Los autores agradecen a Teele Palumaa para obtener ayuda con las figuras. Financiado por el Proyecto de Grant 1008046 de la National Health and Medical Research Council, Australia.

1. Disociada del hipocampo Neurona Cultura <ol><li> Preparar cubreobjetos (vidrio de borosilicato): <ol><li> Lavar con etanol al 100%. </li><li> Deje secar al aire bajo irradiación UV. </li><li> Escudo con poli-D-lisina (0,5 mg / ml en tampón de borato 0,15 M, durante la noche a 4 ° C). </li><li> Al día siguiente (el día de la cultura) se lava 3 veces en PBS y luego cubra con laminina (2,5 g / ml, laminina de ratón naturales) + 5% v / v de suero de ternera fetal inactivado por calor (FCS) diluido en PBS durante 2 horas a 37 ° C. </li></ol></li><li> Diseccionar embrionarias día 18 (E18) hipocampos de rata y recoger en PBS que contenía calcio y de magnesio, se enfrió en hielo. NOTA: todos los protocolos experimentales con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Melbourne. </li><li> Preparar la papaína y soluciones de DNasa I del Kit de papaína de disociación de acuerdo con las instrucciones del fabricante. <ol><li> Añadir 50 l solución de DNasa I a 1 ml de solución de papaína. </li><li> NOTA: Una vezprimero preparada, la solución de papaína y las soluciones de DNasa I se pueden dispensar por separado en alícuotas (0,5 ml y 25 ml de alícuotas para la papaína y DNasa I, respectivamente) y se almacenaron a -20 ° C hasta que se necesite. </li></ol></li><li> Eliminar la mayor cantidad posible de PBS y se incuba hipocampos (a partir de una camada de embriones) con 1 ml de papaína / DNasa I solución a 37 ° C durante 15-20 min. Agitar suavemente el tubo para mezclar el contenido dos veces durante el período de incubación. </li><li> Se tritura el tejido de hipocampo suavemente (evitando la generación de burbujas) con una pipeta Pasteur siliconizada 10-15x-pulido de llama hasta que se obtuvo una dispersión celular y pocos, si alguno, trozos de tejido no disociado permanecen. </li><li> Capa cuidadosamente la suspensión celular disociada en un cojín de 3 ml de 4% w / v de albúmina de suero bovino (BSA) en solución de Hanks más aditivos salina equilibrada (HBSS +; véase la Sección 1.6.1). <ol><li> Preparar esta solución gradiente por etapas mediante la disolución de la BSA a temperatura ambiente sin agitaciónanillo en HBSS que contenía 2 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 4 mM NaHCO3 y glucosa 40 mM (HBSS +) luego de filtro estéril y se almacena a 4 ° C. </li></ol></li><li> Centrífuga, 100 xg, 7 min en una centrífuga de sobremesa con un rotor basculante. </li><li> Eliminar el sobrenadante con cuidado de no aspirar el pellet celular. </li><li> Resuspender las células sedimentadas suavemente con un pulida a la llama (siliconizado) pipeta Pasteur (o una punta de pipeta azul de 1 ml) en 1 ml de medio completo Neurobasal (con 2% B27, 0,5 mM de L-glutamina suplementado con 1% de FCS). </li><li> Cuente dos alícuotas 10 l usando un hemocitómetro (sólo NB contar las células en fase brillante como células &quot;vivas&quot;). </li><li> Placa neuronas primarias sobre cubreobjetos de vidrio recubiertos predispuestas (0,75-1 x 10 5/18 mm cubreobjetos en placa de 12 pocillos). Inmediatamente antes de la galvanoplastia, aspirar solución de laminina / suero sobrante de cubreobjetos y reemplazar con medio de cultivo de neuronas primario (véase más adelante). NB El n requeridaúmero de cubreobjetos necesita ser determinado de antemano como preparación cubreobjetos se comienza el día antes del cultivo (véase el paso 1.1). </li><li> Rata cultivo primario E18 neuronas del hipocampo de hasta 21 días in vitro (DIV) en medio Neurobasal, 2% B27, 0,5 mM de L-glutamina suplementado con 1% de FCS (inactivado por calor). Realizar un cambio de medio a medio a las 7 DIV y luego semanalmente. El fluorodesoxiuridina anti-mitótico / uridina se añade a 7 DIV; 1/1, 000 dilución de 10 mM de stock de cada nucleósido) para prevenir el crecimiento excesivo de la glía. </li></ol> 2. Anticuerpo La incubación con vivo neuronas <ol><li> Durante la primera semana de la cultura, las neuronas están desarrollando árboles dendríticos y por semana 2-3, las neuronas han madurado lo suficiente como para estar pasando por 6,7 sinaptogénesis. <ol><li> En seleccionados de tiempo experimental de puntos / s, aplique el anticuerpo primario a pocillos por triplicado que contienen las neuronas embrionarias primarias en cubreobjetos. Añadir una alícuota del anticuerpo directamente en el medio de cultivo delas neuronas primarias a la dilución final deseada Nota: En nuestro ejemplo, un antisuero policlonal de conejo producido contra una forma secretada de la proteína recombinante se diluyó 1/500 mediante la adición de 2 l a 1 ml de medio de cultivo en el pozo; una centrifugación durante 10 min , 13000 xg, RT puede incorporarse antes de tomar una alícuota de anticuerpo como esto eliminará cualquier partícula extraña y puede ayudar a reducir el fondo. </li><li> Para los controles de suero preinmune, añadir una cantidad equivalente de suero preinmune (a la misma dilución final). Si no hay suero pre-inmune está disponible, agregue el volumen equivalente de medio Neurobasal o PBS (sin control del anticuerpo primario). Alternativamente, si un anticuerpo primario adecuado disponible que reconoce intracelular región / s de la proteína, este anticuerpo se puede añadir a un pocillo de control con el fin de probar la especificidad de la tinción de la superficie. </li><li> Volver a las células a la incubadora de cultivo de 1-4 horas (este periodo de incubación puede ser determinada empíricamente). En nuestro experimeNTS, el anticuerpo estaba presente durante todo el período aunque el diseño experimental podría incorporar un pulso de anticuerpo seguido por un período de incubación adicional después de lavado (un experimento de pulso-caza) para evaluar el curso temporal de la internalización. Paso opcional: Esta incubación se puede llevar a cabo a temperatura ambiente o incluso en hielo para reducir la tasa de internalización de proteína basal, si es necesario. Si se realiza en un entorno no-CO 2 controlada, el medio debe ser cambiado a uno que no está tamponada con bicarbonato antes de la adición del anticuerpo / antisuero. PRECAUCIÓN: cultivos de neuronas maduras (&gt; 14 días, y las neuronas de ratón embrionarias cultivadas especialmente) no toleran cambios de medio completo también. </li></ol></li><li> Hemos utilizado los tiempos de incubación para esta etapa de internalización anticuerpo primario de 1 h, 2 h, 4 h y con buenos resultados, aunque el tiempo óptimo dependerá de la abundancia de la proteína de interés, así como la dinámica del tráfico de proteínas en la CELls en estudio. NOTA: Las imágenes de dos colores mostrados en resultados representativos se obtuvieron con una incubación de 1 hora a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos. </li><li> Después de la incubación durante el periodo deseado, aspirar fuera el medio que contiene anticuerpos. Lavar los pocillos suavemente pero rápidamente una vez con PBS a temperatura ambiente. </li></ol> 3. Aplicación anticuerpo secundario a fijos, unpermeabilized células <ol><li> Fijar las neuronas con paraformaldehído al 4% en tampón fosfato pH 7,2, 5 min a temperatura ambiente Nota: para obtener los mejores resultados, use fijador recién preparada; utilizar alternativamente corrección que se ha almacenado a -20 ° C y completamente descongelado para que ningún paraformaldehído precipitado es evidente . PRECAUCIÓN: fijador Paraformaldehyde debe estar preparado y manipulado de una campana de humos. </li><li> Retire solución de los pozos (transferir a contenedores de residuos líquidos en la campana de humos) y enjuague 3 veces con PBS. <ol><li> PASO OPCIONAL: Si lo desea, para ahorrar en reactivos de anticuerpos, los cubreobjetos puedeser eliminado cuidadosamente de la placa de 12 pocillos con unas pinzas y se coloca la celda de arriba abajo, sobre una lámina de Parafilm establecido en la base de una placa de cultivo desechable. </li><li> Las soluciones pueden entonces ser pipetearon suavemente sobre los cubreobjetos de modo que estén completamente cubiertos sin la inundación solución sobre el borde del cubreobjetos sobre el Parafilm. </li><li> Esta técnica es adecuada para incubaciones a corto plazo (1-2 h) sin embargo ya incubaciones (por ejemplo durante la noche) debe ser llevado a cabo en una cámara humidificada. Alternativamente, los cubreobjetos se pueden colocar de nuevo en los pocillos de la placa de 12 pocillos para la incubación durante la noche y el volumen añadida debe ser suficiente para asegurar que los cubreobjetos no se sequen. </li></ol></li><li> Bloquear durante 30 minutos a temperatura ambiente con 5% de BSA en PBS (Nota: No agregue detergente en la solución de bloqueo en esta etapa, ya que es importante que las células no se permeabilizaron). </li><li> Con el fin de etiquetar proteína de la superficie antes de proceder con detección de la proteína internalizada, aplique la primera etiqueta fluorescente 2 º anticuerpo de elección. Nota: En el ejemplo descrito aquí, el antisuero primario se planteó en el conejo (anticuerpo in-house) para una isoforma secretada recombinante 4. Por lo tanto, para la primera anticuerpo secundario para detectar la región extracelular de la isoforma transmembrana en la superficie de las neuronas unpermeabilized, se utilizó burro anti-conejo DyLight 649 (1/200 diluido en PBS que contenía 5% de BSA). Se recomienda centrifugar soluciones de anticuerpo secundario diluido (10 min, 13.000 xg, RT) antes de su uso. </li><li> Incubar los cubreobjetos durante 2 horas a temperatura ambiente. </li><li> Lavar cubreobjetos (en pozos), 2x 5 min con PBS. </li></ol> 4. El bloqueo con marcado en exceso Anticuerpo 2 ° <ol><li> Bloquear las neuronas unpermeabilized con una alta concentración (&gt; 0,1 mg / ml) de anticuerpo no marcado 2 °. <ol><li> El anticuerpo 2 º sin etiqueta debe elevarse contra la especie en la queel anticuerpo primario se elevó (en este caso de conejo) durante la noche por incubación a temperatura ambiente. </li><li> Para este protocolo, se utilizó un fragmento AffiniPure F ab IgG de cabra anti-conejo (H + L) a una concentración de 0,13 mg / ml. NOTA: La incubación durante la noche se encontró que era crucial como un período de incubación más corto (2 horas) era insuficiente para el bloqueo completo de anticuerpo primario que no estaba plenamente obligado por el anticuerpo secundario marcado. </li></ol></li><li> Lavar cubreobjetos (en pozos), 2x 5 min con PBS. </li><li> Después de esta etapa de bloqueo, después de fijar las células con paraformaldehído al 4% en tampón fosfato pH 7,2, 5 min a temperatura ambiente. Lavar con PBS (2x) después de la eliminación de fijador (transferencia fijador para contenedores de residuos líquidos en campana de extracción). </li></ol> 5. Permeabilización y Aplicación de la Segunda Fluorescently conjugado 2 ° de Anticuerpos <ol><li> Permeabilizar y bloquear las células con 5% de BSA en PBS que contenía 0,1% de Triton-X-100 en Tempe habitaciónRature durante 30 min. </li><li> Eliminar la solución de bloqueo (teniendo cuidado de que los cubreobjetos no se sequen). Agregue el 2 ° anticuerpo segunda fluorescencia conjugada marcada con un fluoróforo diferente. <ol><li> NOTA: Debe ser posible distinguir esta etiqueta fluoróforo de la utilizada anteriormente, dependiendo de los filtros de excitación / emisión disponibles en el microscopio confocal (ver más abajo). </li><li> Para el ejemplo presentado en este protocolo, se usó un Alexa Fluor 488 burro conjugado anti-conejo de 2 ° anticuerpo (1/200 en PBS, 5% de BSA y 0,1% de Triton-X-100). Incubar 2 horas a temperatura ambiente y después se retira la solución de anticuerpo 2 º. </li></ol></li><li> Lavar 3x cubreobjetos 5 min con PBS y, finalmente, se lava brevemente con agua desionizada. </li></ol> 6. Montaje e Imagen <ol><li> Monte cubreobjetos en portaobjetos de vidrio con un medio que contiene el montaje Antifade acuoso (por ejemplo VECTASHIELD) y dejar secar. Almacenar en la oscuridad a 4 ° C para oppreservación Timal de intensidad de la señal fluorescente. </li><li> Imagen immunostained células en un microscopio confocal. <ol><li> Filtros de excitación y emisión apropiados para la detección de las dos señales de fluoróforos deben estar disponibles. </li><li> Si diferentes condiciones experimentales se van a comparar (por ejemplo, las tasas de internalización bajo despolarizadas 8,9 o de control de las condiciones), asegúrese de que todos los replicados cubreobjetos de las diversas condiciones se crean imágenes con los mismos parámetros de adquisición de imágenes. La densidad integrada de las zonas habituales de interés o los atributos de puntos lagrimales (por ejemplo, número, tamaño) de las imágenes resultantes se puede medir utilizando el software estándar de análisis de imágenes (por ejemplo, Fiji / ImageJ, Metamorph). </li></ol></li></ol>

<ol>
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Neurosci. 30, 16485-16497 (2010).</li><li>Arancibia-C&#225;rcamo, I. L., Fairfax, B. P., Moss, S. J., Kittler, J. T., Kittler, J. T., Moss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+localization,+surface+stability+and+endocytosis+of+neurotransmitter+receptors+by+antibody+labeling+and+biotinylation+approaches.">Studying the localization, surface stability and endocytosis of neurotransmitter receptors by antibody labeling and biotinylation approaches.</a> The Dynamic Synapse: Molecular Methods in Ionotropic Receptor Biology. , (2006).</li><li>Petrini, E. M., Lu, J., Cognet, L., Lounis, B., Ehlers, M. 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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

La técnica descrita aquí es complementaria a la de la biotinilación de la superficie celular (revisado por Arancibia-Carcamo et al.) 12 y es el método de elección para la preservación de la información sobre la localización subcelular de la proteína internalizada, proporcionado un anticuerpo primario adecuado a una epítopo extracelular está disponible. Además, la cuantificación de tráfico de proteínas / internalización en el tiempo se puede realizar (mediante la fijación de cubreobje...

En el establecimiento de la función de las proteínas recientemente identificadas, la investigación de la localización subcelular y el tráfico de la proteína en cuestión puede proporcionar importantes pistas sobre el probable rol / s del 1,2 proteínas. El análisis bioinformático del transcriptoma del neocórtex en desarrollo 3 nos proporcionó una lista de genes que muestran expresión alterada durante ratón corticogenesis cerebro. Adoptamos entonces un enfoque knockout de genes para determinar que la proteína codificada por uno de estos genes, sez6, tiene un papel clave en el desarrollo de las neuronas. Hemos observado que el gen relacionado con la incautación-6, o Sez6, la proteína se encuentra en las dendritas en desarrollo y también está presente en las espinas dendríticas, estructuras especializadas en las dendritas que reciben e integran señales excitadoras. Además, cuando esta proteína es deficiente, las dendritas y las sinapsis excitadoras no se forman correctamente 4. La isoforma dominante probable de la proteína tiene características de un transmembranreceptor de correo aunque, cuando la distribución subcelular de la proteína inmunomarcadas se examinó por microscopía confocal o microscopía inmunoelectrónica por la mayoría, si no todos, de la señal aparecido asociada con vesículas pequeñas en el compartimiento somatodendrítico con poco, o ningún, proteína marcada en la membrana plasmática en la superficie celular. Con el fin de mostrar definitivamente que este receptor putativo con un gran dominio extracelular predicho es objeto de tráfico a la membrana plasmática, se adoptó un enfoque de células vivas utilizando el antisuero que habíamos generada a una porción extracelular de la proteína para etiquetar proteínas en la superficie celular. Al combinar este enfoque &quot;anticuerpo de alimentación&quot; con dos aplicaciones de anticuerpo secundario marcado con diferencialmente separados por una extensa etapa de bloqueo y un paso de permeabilización, pudimos identificar dos piscinas diferentes de proteínas que se distinguen por su unión a anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia que soportan diferentes colgetiquetas rentes. Por lo tanto, hemos sido capaces de distinguir las proteínas que habían sido internalizados por endocitosis, durante la etapa de incubación de anticuerpos de la proteína que, o bien se quedaron en la superficie de la célula o se trafica a la superficie durante este período. Usando este método, se estableció que la proteína de interés es objeto de tráfico hacia y desde la superficie celular en las neuronas. Por lo tanto, esta técnica relativamente rápido y simple resultó más informativo que los métodos tradicionales de inmunocitoquímica o pre-incrustación de microscopía electrónica por inmunomarcaje, a pesar del hecho de que se utilizó el mismo antisuero policlonal de conejo para todas estas técnicas. Esta técnica es aplicable en general a cualquier proteína transmembrana proporcionado un buen anticuerpo que reconoce epítopos dominio extracelular está disponible. La técnica se ha usado previamente para estudiar el tráfico del receptor de la subunidad GluR1 del receptor de glutamato 5.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="937">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">PBS with Ca and Mg</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">14040182</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Neurobasal medium</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Papain Dissociation System</td>
			<td style="width:269px;">Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td style="width:119px;">PDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:383px;">Hank&#39;s balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen (Gibco)</td>
			<td style="width:119px;">14175-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">P0899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Natural mouse laminin</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">23017-015</td>
			<td>Thaw on ice prior to making aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Fetal bovine serum HyClone</td>
			<td style="width:269px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">fluorodeoxyuridine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">uridine</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">U3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">18 mm round glass coverslips</td>
			<td style="width:269px;">Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>CB00180RA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">VECTASHIELD aqueous mounting medium</td>
			<td style="width:269px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Donkey anti-rabbit Dylight 649&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">711-495-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-007-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td>TOXIC - handle in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Triton-X-100</td>
			<td style="width:269px;">Sigma Aldrich Australia</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexafluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2&#176; antibody</td>
			<td style="width:269px;">Invitrogen - Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differential labeling of cell-surface and internalized proteins after antibody feeding of live cultured neurons

Con el fin de demostrar la localización de la superficie celular de un receptor transmembrana putativo en neuronas cultivadas, etiquetamos la proteína en la superficie de las neuronas en vivo con un anticuerpo primario específico generado contra una porción extracelular de la proteína. Dado que los receptores son objeto de tráfico hacia y desde la superficie, si las células se permeabilizaron después de la fijación a continuación, tanto de la superficie celular y la proteína interna serán detectados por el mismo anticuerpo secundario marcado. Aquí, hemos adaptado un método utilizado para estudiar el tráfico de proteínas (&quot;alimentación anticuerpo&quot;) diferencialmente proteína etiqueta que había sido internalizado por endocitosis, durante la etapa de incubación de anticuerpos y proteínas que, o bien se quedaron en la superficie de la célula o se trafica a la superficie durante este periodo . La capacidad de distinguir estos dos grupos de proteínas fue posible gracias a la incorporación de un paso de bloqueo durante la noche con el anticuerpo secundario marcado altamente concentrado-después de una incubatio inicialn de las neuronas unpermeabilized con un anticuerpo secundario marcado fluorescentemente-. Después de la etapa de bloqueo, la permeabilización de las neuronas permitió la detección de la piscina interiorizado con un anticuerpo secundario fluorescente marcada con un fluoróforo diferente. Usando esta técnica pudimos obtener información importante acerca de la localización subcelular de este receptor putativo, revelando que era, de hecho, víctimas de la trata a la superficie celular en las neuronas. Esta técnica es ampliamente aplicable a una gama de tipos de células y proteínas de la superficie celular, proporcionando un anticuerpo adecuado a un epítopo extracelular está disponible.

La técnica de inmunotinción fluorescente de dos colores que aquí se presenta es útil para el etiquetado de los dominios extracelulares de proteínas de transmembrana en las células vivas (que se muestra esquemáticamente en la Figura 1). Durante el período de incubación, las inmunoglobulinas se unen epítopos accesibles y una proporción de la población de moléculas de proteína, junto con anticuerpo unido, se endocitosis. Además, la proteína recién sintetizada puede llegar a la superficie d...

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Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

Se describe un método para etiquetar proteína en la superficie de neuronas vivas usando un anticuerpo policlonal específico para epítopos extracelulares. La proteína unida por el anticuerpo en la superficie celular y, posteriormente, internalizado a través de la endocitosis se puede distinguir de la proteína restante en, o de trata a, la superficie durante la incubación.

Etiquetado diferencial de la superficie celular e internalizado Proteínas después Antibody alimentación de vivo cultivadas neuronas

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

differential-labeling-cell-surface-internalized-proteins-after

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.3K vistas.  The University of Melbourne.  Se describe un método para etiquetar proteína en la superficie de neuronas vivas usando un anticuerpo policlonal específico para epítopos extracelulares. La proteína unida por el anticuerpo en la superficie celular y, posteriormente, internalizado a través de la endocitosis se puede distinguir de la proteína restante en, o de trata a, la superficie durante la incubación. 

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Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

La recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP) de fluorescencia de proteínas marcadas en las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo cultivadas

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Investigación

Neurociencias

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

Análisis de la morfología espina dendrítica en las neuronas del SNC cultivadas

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

Imágenes en vivo de los axones de la raíz dorsal después de rizotomía

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs 4-6. Altered patterns of dendritic growth and plasticity are associated with impaired neurobehavioral function in experimental models 7, and are thought to contribute to clinical symptoms observed in both neurodevelopmental disorders 8-10 and neurodegenerative diseases 11-13. Such observations underscore the functional importance of precisely regulating dendritic morphology, and suggest that identifying mechanisms that control dendritic growth will not only advance understanding of how neuronal connectivity is regulated during normal development, but may also provide insight on novel therapeutic strategies for diverse neurological diseases.
Mechanistic studies of dendritic growth would be greatly facilitated by the availability of a model system that allows neurons to be experimentally switched from a state in which they do not extend dendrites to one in which they elaborate a dendritic arbor comparable to that of their in vivo counterparts. Primary cultures of sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rodents provide such a model. When cultured in defined medium in the absence of serum and ganglionic glial cells, sympathetic neurons extend a single process which is axonal, and this unipolar state persists for weeks to months in culture 14,15. However, the addition of either bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) 16,17 or Matrigel 18 to the culture medium triggers these neurons to extend multiple processes that meet the morphologic, biochemical and functional criteria for dendrites. Sympathetic neurons dissociated from the SCG of perinatal rodents and grown under defined conditions are a homogenous population of neurons 19 that respond uniformly to the dendrite-promoting activity of Matrigel, BMP-7 and other BMPs of the decapentaplegic (dpp) and 60A subfamilies 17,18,20,21. Importantly, Matrigel- and BMP-induced dendrite formation occurs in the absence of changes in cell survival or axonal growth 17,18.
Here, we describe how to set up dissociated cultures of sympathetic neurons derived from the SCG of perinatal rats so that they are responsive to the selective dendrite-promoting activity of Matrigel or BMPs.

We describe a protocol for using bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) or Matrigel to selectively induce dendritic growth in primary sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rats.

Inducir el crecimiento dendríticas en las neuronas simpáticas cultivadas

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

La grabación simultánea de señales de calcio en neuronas identificadas y comportamiento de alimentación de Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

Difusión lateral y exocitosis de proteínas de membrana en neuronas cultivadas evaluó a través de la recuperación de fluorescencia y la pérdida de fluorescencia photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as colloidal gold can reveal the localization and distribution of specific antigens in various tissues1. The two most widely used techniques are pre-embedding and post-embedding techniques. In pre-embedding immunogold-electron microscopy (EM) techniques, the tissue must be permeabilized to allow antibody penetration before it is embedded. These techniques are ideal for preserving structures but poor penetration of the antibody (often only the first few micrometers) is a considerable drawback2. The post-embedding labeling methods can avoid this problem because labeling takes place on sections of fixed tissues where antigens are more easily accessible. Over the years, a number of modifications have improved the post-embedding methods to enhance immunoreactivity and to preserve ultrastructure3-5.
Tissue fixation is a crucial part of EM studies. Fixatives chemically crosslink the macromolecules to lock the tissue structures in place. The choice of fixative affects not only structural preservation but also antigenicity and contrast. Osmium tetroxide (OsO4), formaldehyde, and glutaraldehyde have been the standard fixatives for decades, including for central nervous system (CNS) tissues that are especially prone to structural damage during chemical and physical processing. Unfortunately, OsO4 is highly reactive and has been shown to mask antigens6, resulting in poor and insufficient labeling. Alternative approaches to avoid chemical fixation include freezing the tissues. But these techniques are difficult to perform and require expensive instrumentation. To address some of these problems and to improve CNS tissue labeling, Phend et al. replaced OsO4 with uranyl acetate (UA) and tannic acid (TA), and successfully introduced additional modifications to improve the sensitivity of antigen detection and structural preservation in brain and spinal cord tissues7. We have adopted this osmium-free post-embedding method to rat brain tissue and optimized the immunogold labeling technique to detect and study synaptic proteins.
We present here a method to determine the ultrastructural localization of synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. We use organotypic hippocampal cultured slices. These slices maintain the trisynaptic circuitry of the hippocampus, and thus are especially useful for studying synaptic plasticity, a mechanism widely thought to underlie learning and memory. Organotypic hippocampal slices from postnatal day 5 and 6 mouse/rat pups can be prepared as described previously8, and are especially useful to acutely knockdown or overexpress exogenous proteins. We have previously used this protocol to characterize neurogranin (Ng), a neuron-specific protein with a critical role in regulating synaptic function8,9 . We have also used it to characterize the ultrastructural localization of calmodulin (CaM) and Ca2+/CaM-dependent protein kinase II (CaMKII)10. As illustrated in the results, this protocol allows good ultrastructural preservation of dendritic spines and efficient labeling of Ng to help characterize its distribution in the spine8. Furthermore, the procedure described here can have wide applicability in studying many other proteins involved in neuronal functions.

The localization and distribution of proteins provide important information for understanding their cellular functions. The superior spatial resolution of electron microscopy (EM) can be used to determine the subcellular localization of a given antigen following immunohistochemistry. For tissues of the central nervous system (CNS), preserving structural integrity while maintaining antigenicity has been especially difficult in EM studies. Here, we adopt a procedure that has been used to preserve structures and antigens in the CNS to study and characterize synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.

Post-Etiquetado Inmunoelectrónica incorporación de proteínas sinápticas en cultivos de cortes de hipocampo

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

Potencial de Membrana Tinte Imaging de ventromedial del hipotálamo neuronas de ratones adultos para el Estudio de la glucosa Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Cuantificación de endosomas y de las motilidades de los lisosomas en neuronas cultivadas utilizando sondas fluorescentes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.