Los autores agradecen al Dr. James Bamburg y miembros de su laboratorio para la colaboración en estos estudios. Este trabajo fue financiado por subvenciones del NIH HD19950, EY07133 y por becas de la Fundación Médica de Minnesota.

Para el etiquetado de rodamina-actina, las neuronas se cultivaron en cubreobjetos de vidrio colocados en la parte inferior de 35 mm platos de plástico, o en cubreobjetos pegado en &quot;video&quot; platos. 1. Preparación de platos Cubreobjetos o &quot;Video&quot; <ol><li> Muchos tipos neuronales son poco adhesivo para sustratos in vitro. Cubreobjetos de vidrio, que son necesarios para este procedimiento, no puede permitir que suficientes neuronas sustrato de adhesión, a menos que hayan sido limpiados adecuadamente y preparado. Un procedimiento detallado para el ácido de lavado y limpieza cubreobjetos de vidrio se describe en el libro El cultivo de las células nerviosas, editado por Banker y Goslin. Por otra parte, una capa de nitrocelulosa para el cubreobjetos, que se une con avidez las moléculas de sustrato, se describe en los pasos 1.7 y 1.8 a continuación. </li><li> Cubreobjetos de vidrio (por ejemplo, 18 plazas mm o 24 mm círculos) se lavan en dH 2 O y cocido en calor seco (≥ 225 ° C) el mayor tiempo posible (mínimo de varios días hasta tres meses o más) para eliminar los restos de materia orgánica compuestos. Vaya al paso 1.6 o para platos de vídeo proceder a 1,3. </li><li> Para crear un substrato fino de vidrio transparente para videomicroscopía alta resolución, agujeros circulares de diámetro apropiado son perforados en el fondo de los 35 o 50 mm Petri de plástico o los platos de cultivo de tejidos utilizando un taladro eléctrico de corcho (o un instrumento similar). La perforación se realiza lentamente con una ligera presión para evitar que se rompa el plástico. Los bordes de la perforación se raspan con una tijera para crear una superficie lisa en ambos lados. </li><li> Cubreobjetos de vidrio se limpian para el uso de cultivo de tejidos, como se describe en 1.1 o 1.2. Cubreobjetos se pegan en el lugar sobre los agujeros, no se usen los tóxicos de cemento acuario de silicona (para cubreobjetos 18x18mm, un poco de 12mm de diámetro se utiliza). El cemento se cura durante 24 horas. </li><li> (Los siguientes pasos se realizan utilizando las condiciones de esterilidad) Los platos de vídeo se lavan 3 veces con agua estéril dH 2 O y se deja secar al aire. </li><li> Cubreobjetos están recubiertas con moléculas de sustrato para el cultivo neuronal. En primer lugar, la superficie está recubierta con cubreobjetos (250 l de 18x18 cubreobjetos) una solución de 100 mg / ml de poli-D-lisina en PBS durante 4-8 horas (o toda la noche) en una incubadora humidificada 38 ° C. Cubreobjetos se enjuagan 3 veces con agua estéril dH 2 O para eliminar consolidados poli-D-lisina y se deja secar al aire. Muchos tipos neuronales cultivadas en cubreobjetos recubiertos con poli-D-lisina a solas, si las proteínas séricas están incluidos en el medio de cultivo. Sin embargo, los resultados más relevantes para las condiciones in vivo se obtienen mediante el uso de moléculas de sustrato natural. Las soluciones de estas moléculas, como la laminina, fibronectina o L1 CAM (1-20 mg / ml en PBS), se pueden aplicar directamente a la poli-D-lisina cubreobjetos recubiertos de 4-8 horas o toda la noche, pero en nuestro laboratorio de rutina cubrir el cubreobjetos preparado con una fina película de nitrocelulosa antes de aplicar las moléculas de adhesión celular para aumentar la proteína de unión al sustrato. </li><li> Prepare una solución de nitrocelulosa 1% en la disolución de 5 g de nitrocelulosa en 5 ml de 100% acetato de amilo. Aplique 10 l de esta solución para el cubreobjetos y suavemente repartidas en la superficie. Deje secar al aire 10 minutos. </li><li> Aplicar 250 l de una solución de 25 mg / ml laminina o 4 mg / mL L1 CAM en PBS y se extendió sobre la superficie de nitrocelulosa. Incubar 4 horas (o toda la noche) en un incubador humidificado 38 ° C, el sustrato aspirado e inmediatamente después, medio de cultivo, por lo que el sustrato no se seque. </li></ol> 2. Preparación de los cultivos neuronales <ol><li> Embrionarias día 7 embriones de pollo se eliminan los huevos y los colocó en 100 mm placas de Petri que contienen medio de cultivo con suero al 10% para la disección para extraer los órganos internos del tórax y el abdomen, utilizando un microscopio estereoscópico. </li><li> Los embriones se enjuagan con el medio y se mudó a un plato de 60 mm con medio líquido y más disección para extraer y preparar los explantes de ganglios de la raíz dorsal (GRD) o los tejidos neurales de retina. Una descripción de la disección detallada se puede encontrar en Métodos en Biología Celular, volumen 71, Neuronas: Métodos y Aplicaciones de la Biología Celular, editado por Hollenbeck y Bamburg. Explantes de DRG son los ganglios y nervios 1/2-whole explantes de retina son de 1 mm de diámetro o menos. </li><li> Después de limpiar los explantes de tejidos extraños, los explantes individuales se mueven con unas pinzas de relojero los cubreobjetos, que ya están en placas de cultivo con medio de cultivo. Bajo un microscopio de disección, el explante se presiona suavemente hacia el centro del cubreobjetos con unas pinzas para evitar el movimiento durante el transporte a la incubadora. Los explantes se cultivaron en medio F12 B27 con aditivos, tamponado con HEPES 10 mM a pH 7,4 y se colocan durante la noche en una incubadora humidificada 38 ° C. Los factores de crecimiento se pueden añadir, según sea necesario, al medio de cultivo. Las neurotrofinas son a menudo añadido a DRG culturas de los antiguos embriones, aunque E7 neuronas DRG se extenderá axones de explantes sin neurotrofinas añadió. Explantes de retina neural se extienden los axones en el medio de cultivo sindding factores de crecimiento. </li><li> Los cultivos se incuban durante al menos 18 horas para permitir crecimiento axonal suficiente antes de iniciar el procedimiento siguiente. </li></ol> 3. Preparación de la permeabilización de amortiguación Rodamina-actina <ol><li> Una solución de reserva de permeabilización de amortiguación que contiene 138 mM KCl, 10 mM TUBOS, 3 mM EGTA, 4 mm de MgCl 2, y 1% de BSA (pH = 6,9) se puede mantener hasta 2 semanas a 4 ° C11. Justo antes de su uso, los componentes se añaden a una concentración final de: 0,025% de saponina, 0,1 mM de ATP, y 100 nM Alexa-flúor 350 phalloidin. </li><li> Una solución por separado es también recién preparada justo antes de su uso con estos mismos componentes más rodamina 0.45μM no actina de músculo La solución se agita y tritrated alternativamente durante 5 minutos para disolver la actina rodamina-grupos, y se agita durante 1 minuto durante el paso de permeabilización inicial para prevenir la polimerización en el tubo. Si a pesar de ello, el montaje del filamento en el tubo sigue siendo un problema, la solución puede ser centrifugadas antes de su uso. </li></ol> 4. Permeabilización de cultivos neuronales y la incorporación de la rodamina-actina en la F-actina Finaliza púas <ol><li> Una placa de cultivo con explantes de DRG o la retina ha sido cuidadosamente retirados de la incubadora y los pasos siguientes se realizan a temperatura ambiente. </li><li> Todos los cambios de las soluciones debe hacerse con cuidado. La punta de la pipeta se debe colocar en el borde del cubreobjetos, y las soluciones deben ser retirados y se añade lentamente y con una fuerza mínima. </li><li> El medio de cultivo se extrae con una pipeta con cuidado, pero sin pausa, y la permeabilización de amortiguación suficiente para cubrir las células se añade durante 1 minuto (para 18mm x 18mm cubreobjetos, ~ 60 l). La cultura no se enjuaga con cualquier otra solución antes de añadir la permeabilización de amortiguación y el cubre no se deja secar antes de añadir la permeabilización de amortiguación. </li><li> La permeabilización de amortiguación se quita suavemente con una pipeta y se sustituye con la permeabilización de amortiguación que contiene 0,45 M rodamina no actina de músculo durante 4 min. </li><li> La rodamina-actina que contiene el tampón se quita suavemente con una pipeta, y las neuronas se fija mediante la adición de una solución de paraformaldehído al 4% (calidad laboratorio, realizados con tampón fosfato, pH 7,3), glutaraldehído al 0,05% y el 10% de sacarosa. Después de la fijación de 5 minutos el cubreobjetos con cuidado son lavadas con PBS, y se montaron en Slowfade en portaobjetos de vidrio de 3 pulgadas. </li><li> Un enfoque alternativo a las soluciones de cambio es el uso de una celda de flujo. Esto puede ser una celda de flujo disponible en el mercado, o una celda de flujo simple se puede hacer mediante la colocación de pequeñas piezas de plástico (≤ 1 mm de espesor) como separadores en las esquinas del cubreobjetos, y luego montar un cubreobjetos de igual tamaño en la parte superior de la cubreobjetos. Las soluciones pueden ser cambiados mediante la colocación de la pipeta a un lado de la celda de flujo y la retirada de las soluciones con una mecha (de algodón o Kimwipe a) en el otro lado. </li><li> La incorporación de la rodamina-actina en la F-actina fines de púas y fluorescentes phalloidin etiquetado de F-actina en los conos de crecimiento se visualiza con epi-fluorescencia óptica a través de un objetivo de inmersión 60X, y las imágenes se recogen, con una cámara CCD enfriado. Un microscopio confocal puede proporcionar mejores imágenes. </li><li> Para un mejor cuantificación de la incorporación de rodamina-actina todas las imágenes se deben recoger en una sola sesión, con la misma ganancia y ajustes de la exposición de la sensibilidad de la cámara digital para cada imagen. Análisis de la etiqueta deberán hacerse en regiones equivalentes de cada imagen; Metamorph, J de la imagen o similares herramientas informáticas para el análisis de imagen se puede utilizar. </li></ol> Variaciones de este procedimiento 5. Una variación: Recoge imágenes de células vivas Antes de etiquetado Rodamina-actina <ol><li> Platos de vídeo se colocan en una platina del microscopio se calentó, y las imágenes en directo cono de crecimiento se recogen. Cubreobjetos cuadrícula se pueden utilizar, o grabados y / o marcas de lápiz sobre el cubreobjetos se puede hacer para encontrar más fácilmente después de células específicas de etiquetado, o el plato de vídeo se puede fijar en su lugar en la platina del microscopio para la duración del procedimiento. </li><li> Permeabilización, la incorporación de rodamina-actina, y la fijación de células se llevan a cabo en el plato de vídeo, ya sea dentro o fuera de la platina del microscopio. Tras la fijación, PBS, se añade a los platos de vídeo para obtener imágenes de inmediato. Para conservar la muestra para obtener imágenes de tarde, media slowfade montaje se añade a la cubreobjetos y un cubreobjetos de igual tamaño, se coloca suavemente en la parte superior (evitando las burbujas), y los bordes son sellados con esmalte transparente. </li></ol> 6. Dos variaciones: inmunoquímica de proteínas etiqueta adicional Co- <ol><li> Rodamina-actina incorporación y fijación puede llevarse a cabo en las neuronas cultivadas en cubreobjetos o en platos de vídeo, como se describió anteriormente (4.2 a 4.4). </li><li> Después de la fijación y lavado en PBS, las células son tratadas 15 min con 0,1 M de glicina en PBS y se extrae con 0,1% Triton X-100 (TX-100) en PBS con suero de cabra 2% y 1% de BSA durante 1 h. Cubreobjetosse incubaron con los anticuerpos primarios diluidos en PBS con 1% BSA durante 1 h. Los cubreobjetos se enjuagan y se incubaron en el 0,1% TX-100 en PBS con suero de cabra 2% y 1% de BSA durante 1 h, antes de aplicar fluorescente secundaria de anticuerpos en la dilución 1:1000 en PBS con BSA al 1% durante 1 h. Después de enjuagar, los cubreobjetos se incuba de nuevo en el 0,1% TX-100 en PBS con suero de cabra al 2% y 1% BSA durante 30 minutos, enjuagar y montar en anti-fading medio. La localización de algunas proteínas se ve interrumpida por el paso de permeabilización inicial (4,3). Para conservar estas proteínas con anticuerpos para la localización, el 0,05% de paraformaldehído y glutaraldehído al 0,05% se puede agregar a la permeabilización de amortiguación durante 1 minuto (es decir, antes de añadir la rodamina-actina), sin afectar el etiquetado final de púas por rodamina-actina. </li><li> Imágenes de los conos de crecimiento de triple etiquetado se recogen mediante microscopía de fluorescencia confocal o. </li></ol> 7. Variación tres: Evaluación de los Efectos de la Cues de orientación sobre la F-actina Finaliza púas gratis <ol><li> Un factor de crecimiento o cue orientación se añade a los platos de la cultura en la incubadora, en concentraciones de varios ng / mL durante unos minutos (o un tiempo de tratamiento apropiado) antes de retirar el plato de la incubadora y el inicio del procedimiento de permeabilización. Esto permite la evaluación de los efectos a corto plazo de los factores de crecimiento o las señales de orientación sobre la F-actina fines de púas libre. </li><li> Un plato de vídeo con cultivos de neuronas puede ser colocado en una platina del microscopio se calentó, y factores de crecimiento o las señales de orientación puede ser liberado de una micropipeta en un gradiente de cerca de un cono de crecimiento antes de comenzar la permeabilización y la incorporación de rodamina-actina. Por ejemplo, el NGF puede ser liberado por las neuronas DRG o netrina de las células ganglionares de la retina neural. La pipeta se pueden introducir para tan corta como 1-2 minutos antes de comenzar el procedimiento de permeabilización. Esto permite la evaluación de los efectos locales de un gradiente de señal de orientación sobre la formación de F-actina extremos libres de púas en los márgenes del cono mayor crecimiento (ver cita de referencia para 10 imágenes). </li><li> Estas variaciones se pueden combinar con mediado por anticuerpos etiquetado de los otros componentes neuronales, como se describe en el apartado 6.2 anterior. </li></ol> 8. Cuatro variación: F-actina Etiquetado extremo libre de púas en las neuronas transfectadas <ol><li> El uso de las construcciones constitutivamente activa o dominante negativo-o una caída de proteínas utilizando RNAi (con un marcador fluorescente de identificación) se puede utilizar para evaluar la participación de una proteína en la regulación de la actina F-termina de púas libre. En función de la proteína, su localización dentro del cono de crecimiento, y si se fusiona con un marcador fluorescente, la proteína fluorescente expresado en las células transfectadas pueden perderse en la permeabilización. Si este es el caso, los platos de vídeo se puede utilizar para identificar una célula transfectada microscopio antes de permeabilización, y la permeabilización se puede realizar en la platina del microscopio, después de marcar las posiciones de las células transfectadas. Por otra parte, una construcción GFP-actina se co-transfectadas con GFP-constructo de interés. En este caso, GFP-actina se incorporarán en la F-actina, y no se pierde por la permeabilización que permita la identificación de las células transfectadas después de permeabilización. </li><li> Esta variación se puede combinar con la adición de las señales de orientación, tal como se describe en el 7,1-7,3 por encima. </li></ol> 9. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Además global de NGF aumenta total de F-actina y la F-actina fines de púas en el borde del cono de crecimiento líder. Cuando un cono de crecimiento DRG se estimula con factor de crecimiento nervioso (NGF) durante 5 minutos, se estimula la polimerización de la actina en el margen principal, y una banda brillante de etiquetado rodamina-actina se ve en la periferia del cono de crecimiento. La Figura 1 compara rodamina-actina incorporación en un cono de DRG crecimiento estimulada y estimulada por un NGF DRG cono de crecimiento. La fluorescencia de color verde en las imágenes fusionadas es etiquetado phalloidin de F-actina en el cono de crecimiento y el rojo rodamina-actina de etiquetado. Un buen control para el etiquetado final de púas es añadir 10-6 M o superior citocalasina B o D en la permeabilización de amortiguación en los pasos 4.2 y 4.3. Citocalasinas tapa F-actina fines de púas e inhibir la rodamina-actina a los fines de púas. Esta grave deben reducir o eliminar la incorporación de la rodamina-actina en la célula. Las barras de escala, 10 micras. <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Un gradiente de NGF aumenta localmente F-actina fines de púas. Una micropipeta que libera NGF se pone a un lado de un cono de crecimiento DRG durante 2 minutos, seguido por el etiquetado de los F-actina extremos libres de púas. Las siguientes imágenes muestran que la exposición a un gradiente de NGF a nivel local estimula un aumento en la F-actina extremos libres de púas en la región del cono de crecimiento más cerca de la pipeta. La imagen combinada muestra phalloidin en verdey rodamina-actina en rojo. Barra de escala, 10 micras. <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Las proteínas activadas MTC se acumulan en el margen de cono de crecimiento importantes. Etiquetado inmunocitoquímico de phospho-Ezrin/Radixin/Moesin (PERM), con F-actina fines de púas libre. Glutaraldehído (0,05%) y paraformaldehído (0,05%) fueron añadidos a la permeabilización de amortiguación inicial de un minuto para preservar la localización del MTC. Rodamina-actina, de color rojo, PERM, verde, phalloidin, azul. Barra de escala, 10 micras. <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. La estimulación de la polimerización de la actina requiere proteínas activas del MTC. GRD disociadas fueron co-transfectadas con GFP-actina y un control de plásmido GFP o una construcción dominante negativa Ezrin / radixina / Moesin (DN ERM). El uso de GFP-actina permite la identificación de las células transfectadas después de permeabilización. Aquí, el NGF se añadió 5 minutos antes de la etiqueta de la F-actina fines de púas. Nota del cono de crecimiento transfectadas con DN MTC ha reducido los niveles de púas en el margen extremo del cono de crecimiento líder (abajo centro), que contrasta con un cono de crecimiento cercanas untransfected (paneles inferiores), o con el control GFP (panel central superior). Rodamina-actina, de color rojo, GFP-actina, de color verde. Las barras de escala, 10 micras.

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Los métodos presentados aquí permiten una resolución temporal y espacial de los componentes celulares que participan en la remodelación dinámica del citoesqueleto de actina en el borde principal de la migración de los conos de crecimiento. La acción de las moléculas de atrayente, como NGF o netrina, para estimular la rápida polimerización de la actina del filamento se revela como un aumento local en los extremos de actina de púas, creado por la ruptura de filamentos de actina por la activación de ADF / cofil...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>18x18 mm coverslip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gold Seal</td>
<td>3305</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35mm Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>351008</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aquarium cement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DAP 100% silicone aquarium sealant</td>
<td>Any hardware store</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-D-lysine (mw &gt; 300,000)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P1024</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Natural mouse laminin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>23017-015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L1 CAM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R &amp; D systems</td>
<td>777-NC</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Alexa-fluor 350 phalloidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Molecular Probes)</td>
<td>A22281</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rhodamine non-muscle actin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cytoskeleton, Inc.</td>
<td>APHR-A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>F12 Culture medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>21700-075</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B27</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Slowfade </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>536937</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

labeling f-actin barbed ends with rhodamine-actin in permeabilized neuronal growth cones

Las puntas móviles de los axones en crecimiento se llaman los conos de crecimiento. Los conos de crecimiento llevan navegando a través de los axones tejidos en desarrollo mediante la interacción con las señales a nivel local expresó su orientación molecular que se unen a los receptores de cono de crecimiento y regular la dinámica y la organización del citoesqueleto de crecimiento de 6.3 cono. El objetivo principal de estas señales de navegación es la malla de filamentos de actina que llena la periferia del cono de crecimiento y que el crecimiento de las unidades de la motilidad del cono a través de polimerización de la actina y la remodelación continua dinámica 7. Señales de orientación positiva o atractivo inducir cono de crecimiento de inflexión mediante la estimulación de filamentos de actina (F-actina) de polimerización en la región de la periferia del cono de crecimiento que está más cerca de la fuente de la señal atrayente. Esta polimerización de la actina unidades cono de crecimiento local saliente, la adhesión del margen de líderes y la elongación axonal hacia el atrayente. Polimerización de la actina del filamento depende de la disponibilidad de monómero de actina suficiente y en los núcleos de polimerización de filamentos de actina o los extremos de púas para la adición de monómero. Actina monómero está disponible en abundancia en el ganglio de la raíz de pollo y la retina dorsal (GRD) los conos de crecimiento. En consecuencia, la polimerización se incrementa rápidamente cuando es libre F-actina fines de púas que se disponga para la adición de monómeros. Esto ocurre en el pollo y los conos de la retina DRG crecimiento a través de la activación local de la actina cortar la F-actina proteína de factor de despolimerización (ADF / cofilina) en la región del cono de crecimiento cercano a un 80-10 atrayente. Este incremento de la ADF / cofilina actividad rompe los filamentos de actina para crear nuevos F-actina fines de púas para la polimerización. El método siguiente se muestra este mecanismo. Contenido total de F-actina se visualizaron por tinción con phalloidin fluorescente. F-actina fines de púas son visualizados por la incorporación de la rodamina-actina dentro de los conos de crecimiento que se permeabilized con el procedimiento descrito en el siguiente, que es una adaptación de los estudios previos de otras células móviles 11, 12. Cuando rodamina-actina se añade a una concentración por encima de la concentración crítica para la adición de monómeros de actina a los fines de púas, rodamina-actina reúne a los extremos libres de púas. Si la señal atractiva se presenta en una pendiente, como la de ser liberado de una micropipeta colocada a un lado de un cono de crecimiento, la incorporación de la rodamina-actina en la F-actina fines de púas será mayor en el lado del cono de crecimiento hacia la micropipeta 10 . Los conos de crecimiento son las estructuras celulares pequeños y delicados. Los procedimientos de permeabilización, rodamina-actina incorporación, la fijación y la visualización de fluorescencia son cuidadosamente hecho y puede llevarse a cabo en el escenario de un microscopio invertido. Estos métodos pueden ser aplicados al estudio de polimerización de la actina en las neuronas migratorias locales, otras células de los tejidos primarios o líneas celulares.

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Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

Un método para visualizar y cuantificar la F-actina fines de púas en los conos de crecimiento neuronal se describe. Después de las neuronas de cultivo en cubreobjetos de vidrio, las células se permeabilized con una solución de saponina que contiene. A continuación, un corto de incubación con el tampón de saponina que contiene rodamina-actina incorpora actina fluorescente en los extremos de actina de púas libre.

Etiquetado de la F-actina Finaliza púas con Rodamina-actina en permeabilizadas Conos de Crecimiento Neuronal

The motile tips of growing axons are called growth cones. Growth cones lead navigating axons through developing tissues by interacting with locally ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.7K vistas.  University of Minnesota. Un método para visualizar y cuantificar la F-actina fines de púas en los conos de crecimiento neuronal se describe. Después de las neuronas de cultivo en cubreobjetos de vidrio, las células se permeabilized con una solución de saponina que contiene. A continuación, un corto de incubación con el tampón de saponina que contiene rodamina-actina incorpora actina fluorescente en los extremos de actina de púas libre.

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DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

Etiquetado DiOLISTIC de las neuronas de los roedores y no humanos rodajas de cerebro de los primates

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Investigación

Neurociencias

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

Derivación eficiente de los Derechos Humanos progenitores neuronales y neuronas de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Recording Large-scale Neuronal Ensembles with Silicon Probes in the Anesthetized Rat

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of behaviors from the spiking activity of its neurons. One of the most effective methods to monitor spiking activity from a large number of neurons in multiple local neuronal circuits simultaneously is by using silicon electrode arrays1-3.
Action potentials produce large transmembrane voltage changes in the vicinity of cell somata. These output signals can be measured by placing a conductor in close proximity of a neuron. If there are many active (spiking) neurons in the vicinity of the tip, the electrode records combined signal from all of them, where contribution of a single neuron is weighted by its 'electrical distance'. Silicon probes are ideal recording electrodes to monitor multiple neurons because of a large number of recording sites (+64) and a small volume. Furthermore, multiple sites can be arranged over a distance of millimeters, thus allowing for the simultaneous recordings of neuronal activity in the various cortical layers or in multiple cortical columns (Fig. 1). Importantly, the geometrically precise distribution of the recording sites also allows for the determination of the spatial relationship of the isolated single neurons4. Here, we describe an acute, large-scale neuronal recording from the left and right forelimb somatosensory cortex simultaneously in an anesthetized rat with silicon probes (Fig. 2).

Extracellular recordings of neuronal activity using silicon probes in the anesthetized rat will be described. This technique allows information to be obtained across multiple brain areas from more than 100 neurons simultaneously. It provides information with single cell resolution about neuronal ensembles dynamics in multiple local circuits.

Grabación a gran escala conjuntos neuronales con sondas de silicona en la rata anestesiada

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Marcaje fluorescente retrógrada Permite dirigida extracelular sola unidad de grabación de neuronas identificadas<em&gt; En vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dos registros electrofisiológicos de sinápticamente respuestas evocadas neuronal y astroglial en agudas rodajas de hipocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Fast Micro-iontoforesis de glutamato y GABA: una herramienta útil para investigar la integración sináptica

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Etiquetado retrógrada de células ganglionares retinianas en adultos de pez cebra con tintes fluorescentes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms can be used to investigate a variety of questions, spanning developmental and functional neurobiology to infection and disease propagation. However, conventional systems require significant cellular inputs (many thousands per compartment), inadequate for studying low abundance cells, such as primary dopaminergic substantia nigra, spiral ganglia, and Drosophilia melanogaster neurons, and impractical for high throughput experimentation. The dense cultures are also highly locally entangled, with few outgrowths (&#60;10%) interconnecting the two cultures. In this paper straightforward microfluidic and patterning protocols are described which address these challenges: (i) a microfluidic single neuron arraying method, and (ii) a water masking method for plasma patterning biomaterial coatings to register neurons and promote outgrowth between compartments. Minimalistic neuronal co-cultures were prepared with high-level (&#62;85%) intercompartment connectivity and can be used for high throughput neurobiology experiments with single cell precision.

Protocols for single neuron microfluidic arraying and water masking for the in-chip plasma patterning of biomaterial coatings are described. Highly interconnected co-cultures can be prepared using minimal cell inputs.

Preparación de Neuronales Co-culturas con precisión Single Cell

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

La inducción de la plasticidad de astrocítico Receptores por manipulación de Neuronales cocción Precios

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich structures suggest alterations in synaptic integrity and connectivity. Here we provide a detailed protocol for culturing primary rat cortical neurons, Phalloidin staining for F-actin puncta, and subsequent quantification techniques. First, the frontal cortex of E18 rat embryos are dissociated into low-density cell culture, then the neurons grown in vitro for at least 12-14 days. Following experimental treatment, the cortical neurons are stained with AlexaFluor 488 Phalloidin (to label the dendritic F-actin puncta) and microtubule-associated protein 2 (MAP2; to validate the neuronal cells and dendritic integrity). Finally, specialized software is used to analyze and quantify randomly selected neuronal dendrites. F-actin rich structures are identified on second order dendritic branches (length range 25-75 &#181;m) with continuous MAP2 immunofluorescence. The protocol presented here will be a useful method for investigating changes in dendritic synapse structures subsequent to experimental treatments.

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

La cuantificación de la actina filamentosa (F-actina) puntos lagrimales en las neuronas corticales de rata

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...