Este trabajo fue financiado por el Wellcome Trust a través de subvenciones a la APM [076566/Z/05/Z], JCK [074.318] y un premio principal del Centro Wellcome Trust de Genética Humana [075491/Z/04].

1) Cultivos Celulares <ol><li> Seleccione los tipos de células que expresan el gen de interés. </li><li> Seleccione las líneas celulares heterocigotos tanto para las variantes de riesgo y el polimorfismo de ADN transcrito de codificación en el gen de interés (Figura 1). </li><li> La cultura de la líneas de células seleccionadas de acuerdo a las especificaciones del proveedor y preparar 2 x 10 cm placas de Petri para la extracción de ADN y ARN, respectivamente. </li><li> Cuando las células alcanzan el 80% de confluencia de iniciar el procedimiento para las células cosechas y aislar el ADN y el ARN o bien siguiendo el procedimiento descrito a continuación o utilizando los kits disponibles en el mercado. </li></ol> 2) Extracción de ADN <ol><li> Retire el medio del plato, lavar con PBS y añadir a la cazuela 500 l de una solución de lisis (0,6% SDS, 100 mM NaCl, 50 mM Tris, 20 mM EDTA y 50 mg / ml RNasa A). </li><li> Roca suavemente la placa durante 20 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Raspe el lisado de células en un tubo de microcentrífuga y se incuba a 37 ° C durante la noche. </li><li> Añadir proteinasa K a una concentración final de 100 mg / ml y se incuba a 37 ° C durante la noche. </li><li> Extraer el ADN con un volumen igual de fenol-cloroformo pH 8, repito, a continuación, extraer con un volumen igual de cloroformo / alcohol isoamílico. </li><li> Precipitar el ADN con 1 / 10 del volumen 3 M NaCl y 2,5 volúmenes de etanol al 100%. </li><li> Dejar en hielo durante 5 minutos y luego girar a 13.000 rpm durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Lavar el ADN con etanol al 70%, permiten secar al aire y volver a suspender en 200 l de TE. </li><li> Se incuba a 65 ° C durante 10 minutos y luego se van por 2 días a temperatura ambiente. </li><li> Almacenar a 4 ° C o largo plazo a -20 ° C. </li></ol> 3) La extracción de RNA <ol><li> Retire el medio del plato, lavar con PBS, se añade 1 ml de Trizol y se incuba durante 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Raspar las células, una pipeta de transferencia de un par de veces, en un tubo de microcentrífuga y se incuba durante 5 min. </li><li> Girar durante 10 minutos a 10.000 rpm a 4 ° C. </li><li> Transferir el sobrenadante en un tubo nuevo y añadir 200 l de cloroformo. </li><li> Agitar y girar durante 10 minutos a 10.000 rpm a 4 ° C. </li><li> Pasar la fase acuosa en un tubo nuevo y añadir un volumen igual de etanol al 70%. </li><li> Cargue la solución a 1 ó 2 (dependiendo del volumen) y la columna RNeasy spin durante 30 segundos a velocidad máxima. </li><li> A partir de aquí siga las instrucciones del kit RNeasy (Qiagen). </li></ol> 4) Preparación de muestras de ácidos nucleicos <ol><li> Cuantificar el ADN y la concentración de ARN utilizando un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific). </li><li> Preparar cDNA a partir de 500-1000 ng de ARN utilizando decámeros azar y superíndice III de la transcriptasa inversa (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li></ol> 5) Ensayo de PCR y la extensión de los iniciadores <ol><li> Diseño de dos pares de cebadores de PCR para cada uno de los marcadores de ADN, un par de amplificación de ADN genómico y el otro par para la amplificación de cDNA (Fig. 2). Lugar de avance y retroceso de imprimación para la amplificación de cDNA en diferentes exones para evitar la contaminación genómica. Diseño de la cartilla para obtener un producto de PCR en el rango de 100-500 pb de longitud. </li><li> Prepare una reacción de 10 l PCR incluyendo 0,5 U Taq Immolase (Bioline) 0,8 mM dNTPs, 2 mM MgCl 2, 0,2 M de cada cebador y 20 ng de cualquiera de cDNA o DNA. Amplificar cada muestra en cuatro reacciones independientes. </li><li> Ejecutar la reacción de PCR en las condiciones optimizadas para cada primer par mantener el número de ciclo en la fase lineal de amplificación. </li><li> Eliminar cebador de PCR y el exceso de dNTPs incubando el producto de PCR con exonucleasa I y fosfatasa alcalina del camarón (SAP) a 37 ° C durante 20 minutos. </li><li> Lugar de cada producto de PCR dos veces en una placa de 384 pozos, de manera que las mediciones de 8 estará disponible para cada muestra. </li><li> Diseño de la cartilla de extensión con el diseño del ensayo (Sequenom) de software para que el mismo cebador se puede utilizar para los productos de PCR tanto genómico y cDNA. Especificar la duración de imprimación en el rango de 14 a 18 pb y la mezcla de extensión, incluyendo las combinaciones de 3ddNTPs (Fig. 2). </li><li> Llevar a cabo la reacción de extensión del cebador y el análisis MALDI-TOF/MS utilizando el sistema de MassARRAY (Sequenom) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Una reacción de extensión del cebador típicos son un paso inicial a 94 ° C durante 2 minutos, seguido por 40 ciclos de 94 ° C durante 5 s, 52 ° C durante 5 s, y 72 ° C durante 5 s. </li><li> Los productos de extensión del cebador se limpian con resina SpectroCLEAN y se transfirió a los microarrays (chips) por SpectroPOINT dispensador nanolitre. </li><li> Los oligonucleótidos extendidas son cuantificados por MALDI-TOF utilizando un espectrómetro de masas SpectroREADER. </li></ol> 6) Análisis estadístico <ol><li> Comprobar los resultados con el software MALDI-TOF/MS Typer MassARRAY de la calidad general de la prueba. </li><li> Extracto del informe Allelotyping que incluye los datos del área del pico. </li><li> Para cada individuo calcular el espectro derelación entre el área del pico del alelo 1 y alelo 2 (relación de área de pico). </li><li> Para cada muestra de cDNA derivar un área promedio de relación de pico y la desviación estándar, usando la función correspondiente en Excel, a través de los 8 mediciones. </li><li> Derivar la misma proporción media del área del pico a través de los 8 Medicion de ADN genómico. </li><li> Divida la proporción media de ADNc por la relación genómica significa para evaluar la desviación a la espera una proporción de 1:1. </li></ol> 7) Control Experimental <ol><li> Para descartar artefactos experimentales, repetir el experimento por lo menos tres veces. </li><li> Siempre que sea posible, los ensayos de diseño de marcadores de ADN adicional. </li><li> Diseño de múltiples pares de cebadores de PCR y cebadores de extensión de líneas de recocido hacia adelante y hacia atrás. </li><li> Siempre que sea posible prueba como negativos los controles de líneas celulares que son heterocigotos para los marcadores de ADN, pero no llevan el ADN de variantes de riesgo asociados con el fenotipo (Fig. 1 y Fig. 3). </li></ol> 8) Los resultados representativos Un ejemplo de alelo específico de análisis de la expresión se muestra en la Figura 3 con ejemplos de trazas de espectrometría de masas. La figura muestra los resultados del análisis de cuatro alelo-específicas de los productos de extensión del cebador llevó a cabo el 4 de diferentes plantillas. Los gráficos de arriba representan los resultados obtenidos del análisis de ADN genómico de dos líneas celulares diferentes, que son heterocigotos para un polimorfismo transcrito de codificación. Sin embargo, sólo una línea celular es heterocigota para la variante de ADN de riesgo (Figura 1). Las gráficas inferiores representan los resultados obtenidos del análisis de la cDNA generada a partir de las mismas líneas celulares. Como resultado de artefacto experimental el primer pico es siempre mayor que el segundo pico, incluso en el análisis genómico. Por lo tanto, los resultados de los análisis genómico se utilizan para normalizar los datos de cDNA. Después de la normalización, la proporción de alelos es significativamente diferente de 1 en la línea celular A (donde aparece el segundo pico más bajo en comparación con los espectros de otros), mientras que es muy cercano a 1 en la línea celular B. Los datos sugieren que la línea celular A lleva a bordo un variante de ADN, en fase con el alelo medido por el segundo pico, lo que reduce la expresión del gen analizado. Línea de células B ofrece un control negativo muy conveniente. <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. La línea celular estrategia de selección. Las líneas celulares A y B son heterocigotos para un marcador transcrito de codificación (triángulo), pero sólo una línea celular es heterocigota para la variante de riesgo del ADN (círculo). El alelo azul de la variante de riesgo está asociado (ya sea con un efecto directo o porque en estrecha correlación con la variante funcional actual) con un menor nivel de la transcripción. <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Alelo específico de ensayo de extensión del cebador. Esta figura muestra el flujo de trabajo del procedimiento experimental realizado para los dos ADNc (izquierda) y genómica (derecha) plantillas. PCR (rectángulos grises) están diseñados para amplificar un polimorfismo heterocigota de codificación (triángulo). Para evitar la contaminación genómica PCR primers recocido secuencias colocados en diferentes exones (barras azules) cuando la amplificación se lleva a cabo en la plantilla de cDNA. El producto de PCR se utiliza como plantilla para una reacción de extensión del cebador llevado a cabo con una cartilla de extensión, recocido una base junto al polimorfismo, y la combinación adecuada de tres didesoxinucleótidos (ddNTPs) terminadores (cuadrados) y una desoxinucleótidos (círculo) se extienden a la imprimación de una o dos bases, respectivamente. Los productos resultantes de imprimación extensión tienen masas diferentes, que permiten la separación y cuantificación por espectrometría de masa MALDI-TOF. La cantidad de producto correspondiente al alelo azul del marcador de ADN es relativamente menor que el alelo rojo. <img src="/files/ftp_upload/2279/2279fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Los resultados de un alelo específico de ensayo de expresión. La figura muestra los resultados de la espectrometría de masas a partir del análisis llevado a cabo en el ADN genómico y el cDNA de la línea celular A y la línea de células B (Figura 1).

<ol>
	<li>Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+complex+disease+traits+with+global+gene+expression.">Mapping complex disease traits with global gene expression.</a> Nat Rev Genet. 10, 184-194 (2009).</li><li>Singer-Sam, J., LeBon, J. M., Dai, A., Riggs, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive,+quantitative+assay+for+measurement+of+allele-specific+transcripts+differing+by+a+single+nucleotide.">A sensitive, quantitative assay for measurement of allele-specific transcripts differing by a single nucleotide.</a> PCR Methods Appl. 1, 160-163 (1992).</li><li>Yan, H., Yuan, W., Velculescu, V. E., Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allelic+variation+in+human+gene+expression.">Allelic variation in human gene expression.</a> Science. 297, 1143-11 (2002).</li><li>Ding, C., Cantor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+gene+expression+analysis+technique+using+competitive+PCR+and+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+MS.">A high-throughput gene expression analysis technique using competitive PCR and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight MS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 3059-3064 (2003).</li><li>Gabriel, S., Ziaugra, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNP+genotyping+using+Sequenom+MassARRAY+7K+platform.">SNP genotyping using Sequenom MassARRAY 7K platform.</a> Curr Protoc Hum Genet Chapter. Chapter 2 (Unit 2), 12-12 (2004).</li><li>Lo, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allelic+variation+in+gene+expression+is+common+in+the+human+genome.">Allelic variation in gene expression is common in the human genome.</a> Genome Res. 13 (8), 1855-1862 (2003).</li><li>Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression-based+discovery+of+variation+in+the+human+glutathione+S-transferase+M3+promoter+and+functional+analysis+in+a+glioma+cell+line+using+allele-specific+chromatin+immunoprecipitation.">Expression-based discovery of variation in the human glutathione S-transferase M3 promoter and functional analysis in a glioma cell line using allele-specific chromatin immunoprecipitation.</a> Cancer Res. 65, 99-104 (2005).</li><li>Knight, J. C., Keating, B. J., Rockett, K. A., Kwiatkowski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+regulatory+polymorphisms+by+allele-specific+quantification+of+RNA+polymerase+loading.">In vivo characterization of regulatory polymorphisms by allele-specific quantification of RNA polymerase loading.</a> Nat Genet. 33 (4), 469-475 (2003).</li><li>Pastinen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+genetic+and+epigenetic+variation+affecting+human+gene+expression.">A survey of genetic and epigenetic variation affecting human gene expression.</a> Physiol Genomics. 16 (2), 184-193 (2004).</li><li>Francks, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+77-kilobase+region+of+chromosome+6p22.2+is+associated+with+dyslexia+in+families+from+the+United+Kingdom+and+from+the+United+States.">A 77-kilobase region of chromosome 6p22.2 is associated with dyslexia in families from the United Kingdom and from the United States.</a> Am J Hum Genet. 75 (6), 1046-1058 (2004).</li><li>Paracchini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromosome+6p22+haplotype+associated+with+dyslexia+reduces+the+expression+of+KIAA0319,+a+novel+gene+involved+in+neuronal+migration.">The chromosome 6p22 haplotype associated with dyslexia reduces the expression of KIAA0319, a novel gene involved in neuronal migration.</a> Hum Mol Genet. 15 (10), 1659-1666 (2006).</li></ol>

Este método permite la evaluación del efecto de las enfermedades asociadas a las variantes de ADN en la expresión génica mediante la evaluación en el alelo-específicas vivo diferencia en el nivel de transcripción. En este protocolo la abundancia de transcripción relativa se mide por MALDI-TOF, pero otras tecnologías que permite la cuantificación alelo-específicas, tales como TaqMan 6,7, se puede utilizar. La principal limitación de este enfoque es la disponibilidad de transcribir los marcadores de codificación. Los métodos basados ​​en el principio descrito aquí, pero aprovechando las diferentes clases de polimorfismos, se han descrito. El ensayo haploChip medidas alelo específico de expresión utilizando los marcadores situados en 1 kb del inicio de la transcripción o en el sitio final de un gen que estaría presente en el material de la cromatina immunoprecipitated aisladas con anticuerpos específicos para la ARN polimerasa II 8. Por otra parte, SNPs intrónicas se puede utilizar cuando la plantilla es heteronuclear ARN 9. El protocolo específico descrito aquí, en combinación con el ensayo haploChip, se ha utilizado con éxito para identificar un gen candidato para la dislexia (o discapacidad de lectura). Inicialmente, un estudio de asociación genética identifica una secuencia de ADN asociados a la dislexia y que abarca tres genes 10. El alelo-específicas de ensayo de la expresión de genes mostró que en la presencia de la dislexia asociada a la variación de expresión de ADN variantes se observó en sólo uno de los tres genes, pero no los otros dos 11.

<table border="1">
	<thead>
		<tr>
			<th>Material Name</th>
			<th>Type</th>
			<th>Company</th>
			<th>Catalogue Number</th>
			<th>Comment</th>
		</tr>
	</thead>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-4417-100TAB</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0416</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27788.366</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2308-500MG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol: chloroform</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>77617</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100777C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32221-2.5L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immolase Taq</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21048</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DNTP100A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exonuclease 1</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0293S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shrimp Alkaline Phosphatase</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>E70092Z</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroCLEAN resin</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sequenom</td>
			<td>10053</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassEXTEND ddNTP/dNTP mix </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sequenom</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Varies according to assay design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassEXTEND thermosequenase </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sequenom</td>
			<td>10052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chilled microcentrifuge</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroPOINT nanolitre dispenser</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sequenom</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroREADER mass spectrometer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Sequenom</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an allele-specific gene expression assay to test the functional basis of genetic associations

El número de importantes asociaciones genéticas con rasgos comunes complejo está en constante aumento. Sin embargo, la mayoría de estas asociaciones no se han entendido a nivel molecular. Uno de los mecanismos que median el efecto de las variantes de ADN en los fenotipos es la expresión de genes, que ha demostrado ser particularmente relevante para los rasgos complejos 1. Este método de análisis en un contexto celular el efecto de las secuencias específicas de ADN sobre la expresión génica. El principio consiste en medir la abundancia relativa de las transcripciones resultantes de los dos alelos de un gen, el análisis de las células que llevan una copia de las secuencias de ADN asociadas con la enfermedad (las variantes de riesgo) 2,3. Por lo tanto, las células utilizan para este método debe cumplir dos requisitos fundamentales genotípica: tienen que ser heterocigotos para ambas variantes de riesgo del ADN y los marcadores de ADN, los polimorfismos general de codificación, que puede distinguir las transcripciones en base a su origen cromosómico (Figura 1). Variantes de ADN de riesgo y marcadores de ADN no es necesario que la frecuencia del alelo mismo, pero la fase (haplotípica) relación de los marcadores genéticos tiene que ser entendido. También es importante elegir los tipos de células que expresan el gen de interés. Este protocolo se refiere específicamente al procedimiento adoptado para extraer los ácidos nucleicos a partir de fibroblastos, pero el método es igualmente aplicable a otros tipos de células incluyendo las células primarias. ADN y el ARN se extraen de las líneas celulares seleccionadas y cDNA se genera. ADN y el cDNA se analizan con un ensayo de extensión del cebador, diseñado para los marcadores de ADN que codifica 4. El ensayo de extensión del cebador se lleva a cabo utilizando el MassARRAY (Sequenom) 5 plataforma de acuerdo a las especificaciones del fabricante. Productos de extensión del cebador son analizadas por láser asistida por matriz de desorción / ionización tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF/MS). Debido a que los marcadores seleccionados son heterocigotos que va a generar dos picos en los perfiles. El área de cada pico es proporcional a la abundancia de transcripción y se puede medir con una función del software Typer MassARRAY para generar una relación de alelos (alelo 1: alelo 2) Cálculo. La relación alélica obtenida para cDNA se normaliza el uso que se mide a partir del ADN genómico, donde se espera que la proporción de alelos de 1:1 para corregir los artefactos técnicos. Marcadores con una relación normalizada alélicas significativamente diferentes a 1 indican que la cantidad de transcripción generada a partir de los dos cromosomas de la célula misma es diferente, lo que sugiere que las variantes de ADN asociados con el fenotipo de tener un efecto sobre la expresión génica. Controles experimentales se debe utilizar para confirmar los resultados.

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An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

Asociaciones genéticas con frecuencia permanecen sin explicación a un nivel funcional. Este método tiene como objetivo evaluar el efecto del fenotipo asociado a los marcadores genéticos en la expresión génica mediante el análisis de las células heterocigotos para SNPs transcrito. La tecnología permite la medición precisa de MALDI-TOF espectrometría de masas para cuantificar alelo-específicas de los productos de extensión del cebador.

Un alelo-específicas Gene ensayo de expresión para probar la base funcional de las asociaciones genéticas

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

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Research

JoVE Journal

Biology

22.8K vistas.  University of Oxford. Asociaciones genéticas con frecuencia permanecen sin explicación a un nivel funcional. Este método tiene como objetivo evaluar el efecto del fenotipo asociado a los marcadores genéticos en la expresión génica mediante el análisis de las células heterocigotos para SNPs transcrito. La tecnología permite la medición precisa de MALDI-TOF espectrometría de masas para cuantificar alelo-específicas de los productos de extensión del cebador.

Video: An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

Light/dark Transition Test for Mice

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, however, can be used to delete or manipulate a specific gene in mice. The influence of a given gene on a specific behavior can then be determined by conducting behavioral analyses of the mutant mice. As a test for behavioral phenotyping of mutant mice, the light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. The test is based on the natural aversion of mice to brightly illuminated areas and on their spontaneous exploratory behavior in novel environments. The test is sensitive to anxiolytic drug treatment. The apparatus consists of a dark chamber and a brightly illuminated chamber. Mice are allowed to move freely between the two chambers. The number of entries into the bright chamber and the duration of time spent there are indices of bright-space anxiety in mice. To obtain phenotyping results of a strain of mutant mice that can be readily reproduced and compared with those of other mutants, the behavioral test methods should be as identical as possible between laboratories. The procedural differences that exist between laboratories, however, make it difficult to replicate or compare the results among laboratories. Here, we present our protocol for the light/dark transition test as a movie so that the details of the protocol can be demonstrated. In our laboratory, we have assessed more than 60 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. Those data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.

Visualization of the protocol will facilitate understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used across laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test.

The light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie that shows detailed procedures on how we conduct the test.

Luz / oscuridad de transición de prueba para ratones

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Investigación

Biología

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparación de cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina por electroporación

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

Ensayo de inducción neural en el embrión de pollo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

La médula espinal de Electrofisiología

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilizando el sistema de electroporación Gene Emisores MXcell para transfectar células primarias con alta eficiencia

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

El uso de un contador de células automatizado para simplificar estudios de expresión génica: siRNA Derribo de IL-4 la expresión génica en células dependientes Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

Un enfoque de genética inversa para probar la redundancia funcional durante la embriogénesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Las secciones incluidas en parafina y congeladas de Drosophila Los músculos de Adultos

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

En la reconstitución in vitro de los activos T. castaneum telomerasa

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

Los ensayos farmacológicos y genéticos funcionales para manipular la regeneración de la planaria Japonica Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...