Con el apoyo de la Universidad de Kentucky, Departamento de Biología de la Oficina de Estudios de Grado y la Facultad de Artes y Ciencias.

1. Introducción La visión de conjunto más reciente del intestino grueso cangrejo de río se ha cumplido en una disertación de la Dra. Barbara E. Musolf (2007, Universidad Estatal de Georgia, Atlanta, Georgia, EE.UU.), que se centró principalmente en la modulación serotoninérgica y la inervación (Musolf et al., 2009 ). Hindguts crustáceos se estudió por primera vez hace 100 años por Alexandrowicz, un pionero en anatomía comparada (Alexandrowicz, 1909), que describe los diversos aspectos de su inervación. La investigación continuó con los años, la identificación de los tipos de capas de músculo y de la arquitectura, dirigiéndose a la función general del intestino grueso en la osmorregulación de todo el animal, y el examen de control modulador de la contractilidad del intestino grueso por varios compuestos (ver la revisión de Musolf, 2007). Es interesante notar que la parte anal del intestino grueso sirve no sólo para expulsar las heces, sino también para tomar el agua del ambiente para la osmorregulación. Esta región del intestino puede sufrir directa o inversa peristalsis en función de las necesidades del animal. Alexandrowicz (1909) identificó dos plexos nerviosos que inervan el intestino grueso crustáceos, una interior y otra exterior del plexo plexo, que más tarde resultó ser una rica fuente para la identificación y caracterización de los neurotransmisores. En la década de 1950 Florey Dr. Ernst comenzó una serie de estudios farmacológicos en el intestino grueso cangrejo de río y ha demostrado que las contracciones son moduladas por la acetilcolina y sus compuestos relacionados, y también por la epinefrina y la norepinefrina (Florey, 1954). Florey, el descubridor de una sustancia inhibidora conocida como &quot;Factor-I&quot;, estudió los efectos de esta sustancia en diversas preparaciones, incluyendo el sistema gastrointestinal en cangrejos de río (Florey, 1961). Factor que más tarde se demostró que GABA. Por lo tanto, el intestino grueso cangrejo juega un papel importante en los primeros estudios de inhibición sináptica. Tras el descubrimiento de GABA, otros transmisores supuesto también demostraron estar asociados con los plexos del intestino grueso y producen respuestas fisiológicas. Transmisores incluyen la dopamina (Elekes et al 1988;. Elofsson et al 1968)., Proctolin (RYLPG-OH;. Mercier et al 1997) dos péptidos orcokinin (NFDEIDRSGFGFN y AFDEIDRSGFGFN; Bungart et al 1994;.. Dircksen et al 2000) , orcomyotropin (FDAFTTGFamide; Dircksen et al 2000). y un péptido myosuppressin (Mercier et al 1997;... pQDLDHVFLRFamide más probable, cf Stemmler et al 2007). Cada una de estas sustancias modula las contracciones espontáneas del intestino grueso, y todos, excepto GABA parece ser excitatorios. El intestino grueso también responde a glutamato y quiscualato (Jones, 1962;. Incorrecto et al 2003), pero la evidencia clara de la inervación glutamatérgica no ha sido reportado. Mensajeros intracelulares que median los efectos de los transmisores de diferentes son en gran parte inexplorado, pero no hay pruebas de la participación de cAMP en la capacidad de la dopamina para aumentar las contracciones (Knotz &amp; Mercier, 1995). Aunque el intestino grueso crustáceos contratos espontáneamente tras la denervación, las contracciones son generalmente débiles y desorganizados (Gales, 1982; Winlow y Laverack, 1972a). Requiere el movimiento peristáltico de salida coordinada del motor del sistema nervioso central, al parecer de origen en el ganglio abdominal anterior (Winlow y Laverack, 1972a, b, c). En cangrejos de río, la salida del motor se realiza a la del intestino grueso a través de la raíz 7 ª abdominal, que contiene 75 axones cuyos cuerpos celulares se localizan en el ganglio abdominal anterior (Kondoh y Hisada, 1986). Por lo menos algunos de los péptidos parecen ser suministrados en el plexo del intestino grueso de las neuronas de origen en el ganglio última abdominal (Dircksen et al 2000;.. Mercier et al, 1991b; Siwicki y Bishop, 1986), pero la dopamina es suministrada por las neuronas de más ganglios anterior (Mercier et al. 1991a). Desde la salida del motor a través de la raíz 7 ª abdominal es necesaria para la contracción general, coordinada, es probable que algunos o todos de los transmisores de supuestos antes mencionados contribuyen de algún modo a la peristalsis. Sus contribuciones relativas, sin embargo, no se conocen. Alguna información puede ser obtenida mediante el estudio de sus efectos sobre los músculos circulares y longitudinales por separado (Mercier &amp; Lee, 2002). Además de controlar el movimiento de los alimentos no digeridos, el plexo nervioso asociado con el intestino grueso crustáceos parece desempeñar una función endocrina importante asociado con la muda. El intestino grueso de los cangrejos, Carcinus maenas, contiene células endocrinas que la liberación de hormonas crustáceos hiperglucemia y su péptido precursor relacionadas durante la ecdisis (Webster et al. 2000), sugiriendo un papel en la absorción de agua y la inflamación asociados con la muda. Por lo tanto, el intestino grueso crustáceo participa en diversos procesos fisiológicos importantes. Este informe es sobre todo una herramienta de enseñanza para la escuela avanzada de secundaria y universitarios en los cursos de fisiología que participan en la experimentación. La importancia, así como el posible mecanismo detrás de la forma de los contratos y las funciones del intestino grueso pueden ser abordadas por los estudiantes. Agentes farmacológicos, los neurotransmisores, neurohormonas y se utilizará, y curvas dosis-respuesta se construirá, que los estudiantes participen en la forma de adquirir e interpretar los datos fisiológicos y farmacológicos. Un conocimiento general de la función del receptor con respecto a los agonistas y antagonistas también se puede lograr. Los estudiantes también aprenderán a presentar los datos en forma gráfica para el análisis estadístico. Es muy fácil de analizar y registrar las contracciones del intestino grueso cangrejo de río. En la preparación disecada, el intestino es fácilmente expuestos a sustancias exógenas. La alteración en la actividad peristáltica se puede controlar visualmente o con un transductor de fuerza, que también puede controlar la fuerza de las contracciones. Debido a su simplicidad y fiabilidad como una preparación bioensayo, el intestino grueso cangrejo de río sigue siendo muy útil para la investigación de muchas preguntas de investigación sobre los mecanismos de la peristalsis, la modulación de la potencia del motor y la contracción muscular y la función del receptor. El intestino grueso es también útil para las pruebas insecticidas, crustaceancides, y los contaminantes de mecanismos específicos de las acciones. 2. Métodos 2.1) Materiales <ul><li> cangrejo de río </li><li> cangrejos salinos </li><li> instrumentos de disección (tijeras grueso y fino, grueso y unas pinzas finas) </li><li> Sylgard de fondo placa de Petri </li><li> disección de acero pines </li><li> vasos (para mantener las soluciones químicas) </li><li> parafina (para la cobertura de soluciones y mezcla) </li></ul> 2.2) La disección <ol><li> Cangrejo de río (Procambarus clarkii) que mide 10.6 cm de longitud del cuerpo debe ser colocado en hielo durante 5 a 10 minutos para anestesiar a los animales antes de la disección comienza. </li><li> Mantener los cangrejos anestesiados por detrás de las garras con una sola mano. Rápidamente, procedente de la cuenca del ojo hasta la mitad de la cabeza a ambos lados, y luego decapitar a los cangrejos de río (Nota: la sangre de la preparación será pegajoso cuando se seca, así que lave las herramientas cuando esté terminado). <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: La decapitación de los cangrejos </li><li> Cortar el quelípedos y las piernas para caminar. </li><li> Cortar el tailfins izquierda y derecha, dejando sólo la aleta caudal medio (uropod). </li><li> En la parte dorsal del cangrejo corte ventral tanto en el lado izquierdo y derecho de la cutícula dorsal. <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: Eliminación de cutícula dorsal </li><li> Cortados transversalmente en la parte dorsal de la cutícula, asegurándose de que el corte es poco profundo para evitar daños a la GI A continuación, retire la parte inferior de la cutícula abdominal dorsal. </li><li> Colocar los cangrejos disecados en un plato Sylgard a ambos lados. </li><li> Pin de la langosta en el plato en la punta de la aleta caudal. Se puede utilizar más patas a cada lado de la GI es necesario para sostener el cuerpo hacia abajo. </li><li> Llenar el recipiente con solución salina cangrejos de río que cubre el GI Asegúrese de apagar continuamente el GI con una solución salina con una pipeta. Solución salina es la solución de una modificación de Van Harreveld (1936), que se hace con 205 mM NaCl, 5,3 mM KCl, 13,5 mM CaCl 2 2H 2 O, 2,45 mM de MgCl 2 6H 2 O, 5 mM HEPES y ajustado a pH 7,4. Los cangrejos de río disecado debe aparecer como se muestra en la Figura 3. <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3: cangrejos disecados intactos con GI. </li></ol> 2.3) Los experimentos 2.3.1) Las contracciones en el animal <ol><li> Con soluciones del compuesto a analizar listo y en la misma temperatura que la solución salina de baño. Podría utilizar en las soluciones individuales de la serotonina (100 nM, 1microM), el glutamato (1microM) y dopamina (1microM) hizo en solución salina cangrejos de río como sustancias de partida para ser probado. </li><li> Permita que los cangrejos disecados para sentarse en la solución de cangrejos de río durante unos diez minutos para permitir que se ajuste a la conmoción de la disección y exposición de solución salina. Las contracciones de peristaltismo lento el intestino grueso que comienzan a ocurrir. </li><li> Una vez que comiencen las contracciones, anote el número de contracciones que se producen en treinta segundos (tenga en cuenta el tipo de contracciones que se producen: el tipo es decir, el peristaltismo, o espástica, y la dirección de cualquier ondas peristálticas). Tabla 1: Las contracciones en el cangrejo de río Saline <table border="1"><tbody><tr><td> Número de contracciones </td><td> Tipo de contracciones </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table></li><li> El uso de un piPette, eliminar la solución salina dentro de la cavidad del abdomen descubierto el cangrejo de río, y aplicar solución salina que contiene la sustancia a examinar directamente en el intestino grueso. </li><li> Inmediatamente después de la adición de la solución, registrar el número de contracciones que se producen después de treinta segundos y anotar el tipo de contracciones que se producen (es decir, peristálticas, o espástica). Tabla 2: Las contracciones con la exposición a compuestos <table border="1"><tbody><tr><td> Compuesto ensayado </td><td> Concentración </td><td> Número de contracciones </td><td> Tipo de contracciones </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table></li><li> Inmediatamente después de grabar la respuesta a la sustancia, enjuagar varias veces con solución salina GI cangrejo normal. Deje que la preparación reposar por 5 minutos, mientras se lava cada 30 segundos con una solución salina cangrejos de río. </li><li> Con una pipeta, colocar algunos salina que contiene el compuesto junto a examinar o una concentración de la sustancia variada última prueba directamente en el intestino grueso. Lo mejor es comenzar con una menor concentración y una forma de trabajo a altas concentraciones. </li><li> Inmediatamente después de añadir cada nueva sustancia o cada nueva concentración, registrar el número de contracciones que se producen después de treinta segundos y anotar el tipo de contracciones. </li></ol> 2.3.2) El registro de las fuerzas de contracción en los preparativos eliminado <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4: Configuración <ol><li> Conecte el transductor a la estación del puente. </li><li> Coloque la cápsula del puente a la 26T PowerLab. </li><li> Conecte el PowerLab 26T al puerto USB del ordenador. </li><li> Abrir LabChart7, haciendo clic en el icono de labchart7 en el escritorio. <ul><li> La caja de LabChart Centro de Bienvenida se abrirá. Cerca de ella. </li><li> Haga clic en Configuración </li><li> Haga clic en configuración de canal. Cambiar el número de canales a 1 (parte inferior izquierda del cuadro) pulse OK. </li><li> En la parte superior izquierda de la tabla del conjunto de ciclos por segundo a cerca de 2k. Establecer los voltios (eje Y) a unos 500 o 200 mV. </li><li> Haga clic en el canal 1 a la derecha del gráfico. Haga clic en la entrada de amplificador. Asegúrese de que la configuración: un solo terminal, junto ac, y se invierte (se invierte la señal si es necesario), y anti-alias, se comprueban. </li><li> Para comenzar a iniciar la grabación de prensa. </li></ul></li><li> Recoger la preparación y corte del tubo digestivo en la unión entre el tórax y el abdomen. A continuación, corte con cuidado alrededor de la parte telson de la cola. Retire el tubo digestivo de los cangrejos disecados y colocarlo en el plato Sylgard. No es un vaso sanguíneo que corre a lo largo de la cara dorsal del tracto gastrointestinal. Tire con cuidado esta distancia desde el tracto gastrointestinal. Vierta la solución salina cangrejos frescos en la preparación. </li><li> Coloque el transductor de fuerza en la pinza de cangrejo de río cerca de la disección. </li><li> Enganche el transductor de fuerza en el intestino del cangrejo de río, como se muestra en la Figura 5. <img src="/files/ftp_upload/2324/2324fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5: intestino grueso aislados de los cangrejos de río en una solución salina en el gancho del transductor de fuerza </li><li> Espere hasta que el GI comienza a contraerse, y empuje en el inicio LabChart7. </li><li> Dejar que el programa funcionando durante unos 20 segundos. Haga click en &quot;parar&quot;, y añadir un comentario etiquetados, &quot;Saline sólo&quot;. Rellene el cuadro 4. Tabla 4: Contracciones con el compuesto de interés <table border="1"><tbody><tr><td> Número de contracciones </td><td> Amplitud de las contracciones (mV) </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table></li><li> Añadir los compuestos de prueba de interés, e inmediatamente presionar &quot;start&quot; en el LabChart7. </li><li> Dejar que el programa funcionando durante unos 20 segundos. Haga click en &quot;stop&quot; y añadir un comentario directamente en el archivo gráfico como a la sustancia que se añade y su concentración. Rellene el siguiente cuadro. Tabla 5: Las contracciones con un compuesto de _________ <table border="1"><tbody><tr><td> Número de contracciones </td><td> Amplitud de las contracciones (mV) </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table></li><li> Enjuague la preparación con solución salina cangrejos de río con una pipeta. </li><li> Agregar otras sustancias o varias concentraciones de una manera similar. Inmediatamente empuje &quot;start&quot; en el LabChart7. </li><li> Dejar que el programa funcionando durante unos 20 segundos. Haga click en &quot;parar&quot;, y añadir un comentario y la etiqueta directamente en el archivo gráfico que indica el compound utilizado y la concentración. </li></ol> 3. Análisis de Datos <ol><li> Desde 2.3.1 del experimento, el gráfico el número de contracciones de cada solución (solución salina serotonina, glutamato) frente al tiempo. Explicar las tendencias. </li><li> Desde 2.3.2 del experimento, el gráfico el número de contracciones de cada solución (solución salina, la serotonina, glutamato) frente a la amplitud de las contracciones en mV. Explicar las tendencias. </li></ol> 3.1) La medición de la velocidad y la fuerza de las contracciones Para indexar las tarifas de las contracciones puede medir en el tiempo desde el principio en un desvío a la comienzo de la siguiente o el recuento de las deflexiones total de más de un minuto o dos. Los valores se pueden poner en términos de las contracciones por minuto o por segundo dependiendo de lo rápido que se están produciendo. El índice de la fuerza de las contracciones de una medida relativa podría ser utilizado para comparar las diferentes condiciones. En el archivo guardado se puede utilizar la marca &quot;M&quot; y pasar a la línea de base. A continuación, utilice el cursor y pasar a la punta de la flecha y tomar nota del valor que aparece en la parte superior derecha de la pantalla como un valor delta (la diferencia de la M a la cima). Tenga en cuenta que el cursor se debe mantener inmóvil a la medida del cambio. A continuación, mueva la M de la forma siguiente ola de interés y repetir la medida.

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+cells+in+the+gut+of+the+shore+crab+Carcinus+maenas+immunoreactive+to+crustacean+hyperglycaemic+hormone+and+its+precursor-related+peptide.">Endocrine cells in the gut of the shore crab Carcinus maenas immunoreactive to crustacean hyperglycaemic hormone and its precursor-related peptide.</a> J. Exp. Biol. 300, 193-205 (2000).</li><li>Winlow, W., Laverack, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+control+of+hindgut+motility+in+the+lobster+Homarus+gammarus+(L.).+1.+Analysis+of+hindgut+movements+and+receptor+activity.">The control of hindgut motility in the lobster Homarus gammarus (L.). 1. Analysis of hindgut movements and receptor activity.</a> Mar. Behav. Physiol. 1, 1-28 (1972).</li><li>Winlow, W., Laverack, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+control+of+hindgut+motility+in+the+lobster+Homarus+gammarus+(L.).+2.+Motor+output.">The control of hindgut motility in the lobster Homarus gammarus (L.). 2. Motor output.</a> Mar. Behav. Physiol. 1, 29-47 (1972).</li><li>Winlow, W., Laverack, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+control+of+hindgut+motility+in+the+lobster+Homarus+gammarus+(L.).+3.+Structure+of+the+sixth+abdominal+ganglion+(6+A.G.)+and+associated+ablation+and+microelectrode+studies.">The control of hindgut motility in the lobster Homarus gammarus (L.). 3. Structure of the sixth abdominal ganglion (6 A.G.) and associated ablation and microelectrode studies.</a> Mar. Behav. Physiol. 1, 93-121 (1972).</li><li>Wrong, A. D., Sammahin, M., Richardson, R., Mercier, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+properties+of+glutamate+receptors+associated+with+the+crayfish+hindgut.">Pharmacological properties of glutamate receptors associated with the crayfish hindgut.</a> J. Comp. Physiol. 189, 371-378 (2003).</li></ol>

Los datos facilitados en la película y el texto asociado describen los principales pasos necesarios para registrar la actividad en el intestino grueso de los cangrejos de río in situ, así como in vitro. Uno de los objetivos de nuestro informe es aumentar la conciencia sobre el potencial de esta preparación de los estudiantes a ejecutar los laboratorios de investigación que enseñan conceptos fundamentales de la fisiología y la farmacología. Estas preparaciones se pueden utilizar para investigar una serie de preguntas experimentales que conduzcan a una mejor comprensión de las funciones fisiológicas del intestino grueso. Los mecanismos subyacentes a la regulación de las ondas peristálticas y su reversión todavía no se conocen. Los mecanismos para un mayor control de todo el tracto gastrointestinal no se comprende totalmente. La cuestión de cómo integrar a los centros superiores de su actividad con la salida autonómica que controla directamente el sistema gastrointestinal sigue siendo un campo abierto de investigación (Shuranova et al., 2006). Además, las capacidades osmoregulatoria del intestino grueso crustáceos y las funciones de osmorregulación durante el estrés y la muda del medio ambiente no han sido completamente aclarada. Todavía hay muchas preguntas en espera de respuestas en esta preparación.

<ol><li> Cangrejo de río (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., EE.UU.. </li><li> Estándar cangrejos salinos: Modificado de la solución de Van Harreveld (1936). (En mM) 205 NaCl, 5,3 KCl, CaCl2 13,5 2H 2 O, 2,45 de MgCl 2 6H 2 O, 5 HEPES y ajustado a pH 7,4. Serotonina, glutamato y dopamina se hacen en una solución salina cangrejos de río. Todos los productos químicos se obtuvieron de Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). </li><li> Herramientas de disección: Bellas # 5 pinzas, tijeras finas, titular de la hoja del cuchillo, clavos # 26002-20 insectos (todos obtenidos de herramientas de Ciencias Artes (EE.UU.), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404 a 1139) </li><li> Sylgard de fondo placa de Petri </li><li> Vasos (para mantener las soluciones químicas) </li><li> Las señales eléctricas se registran en la línea a una interfaz de PowerLab 26T a un ordenador (ADInstruments, Colorado Springs, CO, EE.UU.). Utilizamos el software estándar de ADInstruments llamado Gráfico o ámbito de aplicación. <li> Puente del módulo para el transductor de fuerza (vainas diferentes puente se requieren para los diferentes tipos de transductores de fuerza). </li><li> MLT0402 (2 gramos) transductor de fuerza es el grado de investigación, como se muestra en el video. MLT 0210 / D (10 mg-25 gramos) y el MLT 500 / A (0-500g) son los transductores de los grados de educación (ADInstruments). </li></ol>

physiological experimentation with the crayfish hindgut: a student laboratory exercise

El propósito del informe es describir las técnicas de disección para la preparación del intestino grueso cangrejo de río y de demostrar cómo hacer grabaciones fisiológicas con un transductor de fuerza para controlar la fuerza de contracción. Además, se demuestra cómo controlar visualmente la actividad peristáltica, que puede ser utilizado como un bioensayo de diversos péptidos, aminas biogénicas y neurotransmisores. Esta preparación es susceptible a los laboratorios de los estudiantes en la fisiología y para demostrar conceptos farmacológicos a los estudiantes. Esta preparación ha estado en uso durante más de 100 años, y todavía ofrece mucho como modelo para la investigación de la generación y regulación de los ritmos y peristáltico para describir los mecanismos que subyacen a su modulación. Los ensayos farmacológicos y de los receptores de subtipos que se iniciaron hace 50 años en el intestino grueso siguen contribuyendo a la investigación hoy en día. Esta preparación sólida se adapta bien a la formación de estudiantes en la fisiología y la farmacología.

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Physiological Experimentation with the Crayfish Hindgut: A Student Laboratory Exercise

En este informe se muestran las técnicas que se pueden utilizar para investigar la biología del cangrejo de río del intestino grueso. Se muestra cómo la disección de un cangrejo de río abdomen y el estudio de la anatomía asociada, la fisiología y la modulación de la actividad. La actividad peristáltica y la fuerza de las contracciones se miden con un transductor de fuerza.

La experimentación fisiológica con el intestino grueso cangrejo de río: Un ejercicio de laboratorio los estudiantes

The purpose of the report is to describe dissection techniques for preparing the crayfish hindgut and to demonstrate how to make physiological recordings ...

physiological-experimentation-with-crayfish-hindgut-student

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.7K vistas.  University of Kentucky. En este informe se muestran las técnicas que se pueden utilizar para investigar la biología del cangrejo de río del intestino grueso. Se muestra cómo la disección de un cangrejo de río abdomen y el estudio de la anatomía asociada, la fisiología y la modulación de la actividad. La actividad peristáltica y la fuerza de las contracciones se miden con un transductor de fuerza.

Video: Physiological Experimentation with the Crayfish Hindgut: A Student Laboratory Exercise

Recording Behavioral Responses to Reflection in Crayfish

Social behavior depends on sensory input from the visual, mechanical and olfactory systems. One important issue concerns the relative roles of each sensory modality in guiding behavior. The role of visual inputs has been examined by isolating visual stimuli from mechanical and chemosensory stimuli. In some studies (Bruski &amp; Dunham, 1987: Delgado-Morales et al., 2004) visual inputs have been removed with blindfolds or low light intensity, and effects of remaining sensory modalities have been elucidated. An alternative approach is to study the effects of visual inputs in the absence of any appropriate mechanical and chemosensory cues. This approach aims to identify the exclusive role of visual inputs. 
We have used two methods to provide visual stimuli to crayfish without providing chemical and mechanical cues. In one method, crayfish are videotaped in an aquarium where half of the walls are covered in mirrors to provide a reflective environment, and the other half are covered in a non-reflective (matte finish) plastic. This gives the crayfish a choice between reflective and non-reflective environments. The reflective environment provides visual cues in the form of reflected images of the crayfish as it moves throughout half of the tank; these visual cues are missing from the non-reflective half of the tank. An alternative method is to videotape the behavior of crayfish in an aquarium separated by a smaller chamber at each end, with a crayfish in one small chamber providing visual cues and an inert object in the opposite small chamber providing visual input from a non-moving, non-crayfish source. 
Our published results indicate that responses of crayfish to the reflective environment depend on socialization and dominance rank. Socialized crayfish spent more time in the reflective environment and exhibited certain behaviors more frequently there than in the non-reflective environment; isolated crayfish showed no such differences. Crayfish that were housed in same-sex pairs developed a social rank of either dominant or subordinate. Responses to reflection differed between dominant and subordinate crayfish (May &amp; Mercier, 2006; May &amp; Mercier, 2007). Dominant crayfish spent more time on the reflective side, entered reflective corners more frequently and spent more time in reflective corners compared to the non-reflective side. Subordinate crayfish walked in reverse more often on the reflective side than on the non-reflective side. Preliminary data suggest similar effects from visual cues provided by a crayfish in a small adjoining chamber (May et al., 2008).

We have developed two methods for studying effects of visual cues on behavior in the absence of tactile and chemical cues. One method involves videotaping responses of crayfish to reflective walls in an aquarium; the other examines effects of visual inputs provided by a live crayfish behind a transparent partition.

Grabación de las respuestas de comportamiento a la reflexión en el cangrejo de río

Social behavior depends on sensory input from the visual, mechanical and olfactory systems.  One important issue concerns the relative roles of each ...

Investigación

Neurociencias

A Procedure for Studying the Footshock-Induced Reinstatement of Cocaine Seeking in Laboratory Rats

The most insidious aspect of drug addiction is the high propensity for relapse. Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been used extensively to study the neurobiology and phenomenology of relapse to drug use. Although procedural variations have emerged over the past several decades, the most conventional reinstatement procedures are based on the drug self-administration (SA) model. In this model, an animal is trained to perform an operant response to obtain drug. Subsequently, the behavior is extinguished by withholding response-contingent reinforcement. Reinstatement of drug seeking is then triggered by a discrete event, such as an injection of the training drug, re-exposure to drug-associated cues, or exposure to a stressor 1.
Reinstatement procedures were originally developed to study the ability of acute non-contingent exposure to the training drug to reinstate drug seeking in rats and monkeys 1, 2. Reinstatement procedures have since been modified to study the role of environmental stimuli, including drug-associated cues and exposure to various forms of stress, in relapse to drug seeking 1, 3, 4.
Over the past 15 years, a major focus of the reinstatement literature has been on the role of stress in drug relapse. One of the most commonly used forms of stress for studying this relationship is acute exposures to mild, intermittent, electric footshocks. The ability of footshock stress to induce reinstatement of drug seeking was originally demonstrated by Shaham and colleagues (1995) in rats with a history of intravenous heroin SA5. Subsequently, the effect was generalized to rats with histories of intravenous cocaine, methamphetamine, and nicotine SA, as well as oral ethanol SA 3, 6.
Although footshock-induced reinstatement of drug seeking can be achieved reliably and robustly, it is an effect that tends to be sensitive to certain parametrical variables. These include the arrangement of extinction and reinstatement test sessions, the intensity and duration of footshock stress, and the presence of drug-associated cues during extinction and testing for reinstatement. Here we present a protocol for footshock-induced reinstatement of cocaine seeking that we have used with consistent success to study the relationship between stress and cocaine seeking.

Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been used extensively to study the role of stress in relapse to drug seeking. Here, we report on a method for inducing the reinstatement of cocaine seeking in laboratory rats via acute exposures to mild, intermittent electric footshock.

Un procedimiento para el estudio de la reposición de estímulo eléctrico plantar inducido por la cocaína Buscando en ratas de laboratorio

The most insidious aspect of drug addiction is the high propensity for relapse.  Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been ...

Physiological Recordings of High and Low Output NMJs on the Crayfish Leg Extensor Muscle

We explain in detail how to expose and conduct electrophysiological recordings of synaptic responses for high (phasic) and low (tonic) output motor neurons innervating the extensor muscle in the walking leg of a crayfish. Distinct differences are present in the physiology and morphology of the phasic and tonic nerve terminals. The tonic axon contains many more mitochondria, enabling it to take a vital stain more intensely than the phasic axon. The tonic terminals have varicosities, and the phasic terminal is filiform. The tonic terminals are low in synaptic efficacy but show dramatic facilitated responses. In contrast, the phasic terminals are high in quantal efficacy but show synaptic depression with high frequency stimulation. The quantal output is measured with a focal macropatch electrode placed directly over the visualized nerve terminals. Both phasic and tonic terminals innervate the same muscle fibers, which suggests that inherent differences in the neurons, rather than differential retrograde feedback from the muscle, account for the morphological and physiological differentiation.

This article demonstrates how to conduct electrophysiological recordings of synaptic responses on the extensor muscle in the walking leg of a crayfish and how the nerve terminals are visualized to show the gross morphological differences of high- and low-output nerve terminals.

Las grabaciones fisiológicas de NMJs de salida de alta y baja en el músculo extensor de piernas cangrejo de río

We explain in detail how to expose and conduct electrophysiological recordings of synaptic responses for high (phasic) and low (tonic) output motor ...

Membrane Potentials, Synaptic Responses, Neuronal Circuitry, Neuromodulation and Muscle Histology Using the Crayfish: Student Laboratory Exercises

The purpose of this report is to help develop an understanding of the effects caused by ion gradients across a biological membrane. Two aspects that influence a cell's membrane potential and which we address in these experiments are: (1) Ion concentration of K+ on the outside of the membrane, and (2) the permeability of the membrane to specific ions. The crayfish abdominal extensor muscles are in groupings with some being tonic (slow) and others phasic (fast) in their biochemical and physiological phenotypes, as well as in their structure; the motor neurons that innervate these muscles are correspondingly different in functional characteristics. We use these muscles as well as the superficial, tonic abdominal flexor muscle to demonstrate properties in synaptic transmission. In addition, we introduce a sensory-CNS-motor neuron-muscle circuit to demonstrate the effect of cuticular sensory stimulation as well as the influence of neuromodulators on certain aspects of the circuit. With the techniques obtained in this exercise, one can begin to answer many questions remaining in other experimental preparations as well as in physiological applications related to medicine and health. We have demonstrated the usefulness of model invertebrate preparations to address fundamental questions pertinent to all animals.

The experiments demonstrate an easy approach for students to gain experience in examining muscle structure, synaptic responses, the effects of ion gradients and permeability on membrane potentials. Also, a sensory-CNS-motor-muscle circuit is presented to show a means to test effects of compounds on a neuronal circuit.

Los potenciales de membrana, las respuestas sinápticas, circuitos neuronales, neuromodulación y la histología muscular utilizando el cangrejo de río: Los ejercicios de laboratorio para estudiantes

The purpose of this report is to help develop an understanding of the effects caused by ion gradients across a biological membrane. Two aspects that ...

Muscle Receptor Organs in the Crayfish Abdomen: A Student Laboratory Exercise in Proprioception

The primary purpose of this experiment is to demonstrate primary sensory neurons conveying information of joint movements and positions as proprioceptive information for an animal. An additional objective of this experiment is to learn anatomy of the preparation by staining, dissection and viewing of neurons and sensory structures under a dissecting microscope. This is performed by using basic neurophysiological equipment to record the electrical activity from a joint receptor organ and staining techniques. The muscle receptor organ (MRO) system in the crayfish is analogous to the intrafusal muscle spindle in mammals, which aids in serving as a comparative model that is more readily accessible for electrophysiological recordings. In addition, these are identifiable sensory neurons among preparations. The preparation is viable in a minimal saline for hours which is amenable for student laboratory exercises. The MRO is also susceptible to neuromodulation which encourages intriguing questions in the sites of modulatory action and integration of dynamic signals of movements and static position along with a gain that can be changed in the system.

The primary purpose of this experiment is to understand how primary sensory neurons convey information of joint movements and positions as proprioceptive information for an animal. An additional objective of this report is present the anatomy of the preparation by dissection and viewing of neurons under a dissecting microscope.

Los órganos receptores de los músculos en el abdomen del cangrejo de río: Un ejercicio de laboratorio los estudiantes en la propiocepción

The primary purpose of this experiment is to demonstrate primary sensory neurons conveying information of joint movements and positions as proprioceptive ...

VisualEyes: A Modular Software System for Oculomotor Experimentation

Eye movement studies have provided a strong foundation forming an understanding of how the brain acquires visual information in both the normal and dysfunctional brain.1 However, development of a platform to stimulate and store eye movements can require substantial programming, time and costs. Many systems do not offer the flexibility to program numerous stimuli for a variety of experimental needs. However, the VisualEyes System has a flexible architecture, allowing the operator to choose any background and foreground stimulus, program one or two screens for tandem or opposing eye movements and stimulate the left and right eye independently. This system can significantly reduce the programming development time needed to conduct an oculomotor study. The VisualEyes System will be discussed in three parts: 1) the oculomotor recording device to acquire eye movement responses, 2) the VisualEyes software written in LabView, to generate an array of stimuli and store responses as text files and 3) offline data analysis. Eye movements can be recorded by several types of instrumentation such as: a limbus tracking system, a sclera search coil, or a video image system. Typical eye movement stimuli such as saccadic steps, vergent ramps and vergent steps with the corresponding responses will be shown. In this video report, we demonstrate the flexibility of a system to create numerous visual stimuli and record eye movements that can be utilized by basic scientists and clinicians to study healthy as well as clinical populations.

Neural control and cognitive processes can be studied through eye movements. The VisualEyes software allows an operator to program stimuli on two computer screens independently using a simple, custom scripting language. The system can stimulate tandem eye movements (saccades and smooth pursuit) or opposing eye movements (vergence) or any combination.

VisualEyes: Un sistema de software modular para experimentación oculomotor

Eye movement studies have provided a strong foundation forming an understanding of how the brain acquires visual information in both the normal and ...

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex behaviors such as food choice, predator, conspecific and mate recognition and other socially relevant cues. Olfactory receptor neurons (ORNs) are located in the dorsal part of the nasal cavity embedded in the olfactory epithelium. These bipolar neurons send an axon to the olfactory bulb (see Fig. 1, Reisert &amp; Zhao1, originally published in the Journal of General Physiology) and extend a single dendrite to the epithelial border from where cilia radiate into the mucus that covers the olfactory epithelium. The cilia contain the signal transduction machinery that ultimately leads to excitatory current influx through the ciliary transduction channels, a cyclic nucleotide-gated (CNG) channel and a Ca2+-activated Cl- channel (Fig. 1). The ensuing depolarization triggers action potential generation at the cell body2-4.
In this video we describe the use of the "suction pipette technique" to record odorant-induced responses from ORNs. This method was originally developed to record from rod photoreceptors5 and a variant of this method can be found at jove.com modified to record from mouse cone photoreceptors6. The suction pipette technique was later adapted to also record from ORNs7,8. Briefly, following dissociation of the olfactory epithelium and cell isolation, the entire cell body of an ORN is sucked into the tip of a recording pipette. The dendrite and the cilia remain exposed to the bath solution and thus accessible to solution changes to enable e.g. odorant or pharmacological blocker application. In this configuration, no access to the intracellular environment is gained (no whole-cell voltage clamp) and the intracellular voltage remains free to vary. This allows the simultaneous recording of the slow receptor current that originates at the cilia and fast action potentials fired by the cell body9. The difference in kinetics between these two signals allows them to be separated using different filter settings. This technique can be used on any wild type or knockout mouse or to record selectively from ORNs that also express GFP to label specific subsets of ORNs, e.g. expressing a given odorant receptor or ion channel.

Olfactory receptor neurons (ORNs) convert odor signals first into a receptor current that in turn triggers action potentials that are conveyed to second order neurons in the olfactory bulb. Here we describe the suction pipette technique to record simultaneously the odorant-induced receptor current and action potentials from mouse ORNs.

Inducidas Odorante-respuestas registradas de neuronas olfativas del receptor utilizando la técnica de aspiración con una pipeta

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

Proprioception and Tension Receptors in Crab Limbs: Student Laboratory Exercises

The primary purpose of these procedures is to demonstrate for teaching and research purposes how to record the activity of living primary sensory neurons responsible for proprioception as they are detecting joint position and movement, and muscle tension. Electrical activity from crustacean proprioceptors and tension receptors is recorded by basic neurophysiological instrumentation, and a transducer is used to simultaneously measure force that is generated by stimulating a motor nerve. In addition, we demonstrate how to stain the neurons for a quick assessment of their anatomical arrangement or for permanent fixation. Staining reveals anatomical organization that is representative of chordotonal organs in most crustaceans. Comparing the tension nerve responses to the proprioceptive responses is an effective teaching tool in determining how these sensory neurons are defined functionally and how the anatomy is correlated to the function. Three staining techniques are presented allowing researchers and instructors to choose a method that is ideal for their laboratory.

Physiological and anatomical techniques are demonstrated to address function and structure for joint proprioceptors and muscle tension receptors in crustacean walking limbs.

Propiocepción y la tensión en los receptores de cangrejo Limbs: Ejercicios de Laboratorio Estudiante

The primary purpose of these procedures is to demonstrate for teaching and research purposes how to record the activity of living primary sensory neurons ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

Análisis funcional del circuito de alimentación de las larvas en Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Measuring Oral Fatty Acid Thresholds, Fat Perception, Fatty Food Liking, and Papillae Density in Humans

Emerging evidence from a number of laboratories indicates that humans have the ability to identify fatty acids in the oral cavity, presumably via fatty acid receptors housed on taste cells. Previous research has shown that an individual&#39;s oral sensitivity to fatty acid, specifically oleic acid (C18:1) is associated with body mass index (BMI), dietary fat consumption, and the ability to identify fat in foods. We have developed a reliable and reproducible method to assess oral chemoreception of fatty acids, using a milk and C18:1 emulsion, together with an ascending forced choice triangle procedure. In parallel, a food matrix has been developed to assess an individual&#39;s ability to perceive fat, in addition to a simple method to assess fatty food liking. As an added measure tongue photography is used to assess papillae density, with higher density often being associated with increased taste sensitivity.

Oral chemoreception of fatty acids and the association with diet and fatty food preferences may enable the identification of mechanisms involved with the development of obesity and why dietary changes may be difficult for many individuals.

Medición oral de ácidos grasos Umbrales, Percepción de grasa, alimentos grasos gusto, y papilas Densidad en Humanos

Emerging evidence from a number of laboratories indicates that humans have the ability to identify fatty acids in the oral cavity, presumably via fatty ...