Damos las gracias a Jos Burgert por ayudar con algunas de las figuras. Estamos muy agradecidos a Ingo Selbach (y el grupo &quot;Edelkrebsprojekt NRW&quot;) por sus esfuerzos para suministrar el laboratorio con animales de experimentación. Damos las gracias a Anna C. Schneider para la corrección primeras versiones del manuscrito. Esta investigación fue apoyada por una beca SM Emmy Noether DFG 206 / 3-1 y una subvención de inicio de la Universidad de Colonia para la facultad femenina.

Este procedimiento de disección está de acuerdo con las Comunidades Europeas Directiva del Consejo de 22 de septiembre de 2010 (2010/63 / UE). 1. Preparación <ol><li> Obtener cangrejos, Pacifastacus leniusculus (Dana), de ambos sexos ≥8 cm de tamaño. Asegúrese de que los animales son vitales y las extremidades y abdomen abdominales están intactos. </li><li> Tenga cuidado para inspeccionar el caparazón y que esta cutícula es duro y rígido. Antes y animales postmuda tienen un caparazón suave y no son adecuados para los experimentos debido a que durante el proceso de muda muchos parámetros cambian (por ejemplo, disminución de la actividad locomotora). </li><li> Ensamblar todas las herramientas y materiales utilizados durante la disección, alfileres y desheathing del cordón nervioso se muestra en la Figura 2 y que figuran en los suplementos suministrados. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig2highres.jpg" /> Figura 2: <sTrong&gt; Materiales y herramientas utilizados para la disección, alfileres y desheathing del cordón nervioso. (1) gran cubo lleno de hielo; (2) solución salina cangrejos; (3) dispensador de solución salina; (4) microscopio de disección; (5) plato de disección; (6) tijeras fuertes; (7) pinzas (8) tijeras de primavera; (9) caja de Petri llena de Sylgard claro; (10) pernos de fijación; (11) fuente de la lámpara fría. 2. Bruto Disección <ol><li> Anestesiar a los animales en hielo durante 15 - 20 min. Llevar a cabo la primera parte de la disección bruto a un banco de laboratorio cerca del fregadero, ya que incluye un paso exanguinación y la muestra necesita ser enjuagado regularmente con solución salina cangrejos de río durante el procedimiento. </li><li> Sostenga la parte ventral de los animales y utilizar tijeras fuertes para cortar las dos garras en sus bases cerca de tórax (Figura 3-1). Retire urópodo izquierda y derecha (Figura 3-2). </li><li> Coloque la cara ventral de los animales en el plato forrado con disección Sylgard negro. Elevate cefalotórax mediante la inserción de hielo debajo y precisar el abdomen en el telson (Figura 4A). </li><li> Llene el depósito de solución salina con ~ 60 ml de solución salina enfriada cangrejos. Perfundir cangrejos con solución salina fría a través de la apertura de la garra (Figura 4B). El exceso de solución salina se escurra a través de los cortes en los urópodos. Cubrir los cangrejos con hielo durante desangramiento </li><li> Decapitar al animal con un único corte transversal justo por detrás de los ojos del animal con unas tijeras fuertes (Figura 5A). Retire todos piernas para caminar cerca de las articulaciones de base como se indica en la figura 5B. </li><li> Aislar el abdomen con los últimos segmentos torácicos desde el resto de la cephalothorax. Hacer un primer corte en el nivel de las segundas patas para caminar (segmento torácico 3) mediante la inserción de la punta de las tijeras en la abertura de la segunda pata caminar y de corte hacia el lado opuesto. (Figura 6A-1). </li><li> Extender este primer corte a ambos lados a través de tque cefalotórax (Figura 6A-2). </li><li> Voltear el animal abierta para que algunos de los órganos internos visibles. Empuje la glándula digestiva prominente (Figura 6B-3) a la parte anterior de la muestra y el uso de fórceps para retirar los órganos reproductivos de la cavidad abdominal. </li><li> Retire la parte anterior del cefalotórax (Figura 6C). Utilice cortes laterales para eliminar las partes laterales del caparazón, que cubren las branquias, en ambos lados del tórax restante (Figura 6D-4). Retire las branquias y enjuague la muestra con solución salina fría. </li><li> Continuar la disección con un corte a través de toda la longitud de la placa esternal como se indica en la Figura 6E-5. Hacer este recorte en las posiciones laterales máximas entre Pleurón y swimmerets (Figura 6E marcas rojas). Proceder en el otro lado con un mismo corte. Enjuagar la muestra con solución salina fría. </li><li> Llevar a cabo la disección restante bajo un dissection microscopio. Coloque el lado ventral del abdomen de los cangrejos de río arriba en el plato de la disección forrado con Sylgard negro y lleno con solución salina cangrejos de río de modo que cubra la muestra. NOTA: Los siguientes pasos (02.12 a 04.08) contiene instrucciones direccionales que se aplican a los experimentadores diestros. En los siguientes pasos (02.12 a 06.08) es importante para reemplazar salina cangrejos en intervalos regulares, cada 20 a 30 minutos con solución salina fría, para mantener el sistema nervioso saludable. </li><li> Fijar la muestra con alfileres de insectos posteriormente en el telson y anterior a los restos del caparazón. Coloque la muestra de forma que los puntos de Telson a la izquierda y es paralelo al borde de la mesa. </li><li> El uso de fórceps gruesas en la mano izquierda para agarrar a través de una abertura de la pierna para caminar (Figura 7A) y tire de la muestra abierta (flecha blanca Figura 7B). Identificar los grandes dos cadenas musculares flexor dorsal (Figura 7B-1 y C-1) y reducir su ventralbase como se muestra en la Figura 7B. </li><li> Identificar la arteria esternal (Figura 7C-2), que desciende del dorsal (el corazón) a ventral, en el segmento torácico 4º. Esta arteria se encuentra justo por encima del cordón nervioso (Figura 7C-3), antes de que se proyecta bajo el cordón nervioso, formando la arteria ventral. </li><li> Seccionar la arteria esternal. Como se demuestra en la Figura 7C, levante la arteria primero, utilizando una cuchilla de las tijeras, y sólo cortar cuando el cordón nervioso ventral situado es visible. </li><li> Fijar los músculos flexores dorsales anterior (a la derecha). Esto debe hacerse con la máxima posición estirada con alfileres para que no se bloquee la visión y la muestra permanece en tensión. Cuando las fibras musculares se fijan dorsal (Figura 8-1), el primero de los ganglios abdominal, A1 y ​​A2, con los nervios asociados N1, N2, y N3 son visibles (Figura 8). </li><li> El uso de fórceps en la mano izquierda para agarrar la especificaciónimen en una abertura de las piernas para caminar. A lo largo de los siguientes pasos disección tire suavemente para mantener la muestra abierta. </li><li> Seccionar los nervios N3 en la posición más distante del cordón nervioso. (Figura 8-3). </li><li> Cortar los músculos flexores cerca de la apodema ventral como se muestra en la Figura 8-4. Tenga cuidado de no dañar el cable de los nervios o la N2 nervios. </li><li> Repita los pasos de 2,18 y 2,19 para la N3 nervios y los músculos flexores de los restantes abdominal ganglios A2 a A5. </li><li> En el último ganglio abdominal, A6, cortar los músculos flexores dorsales del apodema ventral y el espécimen debe verse como se muestra en la Figura 9. </li><li> Cortar la placa posterior del esternón a los nervios del A6 (Figura 9-1) y mantener la parte ventral (Figura 9-2). Deseche la parte dorsal con los músculos flexores (Figura 9-3). Fije la placa esternal anterior con alfileres en las aberturas de las piernas para caminar,y posteriormente a A6. </li></ol> 3. fina disección <ol><li> Coloque la muestra bajo el microscopio con la parte anterior dirigida lejos y la parte posterior hacia el borde de las tablas. </li><li> El uso de fórceps, como se muestra en la Figura 10A para eliminar las partes más anteriores de la sterna cefalotórax. NOTA: Los ganglios torácicos y nervios asociados están parcialmente cubiertas por la musculatura de la pierna y sterna cefalotórax. El sterna cefalotórax formar un esqueleto que separa las cavidades situadas lateralmente de las piernas para caminar unos de otros y de la cavidad medial en el que reside el cordón nervioso ventral. </li><li> Cortar los músculos entre las estructuras exoesqueléticas restantes tal como se indica en la Figura 10B -1 y B2. El uso de fórceps para agarrar y levantar la parte anterior del cordón nervioso ventral (Figura 10C). NOTA: El cordón nervioso será dañado en el proceso para evitar la captación de la nerve cable varias veces. </li><li> Cortar los nervios torácicos lateralmente mientras levanta el cordón nervioso (Figura 10C-3). Mantenga estos nervios en longitud adecuada para la fijación. Quitar la parte exprimido de la cadena de ganglios, que fue recogido con una pinza, cortando todo el tejido anterior a la T4 (Figura 10C-4). </li><li> Coloque la muestra con la parte anterior a la izquierda y se centran en A1. Cortar la N1 y N2 nervios de A1 en una longitud adecuada (máx. 1 cm) para fijar a cabo. </li><li> Concéntrese en A2 e identificar los nervios N1, N2, N3 y de este segmento (Figura 11). Los nervios N1 de ganglios abdominal A2-A5 residen entre dos repliegues cuticulares esternales en cada segmento (Figura 11A-1) y están cubiertos por la musculatura. Haga un corte a lo largo de la invaginación cuticular esternal posterior. Comience en el borde lateral del abdomen y proceder hacia la línea media, como se muestra en la Figura 11A. </li><li> Si el objetivo sigue siendo N1 calarojo con el tejido como se muestra en la Figura 11B (flecha roja), corte a través del haz muscular, pero esta vez anterior a los dos repliegues cuticulares esternales y el nervio N1 (Figura 11B-2). </li><li> Cortar N1 nervio lo más distante posible (Figura 11 C-3). Nervio N1 es totalmente visible y la rama anterior y posterior se puede identificar (Figura 11C). </li><li> Proceder a la N1 nervio contralateral y primero cortar los músculos a lo largo de la invaginación cuticular esternal posterior, comenzando medialmente, cerca del ganglio (Figura 11D). Si el nervio está todavía cubierta por el tejido, corte a través del haz muscular, pero esta vez anterior a los dos repliegues cuticulares esternales y el nervio N1, similar a la figura 11B-2. Cortar la N1 nervio lo más distante posible. </li><li> Cortar los nervios N2 de este ganglio a una longitud adecuada (aprox. 0,5 cm) para la fijación. </li><li> Repita los pasos 3.7 a 3.11 para los nervios de A3-A5. </li><li> Cortar el nerves de ganglio A6 lo más distante posible (Figura 12A). El uso de fórceps para agarrar múltiples nervios de A6 a levantar este ganglio y empezar a aislar la cadena de ganglios de la placa esternal. </li><li> Mientras levanta el cordón nervioso, tire de ella suavemente en la dirección anterior como se demuestra en la figura 12B (flecha blanca). A medida que se levantaron los ganglios individuales, retire la arteria ventral que puede ser instalado en la parte ventral del cordón nervioso (Figura 12C). Continúa esta secuencia (suavemente) cortar pull-hasta que el cordón nervioso está completamente aislado. </li><li> Transferir la cadena aislada de ganglios a una placa de Petri llena de Sylgard claro y lleno de solución salina cangrejos de río (Figura 12D). </li></ol> 4. Fijación del cordón nervioso en la placa de Petri NOTA: Utilice pequeños pasadores cortados de alambre de acero inoxidable (ver suplementos) para fijar el cordón nervioso. Toque sólo la terminación nerviosa con las pinzas y no hacer squeeze las conectivas o ganglios. <ol><li> Pin de la cadena de ganglios en línea recta, mientras que la aplicación suave estiramiento. </li><li> Colocar el cable de nervio en la placa de Petri con el lado dorsal hacia arriba (Figura 13, línea negro). El lado ventral de los ganglios puede ser identificado por su convexidad; el lado dorsal es plana. Pin de los nervios torácicos a los lados. Continuar con los nervios de A6, estirando la cuerda nerviosa largo de su eje longitudinal. </li><li> Pin los nervios de A1 en un ángulo de 90 ° en relación con el cordón nervioso. </li><li> Continúe con el A2 y el pin de la N2 nervios en un ángulo de 35 a 45 ° en relación con el cordón nervioso (Figura 1). </li><li> Separar los nervios N1 en sus ramas anterior y posterior antes de fijar como se demuestra en la Figura 14. Utilice dos pares de pinzas finas para recoger con un par de pinzas de la anterior y con la otra la rama posterior del nervio N1. Tenga cuidado al elegir sólo el extremo más distals de las ramas del nervio. Ahora tire cuidadosamente separados. </li><li> Pin de la rama anterior de la N1 nervio en un ángulo de 90 ° con respecto al cordón nervioso (Figura 1A). Pin de la rama posterior del nervio N1 entre la rama N1 anterior y el nervio N2. </li><li> Repetir el 4.4 hasta 4.6 pasos por los nervios de los ganglios A3-A5. Si bien fijando el tramo cordón nervioso en longitudinal, así como las direcciones transversales. </li></ol> 5. Desheathing los ganglios <ol><li> Coloque la preparación de tal manera que las manos del experimentador siempre están descansando en un plano estable para evitar la agitación. Con el fin de desheath los ganglios iluminan el cordón nervioso desde abajo. </li><li> Concéntrese en cualquier ganglio abdominal A1 a A5. Con unas tijeras finas primavera para hacer un pequeño corte lateral a través de la vaina del ganglio, posterior al ganglio y entre los nervios N2 y N3 (flecha roja Figura 15A). </li><li> Recoge la vaina ganglio usando muy ffórceps INE y cortan transversalmente a través de la vaina por encima de los conectivos, como se indica en la figura 15A-1. Tenga cuidado de no apretar o cortar el cordón nervioso con las tijeras. </li><li> Todavía sostener y levantar la vaina ganglio con pinzas siguen a cortar a lo largo de los bordes laterales del ganglio (Figura 15B-2 y -3). Retire la funda. Alternativamente fijarlo a ambos lados de las conectivas de tal manera que se fija el cordón nervioso pero no se aprieta. </li><li> Repita los pasos 5.2 a 5.4 para todos los ganglios de A1 a A5 abdominal. </li><li> Desheathe los ganglios torácicos y el ganglio A6 de una manera similar. Para desheathe A6 inicio anterior al ganglio y proceder en dirección posterior. Pin de la vaina de ganglio A6 al extremo posterior de la cadena de ganglios. </li></ol> 6. extracelular Grabaciones de neuronas motoras <ol><li> Ensamblar todas las herramientas y materiales utilizados para las grabaciones extracelulares mostrados in Figura 16B y que figuran en los suplementos. Una visión general de la configuración de la grabación se muestra en la Figura 16A. Iniciar todo el equipo electrónico utilizado en este experimento (Figura 16C), de manera que los amplificadores pueden calentarse durante al menos 30 min antes de la grabación. Encienda el ordenador e inicie el software de grabación. </li><li> Coloque la cadena de ganglios en la mesa microscopio e iluminar desde abajo. Insertar el electrodo de registro en el Sylgard cerca del nervio objetivo y el electrodo de referencia en una posición cercana, pero lateral a los ganglios (Figura 17A y B). Doble el nervio objetivo alrededor del electrodo de registro (Figura 17C). </li><li> Estire el nervio ligeramente, para asegurar el contacto entre el electrodo y el nervio y el pin en el lado (F igura 17D). Fijar los cables de los electrodos a la mesa microscopio usando arcilla, para que se mantengan en la posición deseada. </li><li> Utilice unjeringa llena de vaselina y una aguja de calibre 20 (con punta redondeada) (Figura 17E-3) para aislar el nervio objetivo de la solución de baño. Primero aplique un poco de vaselina en el Sylgard alrededor del electrodo de registro. El resultado es una capa de vaselina que cubre el Sylgard en la proximidad del electrodo de registro (Figura 17E-4). Tenga cuidado de no frotar directamente sobre el nervio y evitar las burbujas de aire en esta capa. </li><li> Sellar el electrodo de registro con vaselina desde todos los lados hasta el nivel de la superficie de la solución salina (Figura 17F). </li><li> Repita este procedimiento para todos los nervios de destino cuya actividad debe ser monitoreado. </li><li> Inicie la grabación. Use un modo de adquisición libre continua o hueco y una frecuencia de muestreo de 5 kHz. Ajuste el amplificador extracelular a los siguientes parámetros; ganar para 1000 (amplifica la señal de 1.000 veces, tener cuidado de incluir este parámetro amplificación en la configuración del software de adquisición) unda gama de filtros de paso de banda de 300 Hz (corte bajo) a 2000 Hz (corte alto). </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

<html> La anatomía del cangrejo de río y su ganglio abdominal se ha descrito anteriormente 5, 18, ​​19, 20 y se recomienda para familiarizarse con ellos antes de la disección para evitar el corte de nervios importantes. Es fundamental para mantener la preparación a temperaturas inferiores a 23 ° C para evitar la degradación del cordón nervioso aislado. Esto se puede conseguir fácilmente mediante la sustitución de la solución de baño cada 20-30 min con solución salin...

Los swimmerets de cangrejos de río tienen una función en el control de la postura y la golpeaban rítmicamente cuando los animales nadan hacia adelante, ventilar sus madrigueras o hembras airean sus huevos 5, 6. Los swimmerets del cangrejo señal, Pacifastacus leniusculus, ocurren en pares de la segunda a la quinta segmento abdominal, con una extremidad a cada lado del abdomen 7. El sistema nervioso central produce en su propia el golpeteo rítmico motor que impulsa el movimiento swimmeret en el animal intacto, así como en la preparación cordón nervioso aislado. Cuando no hay retroalimentación sensorial o de entrada presente descendente el patrón motor rítmico producido se llama la locomoción ficticia 1, 2. En el sistema swimmeret este patrón motor no difiere en cualquier parámetro de la actividad de los swimmerets medidos en el animal intacto. El movimiento de cada swimmeret es accionado por un microcircuito que se encuentra en y limitado a un corresponding hemiganglion 1 -. 3 En cada microcircuito hay un kernel generadores de patrones que se compone de cinco interneuronas no enriquecidas identificados. Pueden caracterizarse funcionalmente como siendo Inhibidor de Power Stroke (IPS) o inhibidor de la carrera de retorno (IRS) 8. Estos IPS y interneuronas IRS no son osciladores endógenos, en lugar de su actividad alterna es impulsado por la inhibición recíproca 9. Debido a que estas interneuronas inhiben directamente las neuronas motoras swimmeret, la alternancia PS-RS movimiento se genera 10. Locomotion sin embargo, no sólo requiere la generación de actividad, sino también la coordinación de los diferentes microcircuitos independientes. En el sistema swimmeret dicha coordinación es establecida por el microcircuito de coordinación que asegura que las extremidades son activos en tiempos correctos. Este microcircuito es construido por tres neuronas identificadas en cada segmento de 11 a 15. Este protocolo prevé ªe primera vez una guía disección paso a paso para aislar la cadena de ganglios (T4 a A6, Figura 1). Mostramos cómo la clavija del cable aislado nervio abdominal y desheathe cada ganglio. En este aislado de preparación del sistema nervioso, las neuronas responsables del movimiento swimmeret están listos para su uso en experimentos electrofisiológicos y morfológicos. La segunda parte de este protocolo demuestra las principales características del patrón motor swimmeret. Esto incluye una guía paso a paso para grabar extracelularmente la actividad de las neuronas motoras swimmeret. Los axones de las neuronas motoras RS proyectan a través de la rama anterior del nervio N1, mientras que los axones de las neuronas motoras PS proyectan a través de la rama posterior del mismo nervio (Figura 1) 4. Por lo tanto su actividad se puede grabar a partir de estas ramas con electrodos diferenciales pines. <img alt="Figura 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig1highres.jpg" width="200" /><br/&gt; Figura 1: Aislado sistema nervioso de ganglio torácico 4 (T4) para ganglio abdominal 6 (A6) y un diagrama esquemático de que T4:. Ganglio torácico 4; T5: ganglio torácico 5; A1, A2 ... A6 ganglio abdominal 1, el ganglio abdominal 2 ... ganglio abdominal 6; N1: nervios N1; N2: nervio N2; N3: nervio N3; PS: el poder de carrera; RS: vuelta de carrera. Abreviaturas direccionales: A = anterior; P = posterior. Este procedimiento de disección y la técnica electrofisiológica demostrado son convenientes para los estudiantes de pregrado y pueden complementar los cursos prácticos de los estudiantes en la fisiología. La cadena aislado de los ganglios se ha utilizado en una serie de experimentos para estudiar la función del sistema nervioso, la coordinación, o modulación de microcircuitos swimmeret 6 así como el control neuronal de la conducta adaptativa en la locomoción 16, 17. Así, el sistema swimmeret cangrejo de río proporciona una cantidad enorme de la enseñanza interesante o tllover las oportunidades que todos comienzan con la disección del cordón nervioso ventral de cangrejos de río y registro extracelular del patrón motor ficticio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="606">
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:131px;">Type</td>
			<td style="width:139px;">Company</td>
			<td style="width:103px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:103px;">Comments/&#160;&#160; Description</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:131px;">4-channel extracellular amplifier: MA 102&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Amplifier</td>
			<td style="width:139px;">Elektroniklabor, Zoologie, Universit&#228;t zu K&#246;ln, Germany</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">for extracellular recording</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:131px;">air-table</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:139px;">Technical Manufacturing Corporation 
			(TMC) a unit of AMETEK Ultra Precision Technologies, Peabody, MA, USA</td>
			<td style="width:103px;">63-534</td>
			<td style="width:103px;">for intracellular recording</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:131px;">Axon Digidata 1440A</td>
			<td style="width:131px;">Digitizer</td>
			<td style="width:139px;">Axon Instruments, Molecular Devices Design, Union City, CA</td>
			<td style="width:103px;">DD1440A</td>
			<td style="width:103px;">digitizes recorded signals&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">big bucket&#160;</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">filled with ice</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:131px;">Clampex &#38; Clampfit</td>
			<td style="width:131px;">pClamp 10, recording and analysis software</td>
			<td style="width:139px;">Molecular Devices Design, Union City, CA</td>
			<td style="width:103px;">pClamps 10 Standard</td>
			<td style="width:103px;">for extracellular recording</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:131px;">cold lamp source</td>
			<td style="width:131px;">with flexible light guide (fiber optic bundle)&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Euromex microscopes holland, Arnhem, BD</td>
			<td style="width:103px;">LE.5211 &#38; LE.5235</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:131px;">computer and monitor</td>
			<td style="width:131px;">equipped with recording software</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">for extracellular recording</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:131px;">container and pipette for liquid waste&#160;</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:131px;">crayfish saline&#160;</td>
			<td style="width:131px;">contains (in mM): 5.4 KCl, 2.6 MgCl2, 13.5 CaCl2, and 195 NaCl, buffered with 10mM Tris base and 4.7mM maleic acid; aerated for 3 hours. Adjust at pH of 7.4.&#160;</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">always keep at temperatures ~ 4&#176; C</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:131px;">dextran, Texas Red (3000MW, lysine fixable)</td>
			<td style="width:131px;">fluorescent dye, lysine fixable</td>
			<td style="width:139px;">Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:103px;">D3328</td>
			<td style="width:103px;">for intracellular dyefill of neurons</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:131px;">differential pin electrodes</td>
			<td style="width:131px;">made from stainless steel &#632; 0.2 mm</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">for extracellular recording</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:131px;">dissection dish&#160;</td>
			<td style="width:131px;">(l x w x h) 15x7x5 cm; linned with black silicone</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">used in the gross disection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:131px;">faraday cage</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">for extracellular recording</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:131px;">fixing pins</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">for pinning the specimen</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:131px;">forceps (biology, Dumont #5)</td>
			<td style="width:131px;">Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX</td>
			<td style="width:139px;">Fine Science Tools (FST), Germany</td>
			<td style="width:103px;">11252-20</td>
			<td style="width:103px;">fine forceps: used to pick nerves</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:131px;">forceps (biology, Dumont #55)</td>
			<td style="width:131px;">Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX</td>
			<td style="width:139px;">Fine Science Tools (FST), Germany</td>
			<td style="width:103px;">11255-20</td>
			<td style="width:103px;">extra fine forceps: used for desheathing</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:131px;">forceps (electronic, Dumont #5)</td>
			<td style="width:131px;">Forceps: Standard, tip 0.1 x 0.06 mm, length 11cm, INOX</td>
			<td style="width:139px;">Fine Science Tools (FST), Germany</td>
			<td style="width:103px;">11251-20</td>
			<td style="width:103px;">coarse forceps:&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; used to grab specimen and pins</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:131px;">intracellular electrode</td>
			<td style="width:131px;">Borosilicate glass capillaries (outer/inner diameter: 1mm/0.5mm), with filament</td>
			<td style="width:139px;">Sutter Instruments, Novato, CA</td>
			<td style="width:103px;">BF100-50-10</td>
			<td style="width:103px;">for intracellular recording and dyefill of neurons</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:131px;">Leica S8 Apo StereoZoom</td>
			<td style="width:131px;">Dissection Microscope&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Zoom 1x - 8x</td>
			<td style="width:139px;">Leica, Germany</td>
			<td style="width:103px;">10446298</td>
			<td style="width:103px;">for extracellular recording</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:131px;">microscope table</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">for extracellular recording</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:131px;">mirror</td>
			<td style="width:131px;">to illuminate preparation from below</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">for extracellular recording</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:131px;">modeling clay</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">for extracellular recording</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:131px;">Olympus SZ61</td>
			<td style="width:131px;">Dissection Microscope&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Zoom 0.67x - 4.5x</td>
			<td style="width:139px;">Olympus, Germany</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">for the dissection</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:131px;">petri dish&#160;</td>
			<td style="width:131px;">94 x 16 mm; lined with clear silicone</td>
			<td style="width:139px;">Greiner bio-one, Germany</td>
			<td style="width:103px;">633180</td>
			<td style="width:103px;">used to pin the isolated chain of ganglia</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:131px;">ring scissors</td>
			<td style="width:131px;">ThoughCut, cutting edge: sharp/blunt, straight: 13cm</td>
			<td style="width:139px;">Fine Science Tools (FST), Germany</td>
			<td style="width:103px;">14054-13</td>
			<td style="width:103px;">for gross dissection&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (steps 2.1 - 2.11)</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:131px;">saline dispenser&#160; with a 16 gauge needle (outer &#632; 1.6mm) attached via a flexible tube.</td>
			<td style="width:131px;">Volume ~ 60ml,</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">used for exsanguination</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:131px;">spring scissors or alternative: Vannas spring scissors</td>
			<td style="width:131px;">cutting edge: 8 mm, tip diameter: 0.2mm, straight: 10cm or cutting edge 2.5 mm, tip diameter 0.075 mm, straight: 8cm</td>
			<td style="width:139px;">Fine Science Tools (FST), Germany</td>
			<td style="width:103px;">15024-10 or&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 15000-08</td>
			<td style="width:103px;">for desheathing&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:131px;">stainless steel wire &#632; 0.125 mm&#160;</td>
			<td style="width:131px;">to cut pins of 4-7 mm length</td>
			<td style="width:139px;">Goodfellow GmbH, Bad Nauheim, Germany</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;">for pinning of the nerve cord</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:131px;">student Vannas&#160; spring scissors or alternative:&#160; Moria Spring Scissors</td>
			<td style="width:131px;">cutting edge: 5mm, tip diameter: 0.35mm, straight: 9cm or cutting edge: 5mm, tip diameter 0,1 mm, straight: 8 cm</td>
			<td style="width:139px;">Fine Science Tools (FST), Germany</td>
			<td style="width:103px;">91500-09 or&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 15396-00</td>
			<td style="width:103px;">for gross and fine disection&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (steps 2.11 - 3.14)</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:131px;">sylgard</td>
			<td style="width:131px;">184 Silicone Elastomer Base and Curing Agent; for black sylgard add activated carbon</td>
			<td style="width:139px;">Dow Corning, Midland, MI, USA</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:131px;">syringe filled with petroleum jelly and equipped with a 20 gauche needle with rounded tip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:103px;">for extracellular recording</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the swimmeret system of crayfish: a practical guide for the dissection of the nerve cord and extracellular recordings of the motor pattern

Aquí se demuestra la disección del nervio espinal cangrejos abdominal. La preparación comprende los dos últimos ganglios torácicos (T4, T5) y la cadena de ganglios abdominal (A1 a A6). Esta cadena de ganglios incluye la parte del sistema nervioso central (CNS) que impulsa la locomoción coordinada de los pleópodos (swimmerets): el sistema swimmeret. Se sabe desde hace más de cinco décadas que en los cangrejos cada swimmeret es impulsada por su propio núcleo generadores de patrones independiente que genera la actividad rítmica alternancia 1-3. Las neuronas motoras que inervan la musculatura de cada swimmeret comprender dos anatómica y funcionalmente distintas poblaciones 4. Uno de ellos es responsable de la retracción (carrera de potencia, PS) de la swimmeret. El otro impulsa la prolongación (carrera de retorno, RS) de la swimmeret. Las neuronas motoras del sistema swimmeret son capaces de producir espontáneamente un patrón motor ficticio, que es idéntico al patrón grabado en vivo </em&gt; 1. El objetivo de este informe es dar a conocer una interesante y conveniente sistema modelo para el estudio de las redes y la coordinación de los microcircuitos independientes para prácticas de laboratorio de los estudiantes de generación de ritmo. El protocolo previsto incluye paso a paso las instrucciones para la disección del cordón nervioso abdominal del cangrejo de río, el fijar de la cadena de aislados de ganglios, desheathing los ganglios y registrando el patrón motor ficticio swimmerets extracelular del sistema nervioso aislado. Además, podemos controlar la actividad de las neuronas swimmeret registrados intracelularmente a partir de las dendritas. Aquí también se describe brevemente estas técnicas y proporcionamos algunos ejemplos. Además, la morfología de las neuronas swimmeret se puede evaluar usando varias técnicas de tinción. Aquí proporcionamos ejemplos de intracelular (por iontoforesis) tinte lleno neuronas y rellenos de grupos de neuronas motoras swimmeret. En nuestro laboratorioutilizamos esta preparación para estudiar las funciones básicas de locomoción ficticia, el efecto de la retroalimentación sensorial sobre la actividad del SNC, y la coordinación entre los microcircuitos en un nivel celular.

Con las grabaciones extracelulares simultáneas de RS y PS, las neuronas motoras de un ganglio, la actividad alterna de estos conjuntos de neuronas motoras, se puede controlar (Figura 18), lo que representa el patrón de locomoción ficticia. <img alt="Figura 18" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig18highres.jpg" /> Figura 18: Esquema de un ganglio y la colocación del electrodo de patilla diferencial registro extracelular de RS neuronas motoras (trazo...

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The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern

Here we describe the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. We also demonstrate an electrophysiological technique to record fictive locomotion from swimmeret motor neurons.

El Sistema Swimmeret de cangrejo de río: Una guía práctica para la disección del cordón nervioso y extracelulares Grabaciones del patrón motor

Here we demonstrate the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. The preparation comprises the last two thoracic ganglia (T4, T5) and the chain of ...

the-swimmeret-system-crayfish-practical-guide-for-dissection-nerve

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.9K vistas.  University of Cologne. Here we describe the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. We also demonstrate an electrophysiological technique to record fictive locomotion from swimmeret motor neurons. 

Video: The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern

Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is planar multielectrode array (MEA) recording. Here we document the use of MEAs to study the mouse vomeronasal organ (VNO), which plays an essential role in the detection of pheromones and social cues via a diverse population of sensory neurons expressing hundreds of types of receptors. Combining MEA recording with a robotic liquid handler to deliver chemical stimuli, the sensory responses of a large and diverse population of neurons can be recorded. The preparation allows us to remove the intact neuroepithelium of the VNO from the mouse and stimulate with a battery of chemicals or potential ligands while monitoring the electrical activity of the neurons for several hours. Therefore, this technique serves as a useful method for assessing ligand activity as well as exploring the properties of receptor neurons. We present the techniques needed to prepare the vomeronasal epithelium, MEA recording, and chemical stimulation.

Multielectrode array (MEA) recordings provide a method for studying the electrical activity of large populations of neurons. Here, we present the details of a MEA preparation to record from the mouse vomeronasal epithelium while simultaneously stimulating the tissue.

Grabaciones multielectrodo matriz del epitelio vomeronasal

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is ...

Investigación

Neurociencias

Physiological Recordings of High and Low Output NMJs on the Crayfish Leg Extensor Muscle

We explain in detail how to expose and conduct electrophysiological recordings of synaptic responses for high (phasic) and low (tonic) output motor neurons innervating the extensor muscle in the walking leg of a crayfish. Distinct differences are present in the physiology and morphology of the phasic and tonic nerve terminals. The tonic axon contains many more mitochondria, enabling it to take a vital stain more intensely than the phasic axon. The tonic terminals have varicosities, and the phasic terminal is filiform. The tonic terminals are low in synaptic efficacy but show dramatic facilitated responses. In contrast, the phasic terminals are high in quantal efficacy but show synaptic depression with high frequency stimulation. The quantal output is measured with a focal macropatch electrode placed directly over the visualized nerve terminals. Both phasic and tonic terminals innervate the same muscle fibers, which suggests that inherent differences in the neurons, rather than differential retrograde feedback from the muscle, account for the morphological and physiological differentiation.

This article demonstrates how to conduct electrophysiological recordings of synaptic responses on the extensor muscle in the walking leg of a crayfish and how the nerve terminals are visualized to show the gross morphological differences of high- and low-output nerve terminals.

Las grabaciones fisiológicas de NMJs de salida de alta y baja en el músculo extensor de piernas cangrejo de río

We explain in detail how to expose and conduct electrophysiological recordings of synaptic responses for high (phasic) and low (tonic) output motor ...

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

Médula Espinal Electrofisiología II: Fabricación de electrodos de aspiración extracelular

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

Preparación Todo el montaje del Adulto Drosophila Cordón nervioso ventral para inyección gigante tinte de fibra

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

Preparación y tejido de fibras inmunotinción ratón nerviosas sensoriales que inervan la piel y los huesos de extremidades

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Un simple de un solo paso para la disección Protocolo Todo el montaje Preparación de adulto<em&gt; Drosophila</emLos cerebros&gt;

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

Visualización del patrón de proyección axonal de las neuronas motrices embrionarias<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Grabación de la plasticidad sináptica en rebanadas Hippocampal agudas mantenidas en un pequeño volumen reciclado - perfusión- y sistema de cámara de tipo inmersión

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

En Vivo Una sola molécula de seguimiento en la Terminal presináptica del nervio Motor del Drosophila

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Where You Cut Matters: A Dissection and Analysis Guide for the Spatial Orientation of the Mouse Retina from Ocular Landmarks

Accurately and reliably identifying spatial orientation of the isolated mouse retina is important for many studies in visual neuroscience, including the analysis of density and size gradients of retinal cell types, the direction tuning of direction-selective ganglion cells, and the examination of topographic degeneration patterns in some retinal diseases. However, there are many different ocular dissection methods reported in the literature that are used to identify and label retinal orientation in the mouse retina. While the method of orientation used in such studies is often overlooked, not reporting how retinal orientation is determined can cause discrepancies in the literature and confusion when attempting to compare data between studies. Superficial ocular landmarks such as corneal burns are commonly used but have recently been shown to be less reliable than deeper landmarks such as the rectus muscles, the choroid fissure, or the s-opsin gradient. Here, we provide a comprehensive guide for the use of deep ocular landmarks to accurately dissect and document the spatial orientation of an isolated mouse retina. We have also compared the effectiveness of two s-opsin antibodies and included a protocol for s-opsin immunohistochemistry. Because orientation of the retina according to the s-opsin gradient requires retinal reconstruction with Retistruct software and rotation with custom code, we have presented the important steps required to use both of these programs. Overall, the goal of this protocol is to deliver a reliable and repeatable set of methods for accurate retinal orientation that is adaptable to most experimental protocols. An overarching goal of this work is to standardize retinal orientation methods for future studies.

This protocol provides a comprehensive dissection and analysis guide for the use of deep ocular landmarks, s-opsin immunohistochemistry, Retistruct, and custom code to accurately and reliably orient the isolated mouse retina in anatomical space.

Donde usted cortar materias: Una disección y guía de análisis para la orientación espacial de la Retina de ratón de hitos Ocular

Accurately and reliably identifying spatial orientation of the isolated mouse retina is important for many studies in visual neuroscience, including the ...