Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la trombosis y la hemostasia identificando sujetos más susceptibles a los procesos aterotrombóticos en particular los pacientes de alto riesgo tratados con aspirina. La principal ventaja de esta técnica es que es barata, fácil de usar, conveniente, tiene una alta eficiencia y permite una rápida identificación de los polimorfismos C924T. Aunque este método puede proporcionar información sobre el campo de la aterotrombosis, también se puede aplicar a otros sistemas como polimorfismos que implican medicina personalizada o medicamentos específicos con el fin de entender la respuesta farmacológica individual.
Demostrando el procedimiento estará el Doctor Sebastiano Ursi, un técnico de nuestro laboratorio. Para preparar el tampón Tris EDTA a pH 8.0, agregue 200 microlitros de 0,5 molares EDTA y un mililitro de un cloruro molar Tris en un vaso de precipitados, luego ajuste el volumen a 100 mililitros con agua estéril y guárdelo a temperatura ambiente. A continuación, prepare un litro de solución de material 10X de tampón de electroforesis añadiendo todos los reactivos y, a continuación, almacene el búfer a temperatura ambiente.
A continuación, prepare el tinte de carga de gel añadiendo todos los reactivos y luego lleve el volumen a 100 mililitros con agua estéril. Una vez preparado, guarde el tinte a cuatro grados centígrados durante unos meses. Agregue 450 mililitros de agua a 50 mililitros de tampón 10X TBE para preparar una solución de tampón 1X TBE.
Añadir cuatro gramos de agarosa en 200 mililitros de tampón 1X TBE juntos en un vaso de precipitados de 600 mililitros para preparar 200 mililitros de 2% de gel de agarosa. El gel de agarosa solidificado almacenado a temperatura ambiente se puede disolver en un baño de agua hirviendo a 60 grados durante 15 a 20 minutos o en un horno microondas durante 35 minutos añadiendo un pequeño volumen de agua para compensar el aumento de la concentración de agarosa. Siga revolviendo el vaso de precipitados en un mezclador magnético durante aproximadamente cinco minutos hasta que la agarosa se suspenda y luego caliente la agarosa en una placa caliente durante unos 10 minutos o en un horno microondas durante tres minutos para que se disuelva por completo.
Después de la purificación del ADN, mezcle suavemente las muestras de ADN frescas pipeteando tubos varias veces. Es obligatorio obtener de 10 a 50 nanogramos de una plantilla de ADN de buena calidad extraída de muestras humanas. Por esta razón, preferimos utilizar una purificación automática de ADN en lugar de una semiautomática o manual.
Para comenzar la purificación, primero cuantificar y calcular la pureza del ADN midiendo los absorbentes en 260, 280 y 320 nanómetros, luego diluir las muestras utilizando agua estéril. A continuación, calibrar el espectrofotómetro. Para constituir la reacción PCR, añada todos los reactivos para preparar 25 microlitros de mezcla maestra de PCR en un tubo de microamplificación de 0,2 mililitros.
A continuación, coloque los tubos de PCR en un termociclador automatizado y amplificar las muestras de ADN purificado. Una vez que el programa termina, detener la reacción dejando los tubos a cuatro grados Centígrados. Añadir 10X tampón enzimático cinco unidades por enzima de restricción de microlitro en el agua libre del ADN a un volumen de 22,5 microlitros.
A continuación, agregue 2,5 microlitros de producto PCR a un nuevo tubo de PCR y luego agregue los 22,5 microlitros de la mezcla de digestión de restricción al producto PCR. Incubar la mezcla maestra de digestión de restricción de producto PCR a 37 grados Celsius durante cuatro horas, luego añadir 0,5 microgramos por mililitro de bromuro de etidio para manchar el gel durante 10 minutos. Vierta el gel en la bandeja de gel con el peine de pozo en su lugar para que el gel se solidifique.
Ahora vierta la caja de gel con 1X TBE tampón hasta que el gel esté cubierto. Utilice puntas finas para cargar seis microlitros del ADN digerido amplificado en los pozos formados en el gel, luego agregue un marcador de ADN también en un espacio separado paralelo a la muestra. A continuación, encienda la unidad de electroforesis.
Con el fin de identificar el polimorfismo genético C924T en el gen TBXA2R, se realiza un análisis RFLP. En el gel, muestra dos bandas a 395 y 144 pares de bases para la versión de tipo salvaje del alelo mayor, mientras que una sola banda en 539 pares base para la versión mutante del alelo menor se ve indicando que no se corta por la enzima de restricción. Curiosamente, tres bandas en 395, 144 y 539 pares base están presentes para el alelo heterocigoto.
A continuación, el polimorfismo C924T se confirma mediante el análisis de secuencia. La secuencia resaltada representa el polimorfismo. Una vez masterada, esta técnica se puede hacer en unas ocho horas si se realiza correctamente.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar que este método solo se puede usar para un pequeño número de recortes y para algunas muestras en una sesión de trabajo. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el análisis de recortes con el fin de responder a preguntas adicionales como la importancia de otras vías que implican procesos aterotrombóticos. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología molecular exploraran las variaciones genéticas sobresalientes en este desarrollo y progresión inicial.
Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo evaluar el genotipo del receptor Thromboxane A2 con respecto al polimorfismo C924T utilizando el análisis de electroforesis de gel de las muestras PCR-RFLP. No olvide que trabajar con bromuro de etidio y fuentes de luz UV puede ser extremadamente peligroso y las precauciones tales como guantes, gafas de seguridad, o una máscara facial y otros dispositivos de protección siempre deben tomarse durante el realización de este procedimiento.
