl (0,50 mM) en agua destilada. </li><li> Preparar solución de etanol al 35% por dilución de alcohol etílico (pureza ≥99.5%) en agua destilada (volumen / volumen, 35 ml de alcohol etílico / 100 ml de agua destilada). </li><li> Filtrar esterilizar cRPMI, 2 x dextrosa citrato ácido, PBS, PBS 1% BSA utilizando 0,22 micras filtros. </li></ol> 2. Las células cultivadas a largo plazo (14 Protocolo Día) (Día uno) <ol><li> Preparar soluciones de antígeno a dos veces la concentración final en cRPMI. Antígeno elección es crítico y debe adaptarse a la finalidad del estudio. </li><li> Diluir M. recombinante tuberculosis antígenos TB10.4 y el antígeno Ag85A a 2 g / ml (de cada antígeno; la concentración final es 1 mg / ml). </li><li> Diluir M. bovis derivado proteico purificado(PPD-B, Prionics Ag) a 10 mg / ml (la concentración final es de 5 g / ml). </li><li> Diluir la temprana secretora recombinante diana antigénica 6 (ESAT-6) y la proteína de filtrado de cultivo 10 (CFP-10) proteína de fusión (Reşat-6: CFP10) a 2 mg / ml (concentración final de 1 mg / ml). NOTA: Estos antígenos son inmunodominante IFN-γ la inducción de antígenos de micobacterias tuberculosa y se pueden incluir para estimular PBMC de M. bovis animales infectados. BCG o M. bovis ΔRD1 vacunado animales no responden a Reşat-6: CFP10, como la región que codifica estos antígenos (es decir, RD1) se suprime en estas cepas. Reşat-6: CFP10 utilizado en estos estudios fue una especie de regalo del doctor C. Minion, de la Universidad Estatal de Iowa. TB10.4 y Ag85A antígenos son antígenos inmunodominantes presentes en la vacuna virulenta y M. bovis cepas 37. PPDB, como un derivado de proteína purificada, es un complejo de varios antígenos, incluyendo antígenos compartidos con micobacterias no tuberculosas. Infecanimales ted serán potencialmente responder a todos los antígenos (a saber: TB10.4, Ag 85A, Reşat-6: CFP10 y PPDb), mientras que los animales vacunados no deben responder a Reşat-6: CFP10 11. </li><li> Placa 500 l / pocillo de solución de antígeno por cuadruplicado para cada animal en una placa de 24 pocillos. Para este protocolo, utilice antígenos como una piscina; por lo tanto utilizan todos los pocillos contienen todos los antígenos y no hay controles (tales como, null o mitógeno) este paso. Incubar la placa a 39 ° C / 5% de CO 2. La temperatura normal del ganado es de 39 ° C; por lo tanto, algunos investigadores utilizan 39 ° C para el cultivo de células bovinas. Además, en ciertos casos con células humanas, de cultivo celular a 39 ° C proporciona un beneficio 26,30 añadió. </li><li> Jeringas pre-carga acoplada con 16 o 18 G agujas hipodérmicas con 6 ml de 2 X ácido-citrato-dextrosa; y recoger 60 ml de sangre bovina por punción venosa yugular. </li><li> Aislar PBMC por centrifugación en gradiente de densidad estándar de las fracciones de sangre periférica capa leucocitariaAjuste de la concentración celular a 4 X 10 6 células / ml como se describe por Maue et al. 27 </li><li> Añadir células (500 l / pocillo) en el antígeno precargado placa de 24 pocillos, en cuatro ejemplares de cada animal (paso 2.5). Incubar la placa a 39 ° C / 5% de CO 2. </li></ol> (Días tres y siete) <ol start="9"><li> Utilizando una técnica estéril, retire cuidadosamente 500 l del sobrenadante de cada pocillo sin alterar la capa de células. </li><li> Reponer volumen bien mediante la adición de 500 l / pocillo de cRPMI que contiene IL-2 (30 U / l, es decir, 15 U / pocillo; IL-2 humana recombinante Sigma I7908). Incubar la placa a 39 ° C / 5% de CO 2. </li></ol> (Días 10 y 12) <ol start="11"><li> Utilizando una técnica estéril, retire 750 l de sobrenadante de cada pocillo. Reponer el volumen con 750 l / pocillo de cRPMI (sin IL-2). Incubar la placa a 39 ° C / 5% de CO 2. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Ensayo ELISPOT (Protocolo de tres días) (El primer día (12 días del protocolo de cultivo a largo plazo)) <ol><li> Etiqueta de la placa de ELISPOT adecuadamente para cada conjunto de muestras, para evitar errores cuando chapado células: las células a largo plazo, además de las células presentadoras de antígenos (APC), células a largo plazo sin APC y ex vivo células / corto plazo (Figura 1). Replica para cada tratamiento (es decir, la estimulación antigénica) que se debe hacer al menos por duplicado. </li><li> Preparar la solución de anticuerpo de captura mediante la dilución de ratón anti-bovina anticuerpo IFN-γ (MCA2112, CC330 clon) en PBS (8 g / ml). </li><li> Usando una pipeta multicanal pre-humedecer los pocillos de la placa de ELISPOT con 15 l / pocillo de etanol 35% durante 1 min. Para evitar daños en la membrana, no toque el fondo de los pozos con puntas de pipeta en cualquier momento durante el ensayo. </li><li> Lave la placa seis veces con 300 l / pocillo de PBS. Fluido de lavado debe ser desechada por inversión placa. Lava debe hacerse rápidamente, no permitir que se sequen los pozos de la placa. </li><li> Pipetear 100 l / pocillo de anticuerpo de captura anti-IFN-γ (del paso 1 anterior). Se incuba a 4 ° CO / N (mantener la placa en el interior de una bolsa de almacenamiento con cremallera). </li></ol> (El segundo día (13 días del protocolo de cultivo a largo plazo)) <ol start="6"><li> Preparar soluciones de antígeno a dos veces la concentración final. Los tratamientos son: sin estimulación (cRPMI), PPD-B (20 mg / ml, concentración final: 10 mg / ml), cóctel de proteína de TB10.4 y Ag85A (2 mg / ml de cada proteína, concentración final: 1 mg / ml de cada proteína), Reşat-6: CFP10 (para la infección por M. bovis, 2 g / ml, concentración final: 1 mg / ml), y un control positivo, tal como hierba carmín (20 g / ml, concentración final: 10 g / ml). Otros mitógeno se pueden utilizar en lugar de PWM (por ejemplo, Concanavalina A). NOTA: para este paso antígenos componen cuatro tratamientos diferentes y son not utiliza como una piscina (como en el paso 2.5). Los cuatro tratamientos son: NS, PPDb, cóctel de proteínas (TB10.4 y Ag85A constituyen un tratamiento) y PWM. </li></ol> Cultivo celular 4. corto plazo y adherente celular (APC) Aislamiento <ol><li> Recoger 60 ml de sangre de los mismos animales desangrados en el día 1 (en: cultivo a largo plazo, 14 protocolo de día) y aislar PBMCs como antes. </li><li> Ajustar la concentración de células a 2 x 10 6 células / ml. Tubos etiqueta claramente para evitar una mala asignación cuando chapado células. Estas células se utilizan para el aislamiento APCs y también como cultivo de células a corto plazo (paso 6.5). Tubos Label tanto con el número de animales y el tipo de cultura (en este caso: ex vivo, a corto plazo o células frescas). </li><li> Retire el exceso de anticuerpo de captura desde el ELISPOT por inversión plato. Lavar las placas 6 veces con 300 l de PBST. </li><li> Retire la mayor cantidad PBST posible. Pipeta 50 l de suspensiones de células a los pocillos etiquetados como células a largo plazo, además de vehículos blindados. Bloquear otra wells con 200 l / pocillo de cRPMI. Incubar 90 minutos a 39 ° C o Pre-caliente cRPMI o 39 ° C (necesaria para las etapas subsiguientes). Serán necesarios PBMCs frescas no utilizados para células adherentes (APCs) aislamiento en pasos posteriores y deben ser almacenados. </li></ol> 5. Las células cultivadas <ol><li> Durante la incubación 90 min (etapa 4.4, cultivo a corto plazo y adherente etapa de aislamiento de células), las células cultivadas a largo plazo de la cosecha. </li><li> El uso de 5 o 10 l pipetas, medios de pipeta con células arriba y abajo para separar las células, se combinan la cuadruplicado replica de cada animal en un solo tubo de 15 ml. Centrifugar los tubos durante 5 minutos a 400 g. </li><li> Después de la centrifugación, desechar el sobrenadante por inversión del tubo. Desalojar el sedimento celular. Añadir 5 ml de PBS, volver a suspender suavemente pellet, si es necesario. Repetir la centrifugación. Repita el paso de lavado dos veces. Desechar el sobrenadante por inversión del tubo y suavemente las células en 1 ml cRPMI volver a suspender. Ajustar la concentración de célulasa 2 X 10 5 células / ml. </li></ol> 6. Revestimiento del fresco y PBMCs cultivadas <ol><li> Después de la incubación de 90 min, agitar las placas en la placa agitador durante 30 seg. Retire las células no adherentes por inversión plato. Pipetear 150 l / pocillo de tibia cRPMI (del paso 4, en: células de corto plazo y de células adherentes (APC) etapa de aislamiento). </li><li> Agite placas y deseche el fluido de lavado. Repita el lavado 3 veces. Añadir 100 l / pocillo de cada antígeno en pocillos apropiados (pre-marcado). </li><li> Para placa células, pipeta 100 l / pocillo de la suspensión de células cultivadas a largo plazo (2 x 10 5 células / ml) en los pocillos etiquetados como células a largo plazo, además de vehículos blindados. Asegúrese de que las células a largo plazo añadido en este paso son del mismo animal como la APC ya está en el pozo. No mezcle las células cultivadas de largo plazo de APC y de diferentes animales. </li><li> Pipetear 100 l / pocillo de la suspensión a largo plazo de células cultivadas (2 x 10 5 células / ml) en los pocillos sin APCs para la evaluación de las necesidades de APC a la respuesta de cultivo a largo plazo. </li><li> Añadir 100 l / pocillo de células a corto plazo (recién aisladas y se ajustaron a 2 x 10 6 células / ml) para la evaluación de la respuesta ex vivo. Incubar las placas O / N a 39 ° C / 5% de CO 2 incubadora. Asegúrese de que las placas están mintiendo plana y no se apilan platos. NOTA: Si se desea el análisis del fenotipo celular, citometría de flujo se puede realizar como un ensayo auxiliar. Las células se sembraron en 96 placas de pocillos de fondo U (en lugar de ELISPOT placas) como se describe para el ensayo de ELISPOT. Adsorción de anticuerpos de captura (pasos 3.4 hasta 3.5) debe ser omitido. Las células se incubaron a continuación O / N a 39 ° C / 5% de CO2 y un protocolo de tinción celular estándar realizada. Reactivos de tinción celular se incluyen en la tabla de reactivos. </li></ol> El tercer día (14 días del protocolo de cultivo a largo plazo) <ol start="6"><li> Diluir anticuerpo de detección (ratón anti-bovina IFN-γ, CC3 clon02) a 5 g / ml en PBS 1% BSA. Desechar los fluidos de pocillos y lavar las placas: seis veces con PBST (300 l / pocillo), colocando en un agitador cada vez por 10 seg antes y en-entre lavados, una vez con dH 2 O (300 l / pocillo), un adicional de 6 veces con PBST (300 l / pocillo) y dos veces con PBS (300 l / pocillo). Después las células se retiran de las placas, y si no se aplican las preocupaciones de bioseguridad, los procedimientos pueden realizarse fuera de cabinas de seguridad biológica. </li><li> Fluido de lavado Descartar. Retire la mayor cantidad de líquido de lavado como sea posible tocando la placa sobre papel de cocina. Añadir anticuerpo de detección (100 l / pocillo). </li><li> Incubar las placas durante 120 minutos a 39 ° o C. Durante esta etapa de incubación, preparar la solución de fosfatasa alcalina siguiendo las instrucciones del fabricante. Treinta minutos antes de su uso (es decir, 90 min después de la adición de anticuerpo de detección a los pocillos) diluir el reactivo en PBST. Invierta el tubo suavemente para mezclar los reactivos y se incubaron a temperatura ambiente. </li><li> Después de la 120 min de incubación, desechar el exceso de anticuerpo de detección por inversión plato. Lave la placa 6 veces con PBST (300 l / pocillo). Retire la mayor cantidad de líquido de lavado como sea posible tocando la placa sobre papel de cocina. </li><li> Añadir 100 l / pocillo de solución de fosfatasa alcalina (del paso 3 arriba). Incubar las placas durante 45 min a RT. Deseche el fluido y lavar cada placa 6 veces con PBST (300 l / pocillo). </li><li> Prepare la solución de sustrato siguiendo las instrucciones del fabricante (Vector Azul AP sustrato III): Diluir reactivos en 100 mM Tris HCL pH 8,2. Pipetear 50 l / pocillo de la solución de sustrato. </li><li> Incubar a RT hasta que el color azul comienza a desarrollar (aproximadamente 30 min). Deseche el fluido y lavar platos con abundante cantidad de dH 2 O. Retire la placa inferior para exponer la membrana, lavado posterior de pozos y permitir que la placa se seque al aire. </li><li> Leer las placas en el analizador inmunospot imagen o ELISPOT lector (Tabla 1), o manualmente, utilizando un estereomicroscopio. Alternativamente, mantenga placasen la oscuridad a temperatura ambiente hasta que la lectura. Debido a la alta estabilidad del sustrato de reacción, la calidad se conserva durante varios años. Nota: las concentraciones de antígeno y se optimizaron para evitar pozos con manchas incontables 23,24,27,37. Es posible que la formación de manchas incontables ocurren en diferentes entornos o debido a la variación biológica. Si ese es el caso, la concentración de células debe ser optimizado de manera que se obtiene una respuesta de conteo punto legible. </li></ol> 7. Placas Lectura y análisis de datos <ol><li> Realizar análisis según la guía lector Celular Technology Limited (CTL) placa ELISPOT (Tabla 1). Después de los recuentos de manchas se obtienen para cada uno de los pozos, calcular el promedio entre los duplicados. La respuesta inmune específica para cada estímulo antigénico se calcula restando el número medio de manchas en los pocillos no estimulados de la de los pozos estimulados por antígenos. </li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

La producción de IFN-γ en ensayos de ELISPOT cultivadas a largo plazo se debe generalmente a Tcm en los seres humanos, pero ¿cómo esta respuesta se desarrolla en la cultura es poco conocida. Ya sea Tcm están presentes en la circulación y expandir in vitro, o si las respuestas Tcm el resultado de la diferenciación de las células efectoras y Tem en Tcm durante el cultivo no se conoce. Sin embargo, los estudios con muestras de seres humanos han encontrado que las células T CD4 + de ex vivo y ensayos de ELISPOT cultivado IFN-γ a largo plazo tienen especificidades de epítopo no relacionados, lo que implica que las respuestas Tcm no se desarrollan a partir de células efectoras 28. Obviamente, la duración de la respuesta puede variar, pero si se logra aclaramiento de patógenos, con el tiempo, tanto ex vivo y las respuestas Tcm declinar. Además, las respuestas de los cultivos a largo plazo medidos temprano y mucho después de cebado antigénica (cuando la respuesta efectora es inferior) está demostrado que se correlaciona, lo que indica que circula poblaciones Tcm temprano y mucho después contracebado génica sigue siendo relacionada in vivo. Por otra parte, la magnitud de la respuesta ex vivo no parece estar relacionado con la magnitud de la respuesta de memoria 29. Estos resultados sugieren que cultivadas respuestas de ELISPOT de IFN-γ a largo plazo como resultado de la expansión in vitro de la MTC y una disminución asociada de respuestas efectoras en la muestra, en lugar de la diferenciación de las células efectoras en Tcm fenotipo. Con el ganado, no se conoce la contribución relativa de efectoras y de memoria subconjuntos a las respuestas detectada por los ensayos de ELISPOT de IFN-γ a largo plazo. Estudios recientes indican una correlación entre la vacuna suscitó cultivadas respuestas de ELISPOT de IFN-γ a largo plazo y protección contra la infección experimental posterior con M. bovis 23-24. Se ha informado de que la debilidad de las respuestas de ELISPOT de IFN-γ a largo plazo a la vacunación están asociados con la ausencia de protección 30. Ambos viven y matared vacunas inducen IFN-γ in vivo respuestas similares ex ELISPOT, pero la vacunación con BCG vivo provoca respuestas ELISPOT más fuertes a largo plazo cultivadas IFN-γ que hacer preparaciones de vacunas muertas. Curiosamente, las vacunas vivas son protectores mientras que las formulaciones muertos no pueden proporcionar protección contra el desafío con micobacterias virulentas tuberculosa 31-32, 33. Evaluación de las respuestas Tcm también es factible por la clasificación de estas células a partir de PBMC. Enriquecimiento directo de la MTC a partir de PBMC, sin embargo, requiere dispositivos caros, altamente capacitados personal y es difícil, ya que estas células no son numerosos en el torrente sanguíneo. La cultura a largo plazo de PBMC ofrece enriquecimiento de Tcm sobre Tem y células efectoras sin dispositivos caros; sin embargo, debido a que estas poblaciones de células T se expanden in vitro pueden ser menos representativa in vivo de respuestas de memoria. Es posible acceder a las respuestas de memoria IFN-γ (utilizando el cultivo a largo plazo o Tcm especieing estrategias) por ensayos distintos del ELISPOT como: pruebas ELISA de citoquinas 34, arreglos de cuentas de citoquinas (CBA), tinción intracelular (ICS), o arrays de proteínas de citoquinas (CPA). Estos métodos; sin embargo, son generalmente menos sensibles que ELISPOT Ensayos 35. Una ventaja de ELISPOT es su capacidad para detectar la captura inmediata de la citoquina poco después de su liberación de la prevención de la dilución en el sobrenadante y la degradación por escisión enzimática o captación de citoquinas por otras células. ELISPOT ensayos detectan células individuales que producen citoquinas que proporcionan resultados precisos incluso con poca señal a escenarios de ruido (es decir, respuestas específicas bajo) 35. También, con el ICS, la detección de citocinas antes de su liberación puede resultar en la falsa identificación de células productoras de citoquinas (por ejemplo., Debido a la modulación post-traduccional antes o durante el proceso de secreción) 34. Los inhibidores del transporte de empleadas con ICS ensayos para minimizar la secreción de citoquinasdurante la estimulación de antígeno (conocido como proteínas de parada de Golgi) limitar la duración de la estimulación de células debido a la toxicidad celular de estas proteínas en última instancia afectan a la producción de citocinas 35. Con eso dicho - CBA, CPA y ICS son técnicas útiles para la medición de múltiples citocinas simultáneamente y / o para la determinación de la superficie celular de expresión de marcador (es decir, con ICS.). Por lo tanto, estos métodos se pueden utilizar en combinación con el ensayo ELISPOT de IFN-γ 36. Mientras que los estudios de eficacia de vacunas de tuberculosis bovina anteriores midieron las respuestas Tcm a través de ensayo de ELISPOT, la detección de las respuestas Tcm por otras técnicas probable que dar resultados comparables. Es importante destacar que el ensayo ELISPOT es menos costoso y más sencillo de realizar que la CBA, CPA y análisis de ICS técnicas 34. Recuento manual de la SFC es una alternativa a recuento automatizado, y las placas de ELISPOT se puede almacenar a TA durante largo período de tiempo con una mínima pérdida de calidad, antes o después de punto contaje 37. A largo plazo, la respuesta de IFN-γ culta ELISPOT se ha aplicado para evaluar las respuestas de memoria por humanos, y el ganado en la evaluación de las respuestas de la vacuna de la tuberculosis 14-16,31-32,33. Respuestas Tcm también se supone que desempeñar un papel importante en las respuestas de acogida a varios otros agentes infecciosos de ganado, tales como:. Mycoides 42 Mycoplasma mycoides subsp, Anaplasma marginale 38 y el virus sincitial respiratorio bovino 39. Potencialmente, el ensayo ELISPOT a largo plazo podría ser adaptado para otras especies animales, citoquinas e infecciones. Estas aplicaciones más amplias serán especialmente útiles para aplicaciones de medicina veterinaria inmunológica debido a la corriente limitada disponibilidad de reactivos específicos. Tcm respuestas son cruciales para la protección contra varias infecciones, pero medirlos temprano después de la infección / inmunización (para la predicción de evolución de la enfermedad o la eficacia de la vacuna) may ser engorroso. Análisis de la respuesta inmune bajo condiciones ex vivo y la estimulación antigénica cortos será más a menudo representan respuestas efectoras, debido a la superposición de las respuestas de memoria y efectoras, especialmente durante el comienzo de la formación de la memoria inmunológica. En el contexto de las enfermedades crónicas en la que la carga antigénica es continua, ex vivo respuestas evaluarán las respuestas de células efectoras o una combinación de memoria y células efectoras respuestas. El largo plazo ensayo de IFN-γ culta ELISPOT, descrito aquí, probablemente permite la medición de respuestas Tcm en lugar de las células T efectoras o respuestas de células T CD4 + combinados. En resumen, el ensayo ELISPOT de IFN-γ cultivadas a largo plazo ofrece un enfoque valioso para la estimación de respuestas de memoria de células T y ha sido empleado con éxito para evaluar las respuestas de memoria de varias especies a una variedad de agentes infecciones 12-16, 20-25,29 , 31,33,34,38,39.

Las células efectoras y T de memoria se generan a través de la programación del desarrollo de las células T CD4 + vírgenes después del reconocimiento de antígeno. La diferenciación de las células T ingenuas CD4 + en las células productoras de citoquinas requiere el reconocimiento de patógenos por las células inmunes innatas, presentación de antígenos a las células T, co-estimulación y transcripcional cambios resultantes en la producción de citoquinas polarizada. Por ejemplo: las células presentadoras de antígenos producen interleuquina (IL) -12 en respuesta a patógenos intracelulares, que, junto con el reconocimiento del antígeno, promueve la diferenciación de las células T en células T helper 1 (Th1) 1,2 por señalización a través de transductor de señal y activador de la la transcripción 4 (STAT4) y T-box expresada en células T (T-bet), que conduce a la activación celular, la producción de IL-2, la expansión clonal y el interferón (IFN) producción -γ 3,4. Si se controla la infección, hasta 95% de las células T generadas durante la fase de expansión se eliminan (es decir, la contraccióncélulas en fase) y T de memoria siguen siendo, a veces durante toda la vida 5. Sallusto et al. 6, reveló dos subconjuntos funcionalmente distintos de células T de memoria en los seres humanos basado en la expresión de receptores homing de ganglios linfáticos. Células T de memoria central (MTC) expresan receptores de quimioquinas CC (CCR) -7 y CD45RO y se encuentran principalmente en las zonas de células T de los órganos linfoides secundarios. Tcm haber función efectora, un umbral de activación baja y mantener una alta producción de IL-2 y la capacidad proliferativa limitada. Las células T efectoras de memoria (TEM) expresan CD45RO, carecen de receptores CCR7 y visualización para homing a los tejidos periféricos o inflamadas. Las células efectoras no expresan ya sea CCR7 o CD45RO pero con prontitud producen citocinas efectoras, tales como IFN-γ, a partir del reconocimiento de antígeno. Ensayos de liberación de IFN-γ (IGRA) se utilizan para el diagnóstico de la tuberculosis bovina y humana 7. Mycobacterium bovis es el principal agente de la tuberculosis bovina (BTB), mientras que ca humanases de la tuberculosis son causados ​​principalmente por Mycobacterium tuberculosis. Con estas pruebas, sangre entera o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) son estimuladas con antígenos de micobacterias durante 16 a 24 horas y la producción de IFN-γ en el sobrenadante se mide por ELISA o mediante la detección de células productoras de IFN-γ utilizando técnicas ELISPOT. Como resultado de la breve periodo de estimulación (es decir., De 16 a 24 h) y la producción rápida de citoquinas, ensayos ex vivo detectan principalmente respuestas efectoras y TEM. Esto ha sido confirmado por el análisis de citometría de flujo de poblaciones de células en estos cultivos 8-10. Ex vivo respuestas de IFN-γ se incluyen habitualmente en el panel de evaluación de la respuesta inmune de las vacunas contra la tuberculosis, incluidos los que se utilizan para evaluar las respuestas de ganado. La mayoría de las vacunas contra la tuberculosis bovina eficaces provocan respuestas de IFN-γ específicas, pero no todas las vacunas que inducen respuestas de IFN-γ son protective. Además, los niveles de IFN-γ inducida por la vacunación, medida antes de la infección, no se correlaciona necesariamente con la protección. Por ejemplo, diferentes cepas de BCG pueden tener diferentes capacidades para inducir la respuesta ex vivo IFN-γ, a pesar de niveles similares de protección 11. Por lo tanto, ex vivo IGRA son valiosos para el diagnóstico de la tuberculosis y para el acceso a la inmunogenicidad de la vacuna; Sin embargo, su uso como predictores de eficacia de la vacuna es limitada. Respuestas TCM para la vacunación, por otra parte, se pueden usar para predecir la eficacia de la vacuna, como se ha demostrado con la infección por virus de la inmunodeficiencia del simio (SIV) en los primates no humanos, 12,13 tuberculosis en ratones 14 y la malaria en seres humanos 15,16. Después de una respuesta inmune efectiva que resulta en la remoción de patógenos, Tcm se mantienen y proporcionar protección a una segunda infección eventual por el mismo agente. Una notable excepción a este escenario es M. infe tuberculosiscción de los seres humanos en los que los pacientes que reciben terapia anti-micobacteriana curativo son susceptibles a la re-infección 17,18. Además, eventos que regulan la memoria inmunológica durante las infecciones crónicas, en el que la estimulación antigénica persiste, no están bien entendidas 19. Durante las infecciones crónicas, tales como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y la tuberculosis, una respuesta significativa Tcm está asociada con un resultado favorable (por ejemplo, la latencia con la tuberculosis y la enfermedad subclínica con el VIH) 20,21. Varios estudios con ratones y seres humanos han demostrado que los ensayos ELISPOT de IFN-γ en cultivo a largo plazo miden respuestas Tcm 16,20-22. Con este ensayo, las PBMC se cultivan en la disminución de la concentración de antígeno para 10 a 14 días, lo que permite respuestas efectoras de pico y disminuyen; facilitando Tcm diferenciar y ampliar dentro de la cultura. Ensayos de ELISPOT de IFN-γ cultivadas a largo plazo también se han utilizado en veterinariainvestigación, sin embargo, el fenotipo de células que responden ha sido difícil de evaluar debido a la falta de reactivos críticos, especialmente un anticuerpo para CCR7. Vacunas contra la tuberculosis bovina eficaces [por ejemplo. usando una dosis única de M. bovis bacilo de Calmette Guerin (BCG), seguido por BCG vacuna de subunidad Antígeno 85A-viral vectorizada, o M atenuada. bovis ΔRD1] provocar respuestas de ELISPOT cultivadas a largo plazo de IFN-γ después de la vacunación que se correlacionan con la protección (es decir, la carga micobacteriana inferior y disminuyó TB asociada a la patología) en contra de la estimulación subsiguiente con virulenta M. bovis 23,24. Además, el número de células IFN-γ secretoras específicas de antígeno dentro de cultivos de PBMC a largo plazo son superiores a los 12 meses pero disminuyen a los 24 meses después de la vacunación BCG de terneros neonatales, se correlaciona con el grado de protección poste detectable M. desafío bovis 25. En este escenario, el cultivaron ELISPOT de IFN-γ es unan herramienta importante para predecir la eficacia de la vacuna, proporcionando un medio para dar prioridad a los candidatos de vacunas para los ensayos de eficacia de alto costo. Adicionalmente, las técnicas de ELISPOT cultivadas se pueden adaptar para diversos huéspedes, patógenos y citoquinas mediante la alteración de antígenos o anticuerpos para una variedad de propósitos en diferentes campos de investigación.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">Sodium citrate (dihydrate)</td>
			<td rowspan="2">Various</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Citric acid (monohydrate)</td>
			<td rowspan="2">Various</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Dextrose</td>
			<td rowspan="2">Various</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISPOT PVDF plate</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectastain ABC &#8211; AP KIT Standard</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>AK-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-5300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag85A</td>
			<td>Lionex</td>
			<td>LRP-0004.3</td>
			<td>23, 24, 25, 37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB 10.4</td>
			<td>Lionex</td>
			<td>LRP-0061.6</td>
			<td>23, 24, 25, 37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPDb</td>
			<td>Prionics AG</td>
			<td>7600055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rESAT-6:CFP10</td>
			<td>Kind gift Dr. Minion, Iastate</td>
			<td></td>
			<td>23, 24, 25, 27,&#160; 37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-bovine IFN-&#947; Clone CC302</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>MCA1783B</td>
			<td>23, 24, 25, 27,&#160; 37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-bovine IFN-&#947; Biotinylated Clone CC330</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>MCA2112</td>
			<td>23, 24, 25, 27,&#160; 37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-bovine CD4 Clone CC8</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>MCA1653GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-bovine CD45RO Clone IL116A</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>MCA2434GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-human CCR7 Clone 3D12</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab95665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-bovine IFN-&#947;-Pe Clone CC302</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>MCA1783PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti- mouse IgG2a- Alexa Fluor 350</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG3 APC-CY7</td>
			<td>SouthernBiotechnology</td>
			<td>1080-193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat IgG-APC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm&#8482;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrefeldinA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pokeweed Mitogen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinat human Interleukin 2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7908</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay for assessing effector and memory t cell responses in cattle

Las células efectoras y T de memoria se generan a través de la programación del desarrollo de las células ingenuas tras el reconocimiento de antígenos. Si la infección se controla hasta el 95% de las células T generados durante la fase de expansión son eliminadas (es decir., Fase de contracción) y las células T de memoria siguen siendo, a veces durante toda la vida. En los seres humanos, dos subconjuntos funcionalmente distintos de células T de memoria se han descrito sobre la base de la expresión de receptores homing de ganglios linfáticos. Las células T de memoria central expresan receptores de quimioquinas CC 7 y CD45RO y se encuentran principalmente en las zonas de células T de los órganos linfoides secundarios. Las células T efectoras de memoria expresan CD45RO, carecen de receptores CCR7 y visualización asociados a homing de los linfocitos a los tejidos periféricos o inflamadas. Células T efectoras no expresan ya sea CCR7 o CD45RO pero al encuentro con citocinas efectoras producen antígeno, tales como el interferón-γ. Ensayos de liberación de interferón-γ se utilizan para el diagnóstico de la tuberculosis bovina y humana ydetectar principalmente efector y efectoras de memoria las respuestas de células T. Respuestas de las células T de memoria central por las células T CD4 + a la vacunación, por otra parte, se pueden usar para predecir la eficacia de la vacuna, como se ha demostrado con la infección por virus de la inmunodeficiencia del simio de primates no humanos, la tuberculosis en ratones, y la malaria en los seres humanos. Varios estudios con ratones y seres humanos, así como datos no publicados sobre el ganado, han demostrado que los ensayos ELISPOT interferón-γ miden memoria central respuestas de células T. Con este ensayo, las células mononucleares de sangre periférica se cultivan en la disminución de la concentración del antígeno durante 10 a 14 días (a largo plazo) de cultivo, lo que permite respuestas efectoras de pico y disminuyen; facilitando las células T de memoria centrales para diferenciar y ampliar dentro de la cultura.

Aproximadamente un mes después de la infección-aerosol con M. bovis (10 4 unidades formadoras de colonias), PBMCs de infectada (n = 8) y los animales de control (n = 8) se cultivaron en presencia de antígenos y IL-2 durante 13 días. Desarrollo de respuestas Tcm después de la infección se determinó usando el ensayo de ELISPOT de IFN-γ. Representante Tcm (en presencia o ausencia de APC) y ex vivo IFN-γ respuestas de ELISPOT de animales infectados (tres animales) y un animal no infectado (un animal) se muestran en la Figura 1. Un éxito a largo plazo IFN-γ ELISPOT resultados del ensayo en células productoras de IFN-γ (SPOT-células formadoras, SFC) en condiciones estimuladas y cerca de la ausencia de una respuesta de los animales no infectados y en condiciones no estimuladas. Además, una fuerte respuesta de células T debería ocurrir en respuesta a PWM. Respuestas específicas a M. bovis fueron evaluados por PPD-B o Reşat-6: CFP10 estimulación antigénica. Como se muestra en la figura1, robusto Tcm y ex vivo respuestas a PPD-B y Reşat-6: CFP10 se detectaron desde los tres M. bovis infectados con animales. Un mínimo o ningún Tcm y ex vivo respuestas fueron detectados a partir del animal control. Además, se requiere la presencia de APCs para las respuestas óptimas Tcm por animales infectados, como se demuestra por las respuestas muy reducidos por las células a largo plazo cultivadas en ausencia de APC autólogas. Respuesta de IFN-γ por PBMCs de M. bovis infectados y los animales no infectados se presentan en la Figura 2. El número de SFCs de cada animal se calculó como el número medio de SFC en duplicados de las muestras en respuesta a PPD-B menos la respuesta respectiva al medio solo. Las respuestas fueron estimados por 10 6 células. Las respuestas fueron diferentes (P &lt;0.05) con base en el estado de infección, la presencia o ausencia de APC y la duración de cultivo (por ejemplo., A largo plazo la cultura frente al ex vivo la cultura). <table border="0" cellpadding = &quot;0&quot; cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <colgroup><col /><col /></colgroup><tbody><tr><td colspan="2"> La adquisición de imagen de las placas </td></tr><tr><td> 1. </td><td> Encienda la máquina </td></tr><tr><td> 2. </td><td> Abrir &quot;Inmuno captura&quot; software versión 6.3. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> Paso 1: seleccione el tipo de plato. </td></tr><tr><td> 4. </td><td> Paso 2: placa de carga. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> Paso 3: seleccionar opciones de análisis. </td></tr><tr><td> 6. </td><td> Paso 4: iniciar la exploración. </td></tr><tr><td> 7. </td><td> Obtener imagen general de la placa. </td></tr><tr><td> 8. </td><td> Expulsar placa. </td></tr><tr><td> 9. </td><td> Salga de software &quot;Captura Inmuno&quot;. </td></tr><tr><td colspan="2"> Contando las unidades formadoras de contado </td></tr><tr><td> 1. </td><td> Abra el software de &quot;Captura Inmuno Spot&quot; Versión 5.0. </td></tr><tr><td> 2. </td><td> Seleccione objec<html> tipo t: normal. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> Seleccionar módulo de conteo: conteo inteligente. </td></tr><tr><td> 4. </td><td> Paso 1: placa de carga. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> Paso 2: definir los parámetros de conteo: exactitud de la prueba de reconocimiento lugar en pozos con diferentes puntos. </td></tr><tr><td> 6. </td><td> Iniciar recuento automático. </td></tr><tr><td colspan="2"> Control de calidad </td></tr><tr><td> 1. </td><td> Abrir &quot;inmunoensayo de captura&quot; software versión 5.0. </td></tr><tr><td> 2. </td><td> Seleccionar módulo de conteo: control de calidad. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> Paso 1: placa de carga. </td></tr><tr><td> 4. </td><td> Paso 2: Analizar los pozos resaltados individualmente. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> Termine el control de calidad. </td></tr></tbody></table> Tabla 1 - adquisición de imágenes lector Autoimmun Diagnostika ELISPOT y celular contando procedimiento. ove_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52833/52833fig1.jpg" /> Figura 1. Imagen de pozos de un IFN-cultivadas a largo plazo γ ensayo ELISPOT. Ensayo de IFN-γ cultivadas de ELISPOT se realizó meses approximatelyone después del desafío con virulenta M. bovis (tres animales). Animales no infectados se incluyeron como controles (un animal) líneas celulares a largo plazo se generaron mediante la estimulación de PBMC con un cóctel de Ag85A recombinante (1 mg / ml), TB10.4 (1 g / ml), Reşat-6.: CFP10 (1 mg / ml) y PPD-B (5 g / ml) durante 13 días, seguido de transferencia a placas de ELISPOT en presencia o ausencia de APC autólogas. Células corto plazo consistían en PBMC aislado en días 13 y chapada directamente en placas ELISPOT. Células a largo plazo y corto plazo fueron estimuladas con PPD-B (10 mg / ml), Reşat-6: CFP10 (1 mg / ml), medio solo o hierba carmín mitógeno (5 &amp;# 956; g / ml) durante 24 h. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52833/52833fig2.jpg" /> Figura 2. Los resultados representativos de un IFN-cultivadas a largo plazo γ ELISPOT respuesta a M. bovis derivado proteico purificado (PPD-B). ensayo cultivadas de IFN-γELISPOT se realizó meses approximatelyone después del desafío con virulenta M. bovis (ocho animales). Animales no infectados se incluyeron como controles (células ocho animales a largo plazo se generaron mediante la estimulación de PBMC con un cóctel de Ag85A recombinante (1 mg / ml), TB10.4 (1 g / ml), Reşat-6: CFP10 (1 g / ml) y PPD-B (5 g / ml) durante 13 días, seguido de transferencia a placas de ELISPOT en la presencia o ausencia de APC autólogas. células a corto plazo consistían en PBMC aislado en día 13 y se sembraron directamente en la placa de ELISPOT . A largo plazo y shocélulas rt plazo fueron estimuladas con PPD-B (10 g / ml) o medio solo durante 24 h. Respuestas específicas de cada animal (10/6 células SFC) se presentan como respuesta a PPD-B (promedio de muestras por duplicado), menos la respuesta a medio solo.

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Application of Long-term cultured Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Cultivaron interferón-γ ensayo inmunospot ligado a enzimas a largo plazo se utiliza como una medida de respuestas de memoria centrales y se correlaciona con respuestas a la vacuna anti-micobacterianas protectoras. Con este ensayo, las células mononucleares de sangre periférica son estimulados con antígenos de micobacterias y la interleucina-2 durante 14 días, permitiendo la diferenciación y expansión de las células T de memoria centrales.

Aplicación de Ensayo inmunoensayo de largo plazo culta Interferón-γ ligado a enzimas para la evaluación efectoras y de memoria T respuestas celulares en el ganado

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

application-long-term-cultured-interferon-enzyme-linked-immunospot

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

12.1K vistas.  United States Department of Agriculture.  Cultivaron interferón-γ ensayo inmunospot ligado a enzimas a largo plazo se utiliza como una medida de respuestas de memoria centrales y se correlaciona con respuestas a la vacuna anti-micobacterianas protectoras. Con este ensayo, las células mononucleares de sangre periférica son estimulados con antígenos de micobacterias y la interleucina-2 durante 14 días, permitiendo la diferenciación y expansión de las células T de memoria centrales. 

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Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens. The ability to detect and quantify these responses in humans is an important diagnostic tool. The enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT) is gaining popularity for its ability to identify cellular immune responses against microbial antigens, including immunosuppressed populations such as those with HIV infection, transplantation, and steroid use. This assay has the capacity to quantify the immune responses against specific microbial antigens, as well as distinguish if these responses are Th1 or Th2 in character. ELISPOT is not limited to the site of inflammation. It is versatile in its ability to assess for immune responses within peripheral blood, as well as sites of active involvement such as bronchoalveolar lavage, cerebral spinal fluid, and ascites. Detection of immune responses against a single or multiple antigens is possible, as well as specific epitopes within microbial proteins. This assay facilitates detection of immune responses over time, as well as distinctions in antigens recognized by host T cells. Dual color ELISPOT assays are available for detection of simultaneous expression of two cytokines. Recent applications for this technique include diagnosis of extrapulmonary tuberculosis, as well as investigation of the contribution of infectious antigens to autoimmune diseases.

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Identification of microbial targets of adaptive immunity in idiopathic diseases can be accomplished by the use of the enzyme-linked immunospot assay.

Enzima-inmunoensayo de ensayo (ELISPOT): La cuantificación de la Th-1 respuesta inmune celular contra antígenos microbianos

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Investigación

Inmunología e Infección

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human papillomavirus (HPV), that cause localized infections. The steps involved are identifying region(s) of HPV proteins that contain T-cell epitope(s) from a subject, selecting for the peptide-specific T cells based on interferon-&gamma; (IFN-&gamma;) secretion, and growing and characterizing the T-cell clones (Fig. 1). Subject 1 was a patient who was recently diagnosed with a high-grade squamous intraepithelial lesion by biopsy and underwent loop electrical excision procedure for treatment on the day the T cells were collected1. A region within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 and E7 proteins which contained a T-cell epitope was identified using an IFN- g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay performed with overlapping synthetic peptides (Fig. 2). The data from this assay were used not only to identify a region containing a T-cell epitope, but also to estimate the number of epitope specific T cells and to isolate them on the basis of IFN- &gamma; secretion using commercially available magnetic beads (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). The selected IFN-&gamma; secreting T cells were diluted and grown singly in the presence of an irradiated feeder cell mixture in order to support the growth of a single T-cell per well. These T-cell clones were screened using an IFN- &gamma; ELISPOT assay in the presence of peptides covering the identified region and autologous Epstein-Barr virus transformed B-lymphoblastoid cells (LCLs, obtained how described by Walls and Crawford)2 in order to minimize the number of T-cell clone cells needed. Instead of using 1 x 105 cells per well typically used in ELISPOT assays1,3, 1,000 T-cell clone cells in the presence of 1 x 105 autologous LCLs were used, dramatically reducing the number of T-cell clone cells needed. The autologous LCLs served not only to present peptide antigens to the T-cell clone cells, but also to keep a high cell density in the wells allowing the epitope-specific T-cell clone cells to secrete IFN-&gamma;. This assures successful performance of IFN-&gamma; ELISPOT assay. Similarly, IFN- &gamma; ELISPOT assays were utilized to characterize the minimal and optimal amino acid sequence of the CD8 T-cell epitope (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) and its HLA class I restriction element (B58). The IFN- &gamma; ELISPOT assay was also performed using autologous LCLs infected with vaccinia virus expressing HPV 16 E6 or E7 protein. The result demonstrated that the E6 T-cell epitope was endogenously processed. The cross-recognition of homologous T-cell epitope of other high-risk HPV types was shown. This method can also be used to describe CD4 T-cell epitopes4.

Use of Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Characterizing T-cell epitopes of pathogens that cause localized infections such as human papillomavirus is a challenge because of limited number of T cells in circulation. A method is described in which rare T cells were isolated and were characterized starting with a very small number of cells.

El uso de interferón-γ enzimo-inmunoensayo para la Caracterización de Nuevos epítopos de células T del virus del papiloma humano

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

Ensayo in vitro para evaluar el impacto de inmunoreguladoras Caminos de CD4 T función específica para el VIH efector celular

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of immunotherapies. Here we describe the use of fluorescent target array (FTA) technology, which utilizes vital dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), violet laser excitable dyes (CellTrace Violet: CTV) and red laser excitable dyes (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD) to combinatorially label mouse lymphocytes into &#62;250 discernable fluorescent cell clusters. Cell clusters within these FTAs can be pulsed with major histocompatibility (MHC) class-I and MHC class-II binding peptides and thereby act as target cells for CD8+ and CD4+ T cells, respectively. These FTA cells remain viable and fully functional, and can therefore be administered into mice to allow assessment of CD8+ T cell-mediated killing of FTA target cells and CD4+ T cell-meditated help of FTA B cell target cells in real time in vivo by flow cytometry. Since &#62;250 target cells can be assessed at once, the technique allows the monitoring of T cell responses against several antigen epitopes at several concentrations and in multiple replicates. As such, the technique can measure T cell responses at both a quantitative (e.g.&#160;the cumulative magnitude of the response) and a qualitative (e.g.&#160;functional avidity and epitope-cross reactivity of the response) level. Herein, we describe how these FTAs are constructed and give an example of how they can be applied to assess T cell responses induced by a recombinant pox virus vaccine.

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in detail in vivo is important for the development of our understanding of the immune response. Here we describe the use of fluorescent target arrays (FTAs) in an in vivo T cell assay that assesses &#62;250 parameters simultaneously by flow cytometry.

El uso de fluorescentes Arrays objetivo para la evaluación de las respuestas de células T<em&gt; En vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

La inducción de la inflamación intestinal murino por transferencia adoptiva de Efector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; T células en ratones inmunodeficientes

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

La medición de la influenza neuraminidasa inhibición títulos de anticuerpos mediante un ensayo de lectina ligado a enzimas

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the pro-inflammatory capabilities of various factors is challenging and requires terminal procedures, such as bronchoalveolar lavage and the removal of lungs for in situ analysis, precluding longitudinal visualization in the same mouse. Here, lung inflammation is induced through the intratracheal instillation of Pseudomonas aeruginosa culture supernatant (SN) in transiently transgenized mice expressing the luciferase reporter gene under the control of a heterologous IL-8 bovine promoter. Luciferase expression in the lung is monitored by in vivo bioluminescent image (BLI) analysis over a 2.5- to 48-h timeframe following the instillation. The procedure can be repeated multiple times within 2 - 3 months, thus permitting the evaluation of the inflammatory response in the same mice without the need to terminate the animals. This approach permits the monitoring of pro- and anti-inflammatory factors acting in the lung in real time and appears suitable for functional and pharmacological studies.

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

The method described here allows for the visualization of IL-8 promoter-dependent inflammation activation in the lungs of mice through non-invasive bioluminescence imaging (BLI). The same animal can be subjected to BLI multiple times for up to two months from the time of delivery of the luciferase reporter construct.

Un modelo de ratón IL-8 transgénicamente transgéni-<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoreo a Largo Plazo de las Respuestas Inflamatorias

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

A Chronic Autoimmune Dry Eye Rat Model with Increase in Effector Memory T Cells in Eyeball Tissue

Dry eye disease is a very common condition that causes morbidity and healthcare burden and decreases the quality of life. There is a need for a suitable dry eye animal model to test novel therapeutics to treat autoimmune dry eye conditions. This protocol describes a chronic autoimmune dry eye rat model. Lewis rats were immunized with an emulsion containing lacrimal gland extract, ovalbumin, and complete Freund&#39;s adjuvant. A second immunization with the same antigens in incomplete Freund&#39;s adjuvant was administered two weeks later. These immunizations were administered subcutaneously at the base of the tail. To boost the immune response at the ocular surface and lacrimal glands, lacrimal gland extract and ovalbumin were injected into the forniceal subconjunctiva and lacrimal glands 6 weeks after the first immunization. The rats developed dry eye features, including reduced tear production, decreased tear stability, and increased corneal damage. Immune profiling by flow cytometry showed a preponderance of CD3+ effector memory T cells in the eyeball.

This report describes a method to induce chronic experimental autoimmune dry eye in Lewis rats through immunization with an emulsion of rat lacrimal gland extract, ovalbumin, and complete Freund's adjuvant, followed by the injection of lacrimal gland extract and ovalbumin into the forniceal subconjunctiva and lacrimal glands six weeks later.

Un modelo de rata ocular seca autoinmune crónica con aumento de células T de memoria efector en tejido de globo ocular

Dry eye disease is a very common condition that causes morbidity and healthcare burden and decreases the quality of life. There is a need for a suitable ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Aislamiento de Salmonella typhimurium-que contienen fagosomas de los macrófagos

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model offers accessibility to rare populations of antigen-specific T-cells representative of the cellular memory response as well as the cytokine microenvironment in situ.
This report describes the practical procedure of a cutaneous recall, an SB induction, and a harvest of antigen-specific T-cells. To exemplify the method, the tuberculin skin test is used for antigenic recall in individuals who, prior to this study, underwent a Bacillus Calmette-Gu&#233;rin vaccination against an infection with Mycobacterium tuberculosis. Finally, examples of multiplex and flow cytometric analyses of SB specimens are provided, illustrating high fractions of antigen-specific polyfunctional CD4+ T-cells available by this sampling method compared with cells isolated from the blood.
The method described here is safe and minimally invasive, provides a unique opportunity to study both innate and adaptive immune responses in vivo, and may be beneficial to a broad community of researchers working with cell-mediated immunity and human memory responses, in the context of vaccine development.

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Here, we provide a demonstration of the suction blister cutaneous recall model. The model allows a simple access to study human in vivo adaptive immune responses, for instance in the context of vaccine development.

Un protocolo de aspiración de la ampolla para estudiar células de T humanas recordar respuestas en Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...