This work has been supported by NINDS, RO1NS52699 and MH84874 to SA. 
We would like to thank Dr. Dave Featherstone (Department of Biological Sciences, University for Illinois at Chicago) for providing us with the suture glue used in the immunohistochemistry work. We thank Michael Alpert for his comments and proofreading of the manuscript.

1. Preparación de poli-D-lisina bromhidrato <ol><li> Preparar bromhidrato de poli-D-lisina 1 mg / ml en tampón borato 0,1 M (pH 8,5). </li><li> Alícuota y almacenar a -20 ° C. </li></ol> Recubrimiento 2. poli-lisina de Cubreobjetos Nota: Llevar a cabo todos los pasos de limpieza y revestimiento en una cámara de flujo laminar. <ol><li> Coloque los portaobjetos en una placa de Petri que contiene 1 N de ácido clorhídrico (HCl) durante 2 horas. </li><li> Aspire todo el HCl y enjuague con un 70% de etanol (EtOH) 2-3 veces. </li><li> Deja en EtOH al 70% durante 1 hora. </li><li> Aspire todo el EtOH al 70% y enjuague con EtOH al 100% 2-3x. </li><li> Deja en EtOH al 100% durante 2 horas. Aspirar todo EtOH. </li><li> Secar con papel de filtro y secar al aire durante unos pocos segundos. </li><li> Lugar O N en 1 mg solución poli-lisina / / ml. </li><li> Enjuague cubreobjetos día siguiente con 4-5x agua Millipore. </li><li> Aire seco poli-lisina recubierto cubreobjetos sobre rodillos de cristal en una placa de Petri limpia. </li><li> Para immunohistochemistry, utilizar 35 x 10 mm de Petri tapas de los recipientes. Preparar Sylgard (polydimethylsilioxane, PDMS) forrado platos vertiendo PDMS (elastómero y agente de curado de 10: 1 en peso) en el plato con un grosor de 0,3 cm y permita que se asiente en el 30 ° CO / N. Una vez que esto se ha puesto, cortar unos 2 cm por 1 cm emplazada en el PDMS. Limpiar y recubrir la inserción con poli-lisina siguiendo los mismos pasos como se mencionó anteriormente para cubreobjetos. </li><li> Tienda cubreobjetos y platos recubiertos de poli-lisina cubiertos dentro de la cámara de flujo laminar hasta su uso (hasta 2 semanas, pero lograr mejores resultados mediante la preparación de adhesivos periódicamente cada 3-4 días). </li><li> Preparar un bloque PDMS, al pin de la médula espinal en la máquina de cortar el tejido que vibra. Mix Elastómero A y B Elastómero 1: 1 en peso. Vierta la mezcla en un plato 100 x 15 mm de Petri y permita que se asiente O / N a 30 ° C. Corte un pedazo rectangular de los PMDS y péguelo en la placa base de corte utilizando pegamento epóxico. Deje que el pegamento se seque la fijación de los PDMS en lugar y cortar varias secciones delgadas de la superficie para obtener un pisosuperficie a la clavija del tejido en. </li></ol> 3. aguda disociación de la lamprea de la médula espinal al rendimiento aislado axones reticuloespinal <ol><li> Anestesiar a un ammoecoete o adulto lamprea (Petromyzon marinus) con metanosulfonato tricaína (MS-222, 100 mg / L). Añadir anestésico en el agua, en un vaso de plástico cubierto por una tapa, que contiene la lamprea para ser sacrificado. </li><li> Decapitar lamprea en frío (4 ° C) solución de Ringer de la siguiente composición (en mM): 130 NaCl, 2,1 KCl, 2,6 CaCl 2, 1,8 MgCl 2, 4 HEPES, 4 de dextrosa (pH 7,6, osmolaridad 270 mOsm) y retirar el cuerpo músculos de la pared para exponer la superficie dorsal de la médula espinal. </li><li> Eliminar meninge primitiva de la superficie dorsal de la médula espinal utilizando unas pinzas finas. No retire primitiva meninge ventral en esta etapa. </li><li> Cortar la médula espinal en trozos de 1 cm de largo. </li><li> Pin un pedazo de la médula espinal con alfileres de insectos finas, frente a lado dorsal hacia arriba, sobre un PDMS forrado rebanar pla de baseTE (véase 2.12) en una cámara de la máquina de cortar tejido vibrante que contiene la solución de Ringer enfriada con hielo. </li><li> Eliminar una sección central de la columna dorsal de la médula espinal por corte a lo largo del eje rostro-caudal con la hoja, dejando tras de secciones de columna dorsal intactos en el rostral y caudal termina para servir como asas durante el proceso de disociación Figura 2a y la Figura 2b. Use ajuste de velocidad más lenta que permite cortar y un ajuste de la profundidad que elimina sólo la columna de la dorsal dejando la columna subyacente axón reticulospinal Figura 2b sin daños. </li><li> Incubar en rodajas piezas de la médula espinal a ta durante 45 min en un cóctel de 1 mg / ml de proteasa (Tipo XIV de Streptomyces griseus) y 1 mg / ml de colagenasa preparado (Tipo IA de Clostridium histolyticum) en solución de Ringer (adaptado de El Manira y Bussières , 1997 17). </li><li> Piezas de la médula espinal tratados con enzimas Pin utilizando pasadores finos en una placa de Petri de PDMS se alinearon contanando frío (4 ° C) solución de Ringer. </li><li> Retire primitiva meninge ventral con unas pinzas finas. </li><li> Cortar secciones laterales de la médula espinal con una hoja de bisturí en el punto medio de la sección dorsal rodajas de salir de la columna central de los axones intactos reticulospinales en la médula espinal Figura 2d. </li><li> Ponga una gota de aceite de inmersión en el objetivo. </li><li> Coloque el cubreobjetos poli-lisina recubierto (Figura 3a, la pieza superior, un rectángulo rojo) en la ranura de la cámara de grabación de la figura 3 y aplicar grasa de vacío para todos los bordes (espacio entre los rectángulos rojos y azules en la Figura 3a, para facilitar un sello. Tornillo la parte superior en su lugar. Coloque la cámara en la inserción en el equipo de grabación. </li><li> Añadir la solución de Ringer en la cámara de grabación usando una pipeta Pasteur. </li><li> Conectar la tubería de salida de la botella de presión que contiene solución anticongelante a la tubería de entrada del dispositivo de refrigeración termoeléctrica. Conecte el caliut tubo del dispositivo de refrigeración termoeléctrica al extremo de entrada de la camisa de refrigeración exterior y el extremo de salida al depósito de la Figura 3b. </li><li> Colocar una pieza de la médula espinal a la vez en la cámara de grabación y separar suavemente la médula espinal mantener a lo largo del cubreobjetos en todo momento utilizando fórceps recubiertos de teflón hasta que los axones están aislados Figura 2e y la figura 2f. </li><li> Llevar la temperatura de la solución de grabación a 10 ° C haciendo pasar la (gas nitrógeno es empujado dentro de la botella) presurizado solución anticongelante (por el desplazamiento), a través del dispositivo de refrigeración termoeléctrica, a través de la camisa de refrigeración externa de la cámara de grabación de la figura 3b. </li><li> Permitir que los axones se recuperen para el post disociación de 1 hora a 10 ° C. </li></ol><img alt="Figura 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51925/51925fig2highres.jpg" width="400" /> <strong&gt; Figura 2. descripción esquemática de disociación de protocolo para el aislamiento de los axones reticulospinal. (A) La eliminación de la columna dorsal. La flecha indica la dirección de corte del tejido. Los cuernos dorsales están marcados por el alfabeto D (color fuente roja), mientras que los cuernos ventrales por el alfabeto V (color de fuente rojo). (B) de la columna dorsal retira en la porción central de la médula espinal exponer los axones reticulospinales (líneas verdes ). Los cuernos ventrales, que permanecen intactos después del proceso de corte, están marcados por el alfabeto V (color de fuente rojo). (C) tratamiento de 45 minutos con la proteasa y enzimas colagenasa cocktail (1 mg / ml). (D) El corte de vías laterales de la médula espinal; que indica la posición, dirección y extensión de corte lateral. (e) disociación mecánica de la médula espinal. Las flechas indican la posición de fórceps y dirección de la fuerza de separación durante la disociación. (F) Representatihe ejemplo de preparación axón reticuloespinal disociado. Las flechas verdes marcan las regiones de axones reticulospinal agudamente disociado sin ningún proceso de post-sinápticas. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51925/51925fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. esquemática de cámara para experimentos de electrofisiología grabación. Dimensiones proporcionadas están en pulgadas. Rectángulo rojo muestra en el diagrama basepiece (a) indica el posicionamiento de cubreobjetos en la ranura cubreobjetos en el basepiece. La región entre el rectángulo rojo y azul, que se muestra en el diagrama basepiece (a) es donde se aplica la grasa de alto vacío. (B) muestra la cámara de grabación montado. 4. etiquetado y la identificación de los terminales presinápticos con FM 1-43 <ol><li> Etiquetar las terminales presinápticas, mediante la incorporación de FM 1-43 en vesicles durante sináptica exo-endocitosis durante la escuela K + despolarización. Perfundir preparación con 5 M FM 1-43 (en solución 5 ml de Ringer que contiene 30 mM KCl). </li><li> Perfundir preparación con 1 mg / ml ADVASEP-7 (en solución de Ringer 5 ml) para eliminar el exceso de colorante FM) 18. </li><li> Perfundir preparación con solución de Ringer durante 15 min al lavado por cualquier colorante Remant y la ADVASEP. </li><li> Imagen con 100 X lente de inmersión en aceite (NA 1,25) en un microscopio de fluorescencia invertido, en conjunción con una cámara CCD digital y la adquisición de imágenes micromanager software, utilizando protocolos de formación de imágenes de fluorescencia estándar. </li><li> Identificar los terminales presinápticos marcados con fluorescencia para apuntar para la grabación de la figura 4c y 4d Figura. </li></ol> 5. inmunohistoquímica de aislados axones reticuloespinal <ol><li> Rellene inserción plato (sección Protocolo 2.10.) Con divalente-ion (Ca 2 + y Mg 2 +) libreSolución de Ringer. </li><li> Fabrique pipetas de parche en un extractor micropipeta P-87. Colocar una pequeña cantidad de pegamento de sutura en un extremo de la inserción de poli-lisina utilizando una pipeta de parche (1,5 mm de vidrio de diámetro exterior) y de aspiración (usando un tubo de silicona 0,89 mm de diámetro interior con una punta de micropipeta unido al extremo de succión). </li><li> Realizar disociaciones utilizando el mismo procedimiento que se menciona en la sección de protocolo 3 Figura 2. Coloque un extremo de la médula espinal en la cola de sutura y presione suavemente con unas pinzas para adherirse fuertemente a la superficie. Coloque otra gota de pegamento de sutura en el otro extremo de la inserción y estirar suavemente la médula espinal hasta que se disocian los axones y adherir el extremo libre de la médula espinal arrastrándolo suavemente sobre el pegamento de sutura. Fijar en su lugar por prensado suave hacia abajo con las pinzas. </li><li> Divalente libre intercambio solución de Ringer con solución de Ringer normal por perfusión. </li><li> Permitir que los axones se recuperen para el post dissoc 20 miniation a 10 ° C. </li><li> Fijar los axones disociadas en 4% de paraformaldehído (PFA) {preparado en tampón fosfato salino (PBS, (mM) NaCl 137, KCl 2,7, Na 2 HPO 4 10, KH 2 PO 4 1,8, pH 7,4)} durante 20 min. Filtra solución de PFA antes de su uso mediante el paso a través de un filtro de jeringa de 0,2 mM. </li><li> Lave la PFA perfundiendo glicina 0,1 M (en PBS) durante 10 min. </li><li> Incubar en 0,1% de Triton-X (en PBS) durante 10 min. </li><li> Lavar por perfusión PBS durante 20 min. </li><li> Se bloquea con leche desnatada al 5% (en PBS) durante 6 horas a 4 ° C. </li><li> Añadir en el anticuerpo primario a VGCC de interés (dilución 1: 200 en PBS) y se incuba durante 20 horas a 4 ° C. </li><li> Lavar por perfusión PBS durante 20 min. </li><li> Bloquear con leche desnatada al 5% (en PBS) durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Añadir en anticuerpo secundario (dilución 1: 400 en PBS) y se incuba en la oscuridad durante 2 horas a 4 ° C. </li><li> Lavar por perfusión con PBS durante 20 min. </li><li> Bloque con 1% de suero bovino Albumin (en PBS) durante 20 min. </li><li> Añadir en Alexa Fluor 488 faloidina (5 unidades / l concentración de trabajo; de stock preparada en metanol 200 Unidades / ml). </li><li> Lavar por perfusión con PBS durante 20 min. </li><li> Image usando lente de inmersión 100X agua en el microscopio confocal. </li></ol> 6. electrofisiológico de grabación <ol><li> Fabrique pipetas de parche de vidrio de aluminosilicato (resistencia pipeta 2-5 mW) en un extractor de micropipeta P-87. Diseño parche pipeta de tal manera que la punta de pipeta abarca toda diámetro terminal presináptica. </li><li> PDMS pipetas de parche capa por inmersión de la pipeta de parche bajo presión de 50-60 psi en PDMS 23 (adjuntar un tubo de silicona, 0,89 mm de diámetro interior, conectado a un cilindro de gas nitrógeno, a la parte de atrás de la pipeta de parche) y secar usando un calor arma. Alternativamente, la capa manualmente la pipeta con PDMS, la aplicación de recubrimiento tan cerca de la punta como sea posible, bajo un microscopio compuesto. </li><li> Fuego pipetas parche pulido utilizando un microforge (un filamento de platino a la medida montado sobre la platina de un microscopio compuesto). </li><li> Identificar los axones aislados que demuestran terminales presinápticos marcados por microscopía de fluorescencia. </li><li> Llenar solución de grabación (diseñado para aislar Ca 2 + corrientes; 10 mM CaCl 2 o 90 mM BaCl 2 como portador de carga, tamponada de HEPES pH 7,6, osmolaridad 270 mOsm) en el parche pipeta usando una jeringa. </li><li> Inserte parche pipeta en el soporte de la pipeta y posición por encima del baño usando un manipulador motorizado MP225. Baje suavemente la pipeta parche en el baño y la posición contra la cara de un terminal presináptica fluorescente identificado. </li><li> Avance el parche pipeta lentamente hasta que se haga contacto con la membrana. En este punto, lograr un sellado gigaohmio por succión la boca suave a través de un tubo conectado a la titular de la pipeta. </li><li> Para alcanzar el fondo extremadamente bajos niveles de ruido requeridos para el registro de un solo canal de Ca 2 + corrientes, utilice una Axopatch 200B con un cabezal de la platina se enfrió durante las grabaciones. Datos de la muestra de 20 a 50 kHz y el filtro utilizando un filtro de Bessel 5 kHz. Llevar a cabo la adquisición de datos utilizando un AxoGraph X. </li><li> Utilice un protocolo estándar para escaleras, en incrementos de 10 mV como estímulo. Incorporar un pre-pulso en el protocolo, el protocolo anterior etapa, para asegurar la activación máxima de los canales de Ca 2 +. Incorporar una mV paso 10 fugas en el protocolo de paso para un análisis posterior sustracción de corrientes de fuga. </li></ol>

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	<li>Katz, B., Miledi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+timing+of+calcium+action+during+neuromuscular+transmission.">The timing of calcium action during neuromuscular transmission.</a> Journal of Physiology. 189 (3), 535-544 (1967).</li><li>Sabatini, B. L., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+neurotransmission+at+fast+synapses+in+the+mammalian+brain.">Timing of neurotransmission at fast synapses in the mammalian brain.</a> Nature. 384 (6605), 170-172 (1996).</li><li>Augustine, G. J., Adler, E. M., Charlton, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+calcium+signal+for+transmitter+secretion+from+presynaptic+nerve+terminals.">The calcium signal for transmitter secretion from presynaptic nerve terminals.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 635, 365-381 (1991).</li><li>Zucker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+transmitter+release.">Calcium and transmitter release.</a> Journal of Physiology Paris. 87 (1), 25-36 (1993).</li><li>Delaney, K. R., Shahrezaei, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncaging+Calcium+in+Neurons.">Uncaging Calcium in Neurons.</a> Cold Spring Harbor protocols. (12), (2013).</li><li>Paradiso, K., Wu, W., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+patch+clamp+capacitance+recordings+from+the+calyx.">Methods for patch clamp capacitance recordings from the calyx.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 244 (2007).</li><li>Stanley, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+calyx-type+synapse+of+the+chick+ciliary+ganglion+as+a+model+of+fast+cholinergic+transmission.">The calyx-type synapse of the chick ciliary ganglion as a model of fast cholinergic transmission.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 70, S73-S77 (1992).</li><li>Church, P. J., Stanley, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+L+type+calcium+channel+conductance+with+physiological+levels+of+calcium+in+chick+ciliary+ganglion+neurons.">Single L type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons.</a> The Journal of Physiology. 496 (Pt 1), 59-68 (1996).</li><li>Stanley, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+calcium+channels+and+acetylcholine+release+at+a+presynaptic+nerve+terminal.">Single calcium channels and acetylcholine release at a presynaptic nerve terminal.</a> Neuron. 11 (6), 1007-1011 (1993).</li><li>Weber, A. M., Wong, F. K., Tufford, A. R., Schlichter, L. C., Matveev, V., Stanley, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-type+Ca(2+)+channels+carry+the+largest+current+implications+for+nanodomains+and+transmitter+release.">N-type Ca(2+) channels carry the largest current implications for nanodomains and transmitter release.</a> Nature Neuroscience. 13 (11), 1348-1350 (2010).</li><li>He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+fusion+pore+opening+revealed+by+cell+attached+recordings+at+a+synapse.">Two modes of fusion pore opening revealed by cell attached recordings at a synapse.</a> Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).</li><li>Sheng, J., He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channel+number+critically+influences+synaptic+strength+and+plasticity+at+the+active+zone.">Calcium channel number critically influences synaptic strength and plasticity at the active zone.</a> Nature Neuroscience. 15 (7), 998-1006 (2012).</li><li>Photowala, H., Freed, R., Alford, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+and+function+of+vesicle+clusters,+active+zones+and+Ca2++channels+in+the+lamprey+presynaptic+terminal.">Location and function of vesicle clusters, active zones and Ca2+ channels in the lamprey presynaptic terminal.</a> The Journal of Physiology. 569. 569 (Pt 1), 119-135 (2005).</li><li>Rovainen, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+interactions+of+reticulospinal+neurons+and+nerve+cells+in+the+spinal+cord+of+the+sea+lamprey.">Synaptic interactions of reticulospinal neurons and nerve cells in the spinal cord of the sea lamprey.</a> Journal of Comparative Neurology. 154 (2), 207-223 (1974).</li><li>Takahashi, M., Freed, R., Blackmer, T., Alford, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+influx+independent+depression+of+transmitter+release+by+5+HT+at+lamprey+spinal+cord+synapses.">Calcium influx independent depression of transmitter release by 5 HT at lamprey spinal cord synapses.</a> The Journal of Physiology. 532 (2), 323-336 (2001).</li><li>Stanley, E. F., Goping, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+calcium+current+in+a+vertebrate+cholinergic+presynaptic+nerve+terminal.">Characterization of a calcium current in a vertebrate cholinergic presynaptic nerve terminal.</a> The Journal of Neuroscience. 11 (4), 985-993 (1991).</li><li>El Manira, A., Bussi&#232;res, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channel+subtypes+in+lamprey+sensory+and+motor+neurons.">Calcium channel subtypes in lamprey sensory and motor neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 78 (3), 1334-1340 (1997).</li><li>Kay, A. R., Alfonso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+synaptic+activity+in+intact+brain+and+slices+with+FM1+43+in+C+elegans+lamprey+and+rat.">Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1 43 in C elegans lamprey and rat.</a> 24 (4), 809-817 (1999).</li><li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255 (5041), 200-203 (1992).</li><li>Bleckert, A., Photowala, H., Alford, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+pools+of+actin+at+presynaptic+terminals.">Dual pools of actin at presynaptic terminals.</a> Journal of Neurophysiology. 107 (12), 3479-3492 (2012).</li><li>Gustafsson, J. S., Birinyi, A., Crum, J., Ellisman, M., Brodin, L., Shupliakov, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+organization+of+lamprey+reticulospinal+synapses+in+three+dimensions.">Ultrastructural organization of lamprey reticulospinal synapses in three dimensions.</a> The Journal of Comparative Neurology. 450 (2), 167-182 (2002).</li><li>Broadie, K., Featherstone, D. E., Chen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+Recording+in+the+Drosophila+Embryo.">Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li><li>Rae, J. L., Levis, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+exceptionally+low+noise+single+channel+recordings.">A method for exceptionally low noise single channel recordings.</a> Pfl&#252;gers Archiv European Journal of Physiology. 420 (5-6), 618-620 (1992).</li></ol>

The authors do not have any competing financial interests or other conflicts of interest to disclose.

Nuestro protocolo de disociación es significativa al ceder axones reticulospinal aislados y fuera de postsináptica proyecciones Figura 2f, pero que sin embargo conservan funcional presináptica terminales Figura 4c y 4d Figura. La ausencia de procesos de post-sinápticas se oponen a la terminal presináptica permite el acceso directo a la grabación de la membrana cara liberación presináptica en las terminales presinápticas individuales, antes no era posible en las...

La transmisión sináptica es un proceso extremadamente rápido y preciso. Acción potencial invasión de la terminal presináptica conduce a la apertura de VGCCs situados en la membrana cara liberación, el aumento resultante en presináptica Ca 2 + que actúa como el disparador para la fusión de vesículas y liberación de neurotransmisores 1. Todos estos pasos se dan dentro de cientos de microsegundos 2, y por lo tanto requieren de acoplamiento espacial estricto de VGCCs a la maquinaria de la fusión de vesículas 3. Presináptica Ca 2 + flujos se han caracterizado principalmente por medio de imágenes enfoques usando colorantes sensibles al Ca 2 + 4. La incorporación de Ca 2 + tampones que modulan Ca2 + en las neuronas presinápticas se ha utilizado para caracterizar indirectamente la relación entre el calcio y la neurotransmisión presináptica 3. Además, la modulación de la presináptica libre de Ca 2 + de concentración por uncaging Ca 2 + 5 o grabar macroscopic Ca 2 + corrientes se han usado en conjunción con medidas de la fusión de vesículas y / o liberación; tales como medidas de capacitancia 6 o postsináptica respuestas 2 para abordar la misma cuestión. Sin embargo, la caracterización de Ca 2 + corrientes directamente en la cara de la liberación, la sección especializada de la membrana presináptica, donde despolarización de la membrana se traduce en Ca 2 + corrientes desencadenan la fusión de vesículas sinápticas y la liberación de neurotransmisores, es esencial para obtener una medida precisa de la Ca 2 + requisito para la fusión de la vesícula sináptica. Además, la capacidad para caracterizar directamente Ca 2 + corrientes en los terminales presinápticos individuales, junto con mediciones simultáneas precisas de la fusión de vesículas y liberación permite una elucidación precisa de la relación de temporización entre el transcurso de tiempo del potencial de acción, presináptica Ca 2 + actual, la fusión de vesículas y la liberación. El acceso a la membrana de liberación carano está disponible en la mayoría de los terminales presinápticos debido a la estrecha aposición por las dendritas postsinápticas. Esta inaccesibilidad ha sido un obstáculo importante en la caracterización de VGCCs ya que impide las mediciones directas de la corriente en las terminales presinápticas individuales. Caracterización directa de presináptica Ca 2 + corrientes en las terminales presinápticas individuales hasta el momento no ha sido posible en las sinapsis centrales y sólo se ha logrado en dos terminales presinápticas tipo cálices; tipo cáliz sinapsis del ganglio ciliar de pollo de 7-10 y de rata cálices 11,12. En todos los otros terminales presinápticas incluyendo la sinapsis reticulospinal gigante en la lamprea de la médula espinal 13, la falta de acceso a la membrana cara liberación presináptica ha hecho necesario el uso de enfoques indirectos tales como Ca 2 + de imágenes para estudiar presináptica Ca 2 + flujos. <img alt="Figura 1" fo: contenido-width = src &quot;5in&quot; = &quot;/ files / ftp_upload / 51925 / 51925fig1highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figura sinapsis reticulospinal gigante. (A) Sección 1.-Lamprea de lamprea médula espinal que indica la orientación dorso-ventral. Reticuloespinal axones están marcados con el asterisco verde. (B) la reconstrucción 3-D de la sinapsis reticuloespinal en la lamprea de la médula espinal que muestra presináptica del axón reticuloespinal hacer numerosos contactos en passant (marcado por flechas verdes) en la neurona postsináptica 13. Terminales presinápticas han sido etiquetados con Alexa Fluor 488 hidrazida conjugado faloidina (verde), mientras que la neurona postsináptica se ha llenado con Alexa Fluor 568 hidrazida (rojo). Axones gigantes reticulospinales lamprea, ubicadas en la región ventral de la médula espinal en paralelo a la rostral-caudal eje Figura 1a, la forma múltiple en passant contactos sinápticos en neuronas de laasta ventral de la médula 14 Figura 1b 13. De células enteras macroscópica Ca 2 + corrientes han sido registrados en los axones reticulospinales en la médula espinal intacta 13,15. Sin embargo, los intentos anteriores ciegos en la medición directa de Ca 2 + corrientes en los axones reticulospinales en la lamprea intacta la médula espinal usando técnica de patch clamp de células inscritos han tenido éxito 13 debido a la falta de acceso a la membrana cara liberación presináptica debido a los procesos postsinápticos opuestas la Figura 1b. La membrana cara liberación ha sido previamente hecho accesible por la eliminación de la neurona postsináptica 11, perturbación mecánica de la sinapsis antes de grabar 12 o el tratamiento enzimático junto con disociación mecánica 16. Dada la compleja organización de la médula espinal, que resultaría extremadamente difícil identificar la neurona postsináptica y retraer mecánicamente o perturbar ªe sinapsis. Por lo tanto, hemos decidido utilizar el tratamiento enzimático 17 seguido por disociación mecánica. Con este enfoque, hemos desarrollado una preparación agudamente disociado de la lamprea de la médula espinal que produce viables axones reticulospinal aislados con terminales presinápticas funcionales carentes de cualquier proceso de post-sinápticos, proporcionando así un acceso sin restricciones a las terminales presinápticas individuales. En conjunto con un microscopio invertido y estándar de imágenes de fluorescencia, que nos permite identificar y seleccionar los terminales presinápticos con fluorescencia identificado individuales, con una pipeta de parche que contiene una solución de grabación que aísla Ca 2 + corrientes 4c figura y la figura 4d, para la grabación con base celular técnica de fijación de voltaje adjunta. Ca 2 + corrientes se han registrado directamente en la membrana cara liberación presináptica de los terminales presinápticos individuo Figura 4f. Esta es una SIGNIFICAnt avance en el campo de la transmisión sináptica, ya que es la primera grabación que se llevó a cabo en las sinapsis centrales.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="713">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:211px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td style="width:211px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLGV004SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">22x60 mm coverslips</td>
			<td style="width:211px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12545J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Advasep-7</td>
			<td style="width:211px;">Cydex Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:119px;">ADV7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A21070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Antifreeze</td>
			<td style="width:211px;">Prestone</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Boric acid</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Bright field light source</td>
			<td style="width:211px;">Dolan-Jenner</td>
			<td style="width:119px;">Fiberlite 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Collagenase Type IA from Cloristridium histolyticum</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Cover slip</td>
			<td style="width:211px;">Fisher-Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-545-J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dextrose</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Digital CCD Camera</td>
			<td style="width:211px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:119px;">C8484-03G01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dissection fine forceps</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dissection forceps</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dissection microscope</td>
			<td style="width:211px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">Leica MZ 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dissection scissors</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15025-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dissection scissors fine</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dissection scissors ultra fine</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">FM 1-43</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">T3163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Glycine</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">High vacuum grease</td>
			<td style="width:211px;">Dow-Corning</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:211px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">SA-56-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Immersion oil</td>
			<td style="width:211px;">Fisher-Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Industrial grade Nitrogen gas tank</td>
			<td style="width:211px;">Praxair</td>
			<td style="width:119px;">UN1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Insect pins</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Liquid suture glue</td>
			<td>Braun Veterinary Cair Division</td>
			<td style="width:119px;">8V0305</td>
			<td>The suture glue we used in our experiments was provided to us by another lab. It is no longer manufactured. We have sourced a Histoacryl Suture Glue for future use from Aesculap (Ts1050071FP)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">154903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Non-fat dry milk</td>
			<td style="width:211px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:119px;">9999S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">P-87 Micropipette puller</td>
			<td style="width:211px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Perfusion pump</td>
			<td style="width:211px;">Cole-Palmer</td>
			<td style="width:119px;">Masterflex C/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Petri dish 100x15 mm</td>
			<td style="width:211px;">Fisher-Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Petri dish 35x10 mm</td>
			<td style="width:211px;">Fisher-scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P1024</td>
			<td>MW &#62; 300000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Primary antibodiesR-type calcium channel</td>
			<td style="width:211px;">Alomone Labs</td>
			<td style="width:119px;">ACC-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Protease Type XIV from Streptomyces griseus</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Scalpel blades</td>
			<td style="width:211px;">World Precision Instruments&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">500240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Schot Duran Preesure Bottle</td>
			<td style="width:211px;">Fisher-Scientific</td>
			<td style="width:119px;">09-841-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Silicone tubing for glue application</td>
			<td style="width:211px;">Cole-Palmer</td>
			<td>07625-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Slicing base plate</td>
			<td style="width:211px;">Leica Biosystems</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14046327404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Slicing chamber</td>
			<td style="width:211px;">Leica Biosystems</td>
			<td align="right">1.4046E+10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:119px;">S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Sodium tetraborate</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B3545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sylgard 160 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:211px;">Dow Corning&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SYLGARD&#174; 160</td>
			<td>To prepare, mix elastomer A and elastomer B 10:1 by weight</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:211px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">SYLGARD&#174; 184&#160;</td>
			<td>To prepare, mix elastomer and curing agent 10:1 by weight</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Teflon coated forceps</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11626-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tricaine methanesulphonate</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Vibratome blades</td>
			<td style="width:211px;">World Precision Instruments&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BLADES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Xenon lamp</td>
			<td style="width:211px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acute dissociation of lamprey reticulospinal axons to enable recording from the release face membrane of individual functional presynaptic terminals

La transmisión sináptica es un proceso extremadamente rápido. Potencial de acción impulsado afluencia de Ca 2 + en la terminal presináptica, a través de los canales de calcio dependientes de voltaje (VGCCs) localizados en la membrana cara liberación, es el detonante de la fusión de vesículas y la liberación de neurotransmisores. Crucial para la rapidez de la transmisión sináptica es la sincronía espacial y temporal entre la llegada del potencial de acción, VGCCs y la maquinaria liberación de neurotransmisores. La capacidad de grabar directamente Ca 2 + corrientes de la membrana cara liberación de terminales presinápticas individuales es imperativo para una comprensión precisa de la relación entre presináptica Ca 2 + y la liberación de neurotransmisores. El acceso a la membrana cara liberación presináptica de registro electrofisiológico no está disponible en la mayoría de las preparaciones y Ca 2 + entrada presináptica se ha caracterizado mediante técnicas de imagen y MeasureMe corriente macroscópicaNTS - técnicas que no tienen suficiente resolución temporal para visualizar la entrada de Ca 2 +. La caracterización de VGCCs directamente en las terminales presinápticas individuales no ha sido posible en las sinapsis centrales y hasta el momento se ha logrado con éxito sólo en el tipo cáliz sinapsis del ganglio ciliar de pollo y en los cálices de rata. Hemos abordado con éxito este problema en la sinapsis reticulospinal gigante de la lamprea de la médula espinal mediante el desarrollo de una preparación agudamente disociado de la médula espinal que produce axones reticulospinal aislados con terminales presinápticas funcionales carentes de estructuras postsinápticas. Fluorescencia Podemos etiquetar e identificar las terminales presinápticas individuales y dirigirlos para la grabación. El uso de esta preparación, hemos caracterizado VGCCs directamente en la cara liberación de terminales presinápticas individuales utilizando enfoques de inmunohistoquímica y de electrofisiología. Ca 2 + corrientes se han registrado directamente en la cara de la membrana de liberación of terminales presinápticas individuales, la primera de grabación a ser llevadas a cabo en las sinapsis centrales.

<html> Esto produce la disociación de protocolo axones sanos y funcionales aisladas reticulospinal carentes de postsináptica proyecciones Figura 2f, pero que sin embargo retener presináptica terminales funcionales capaces de vesícula sináptica evocada exo-y endocitosis Figura 4c y 4d Figura. Secciones de las regiones aisladas de los axones reticulospinal pueden ser claramente identificados con microscopía de luz para estar libre de cualquier otros procesos neuronal...

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Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

Agudo Disociación de lamprea reticuloespinal axones para permitir la grabación del estreno de la cara de la membrana de individuales Terminales presinápticos funcionales

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

acute-dissociation-lamprey-reticulospinal-axons-to-enable-recording

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K vistas.  University of Illinois at Chicago. Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals. 

Video: Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an extensively studied model system for understanding the behavior of neural stem cells and the regulation of adult neurogenesis. Traditionally, these studies have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region. Compared to sections, wholemounts preserve the complete cytoarchitecture and cellular relationships within the SVZ. This approach has recently revealed that the adult neural stem cells, or type B1 cells, are part of a mixed neuroepithelium with differentiated ependymal cells lining the lateral ventricles. In addition, this approach has been used to study the planar polarization of ependymal cells and the cerebrospinal fluid flow they generate in the ventricle. With recent evidence that adult neural stem cells are a heterogeneous population that is regionally specified, the wholemount approach will likely be an essential tool for understanding the organization and parcellation of this stem cell niche.

The lateral ventricle walls contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. Traditionally, studies on neurogenesis in this region have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region.

En la zona subventricular cara: tinción wholemount y flujo ependimarios

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an ...

Investigación

Neurociencias

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation de las neuronas del cerebro de roedores Rodajas para el Estudio de la transmisión sináptica y la imagen terminales presinápticos

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Sensibles al voltaje Dye grabación de axones, dendritas y espinas dendríticas de las neuronas individuales en rodajas de cerebro

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

Laser Nanocirugía del cerebelo Los axones<em&gt; En Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of primary afferent fibers mediated by GABAergic axo-axonal synapses (primary afferent depolarization). The strength of primary afferent depolarization can be measured by recording of volume-conducted potentials at the dorsal root (dorsal root potentials, DRP). Pathological changes of presynaptic inhibition are crucial in the abnormal central processing of certain pain conditions and in some disorders of motor hyperexcitability. Here, we describe a method of recording DRP in vivo in mice. The preparation of spinal cord dorsal roots in the anesthetized animal and the recording procedure using suction electrodes are explained. This method allows measuring GABAergic DRP and thereby estimating spinal presynaptic inhibition in the living mouse. In combination with transgenic mouse models, DRP recording may serve as a powerful tool to investigate disease-associated spinal pathophysiology. In vivo recording has several advantages compared to ex vivo isolated spinal cord preparations, e.g. the possibility of simultaneous recording or manipulation of supraspinal networks and induction of DRP by stimulation of peripheral nerves.

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

GABAergic presynaptic inhibition is a powerful inhibitory mechanism in the spinal cord important for motor and sensory signal integration in spinal cord networks. Underlying primary afferent depolarization can be measured by recording of dorsal root potentials (DRP). Here we demonstrate a method of in vivo recording of DRP in mice.

Medición de la columna vertebral presináptica inhibición en ratones mediante la raíz dorsal de grabación Potencial<em&gt; En Vivo</em

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

Imagen Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dinámica de Terminales cono fotorreceptor axón de la retina del ratón

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)&#8211;accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal &#8211; accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

Imágenes en vivo de nicotina señalización de calcio inducido y neurotransmisor lanzamiento Junto ventrales hipocampo axones

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Grabación de la plasticidad sináptica en rebanadas Hippocampal agudas mantenidas en un pequeño volumen reciclado - perfusión- y sistema de cámara de tipo inmersión

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

En Vivo Una sola molécula de seguimiento en la Terminal presináptica del nervio Motor del Drosophila

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other neurodegenerative disorders, this independence might be compromised due to insufficient glutamate clearance and the resulting spill-in and spill-out effects. Altered astrocytic coverage of the presynaptic terminals and/or dendritic spines as well as a reduced size of glutamate transporter clusters at glutamate release sites have been implicated in the pathogenesis of diseases resulting in symptoms of dys-/hyperkinesia. However, the mechanisms leading to the dysfunction of glutamatergic synapses in HD are not well understood. Improving and applying synapse imaging we have obtained data shedding new light on the mechanisms impeding the initiation of movements. Here, we describe the principle elements of a relatively inexpensive approach to achieve single synapse resolution by using the new genetically encoded ultrafast glutamate sensor iGluu, wide-field optics, a scientific CMOS (sCMOS) camera, a 473 nm laser and a laser positioning system to evaluate the state of corticostriatal synapses in acute slices from age appropriate healthy or diseased mice. Glutamate transients were constructed from single or multiple pixels to obtain estimates of i) glutamate release based on the maximal elevation of the glutamate concentration [Glu] next to the active zone and ii) glutamate uptake as reflected in the time constant of decay (TauD) of the perisynaptic [Glu]. Differences in the resting bouton size and contrasting patterns of short-term plasticity served as criteria for the identification of corticostriatal terminals as belonging to the intratelencephalic (IT) or the pyramidal tract (PT) pathway. Using these methods, we discovered that in symptomatic HD mice ~40% of PT-type corticostriatal synapses exhibited insufficient glutamate clearance, suggesting that these synapses might be at risk to excitotoxic damage. The results underline the usefulness of TauD as a biomarker of dysfunctional synapses in Huntington mice with a hypokinetic phenotype.

We present a protocol to evaluate the balance between glutamate release and clearance at single corticostriatal glutamatergic synapses in acute slices from adult mice. This protocol uses the fluorescent sensor iGluu for glutamate detection, a sCMOS camera for signal acquisition and a device for focal laser illumination.