La investigación de una población más grande viene con una variación impulsada por máquinas, que por esto la variación real se origina en la diversidad natural. Aquí demostramos un método para reducir la variación técnica para el análisis de integración aguas abajo. Las ventajas de esta técnica incluyen una extracción basada en la separación de rostros, proporcionando el análisis de varios metabolitos en la plataforma analítica respectiva, al tiempo que elimina el error sistémico y mantiene la varianza biológica.
Una vez obtenida la información genotípica y fenotípica, este método se puede aplicar a cualquier población natural diversa en cualquier reino de la vida. Para comenzar a tomar tubos de cosecha de 20 mililitros, agregue dos perlas de metal de cinco milímetros y dos de ocho milímetros de diámetro para homogeneizar y etiquetar los tubos. Luego, llene un dewar con nitrógeno líquido, inmediatamente después de cortar, coseche muestras de hojas y tejidos radiculares frescos en nitrógeno líquido mediante congelación instantánea.
Almacene las muestras biológicas cosechadas a 80 grados centígrados para su posterior procesamiento. Preenfríe los soportes de tubos en nitrógeno líquido. A continuación, muele los tejidos a 25 hercios durante un minuto para obtener un polvo homogéneo.
Repita la congelación y la molienda si el tejido no está molido homogéneamente. Pesar 50 miligramos de material vegetal fresco en tubos de microcentrífuga de bloqueo seguro de dos milímetros preenfriados que garantizan que el material vegetal permanezca congelado durante el proceso de pesaje. Agregue un mililitro de mezcla de extracción preenfriada de 1 a 50 miligramos de alícuota de la muestra y vórtice el tubo brevemente antes de mantenerlo en hielo.
Incubar las muestras en un agitador orbital a 800 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, seguido de sonicación en un baño de sonicación refrigerado por hielo durante 10 minutos. Use una pipeta multicanal para agregar 500 microlitros de mezcla de extracción también a las muestras y mezcle los extractos mediante un breve vórtice, luego centrífique la mezcla a 11, 200 veces G durante 5 minutos a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, transfiera 500 microlitros de la fase superior separada que contiene lípidos a un tubo de microcentrífuga de bloqueo seguro de 1,5 mililitros premarcado, elimine el resto de la fase superior.
En tubos de microcentrífuga de bloqueo seguro de 1,5 mililitros transfieren 150 microlitros de la fase semipolar inferior cuatro GCMS y 300 microlitros del análisis semipolar de fase cuatro U-H-P-L-C MS. Utilice un concentrador de vacío para la evaporación del disolvente para concentrar todas las fracciones extraídas sin calentar y almacenar las fracciones secas a 20 grados centígrados. Para preparar la muestra para un rendimiento ultra alto, la cromatografía líquida, la espectrometría de masas o H-P-L-C MS vuelven a suspender las fracciones semipolares secas en 180 microlitros de una mezcla de metanol y agua.
Luego sonicar la fase semipolar durante 2 minutos, seguida de centrifugación a 11, 200 veces G durante un minuto. Después de la centrifugación, transfiera 90 microlitros del sobrenadante a un vial de vidrio e inyecte dos microlitros de los extractos en la muestra LCMS vertida. Realizar el fraccionamiento de metabolitos sobre una columna invertida de Fase C18 mantenida a 40 grados centígrados, y un caudal de 400 microlitros por minuto con cambios graduales de efluente A y B, adquirir los espectros de masas de la prueba en blanco y muestras de control de calidad en modo de ionización negativa con un rango de masa de 102 1500 relación masa/carga.
Para las muestras de metabolitos semipolares, ejecute una muestra de control de calidad agrupada en espectrometría de masas en tándem dependiente de datos en modos de ionización negativa y positiva. Utilice los espectros de masas obtenidos para la anotación. Realice la normalización del conjunto de datos comprobando la distribución del estándar interno.
Normalice los datos corrigiendo la señal de estándares internos únicos o múltiples. A continuación, corrija las intensidades máximas obtenidas del cromatograma sobre el peso exacto de la muestra. Para corregir la deriva de intensidad a través de series de lotes múltiples, realice métodos de corrección basados en el control de calidad, como el suavizado de diagramas de dispersión estimado localmente utilizando R.Antes de realizar estudios de asociación de todo el genoma o GWAS, filtre los datos genotípicos para frecuencias de alelos menores inferiores al 5% y una tasa faltante de más del 10% utilizando borlas.
Esto evitará el sesgo de baja frecuencia. Para eliminar el sesgo originado por los factores ambientales, utilice el paquete R LME cuatro y calcule las mejores predicciones o blops lineales e imparciales para cada característica normalizada sobre las repeticiones experimentales. Use blops de cada característica individualmente para realizar GWAS con el paquete rMVP en R.Los datos lipidómicos de varias especies de frijoles comunes se muestran en función de los cromatogramas de pico de base cruda de dos muestras de control de calidad de diferentes lotes.
Se observó una variación en las intensidades de la señal para ciertas clases de lípidos. El error sistémico fue más evidente cuando se realizó el análisis del componente principal sobre los datos brutos. El procedimiento de normalización, incluido el suavizado de diagramas de dispersión estimado localmente, condujo a la agrupación de las muestras de control de calidad.
Al diseccionar en los grupos individuales, los errores impulsados por la máquina en los lotes siete y ocho se hicieron evidentes antes de la normalización, que se corrigió. Los grupos metabolómicos individuales postnorados y transformados se utilizaron para GWAS, dando lugar a varias asociaciones de marcadores de rasgos. En el análisis representativo, las diferentes clases de compuestos se resaltan en diferentes colores, mientras que los marcadores asociados con múltiples clases de compuestos se indican con su gen más cercano.
La normalización y transformación de datos es uno de los pasos más importantes. Asegúrese de que se ha realizado la corrección adecuada para corregir el error sistémico y garantizar la normalidad en la distribución. Al realizar la corrección de la variación analítica, se pueden realizar varios enfoques de integración, como el análisis de correlación metabólica y la integración en datos fenómicos para arrojar luz sobre rasgos complejos.
