Este protocolo fue desarrollado originalmente en el Fred Hutchinson Cancer Research Center en Seattle por Xiaolan Ye y Petrascheck Michael en el Laboratorio de Linda Buck. La versión detallada ha sido preparado para hacer todo el procedimiento a disposición de la comunidad en general. Damos las gracias a Carol Taylor, LeBoeuf Sarah y Andy Tomacelli para la lectura crítica del protocolo. Este manuscrito es # 2866 de The Scripps Research Institute. El Laboratorio de Petrascheck es financiado por el programa IDA Novartis.

Resumen: El protocolo se divide en cuatro partes. Parte 1 se describe cómo preparar la alimentación de las bacterias. La Parte 2 describe cómo preparar la lombricultura. Parte 3 describe la forma de puntuación vida. Parte 4 se muestran algunos resultados representativos, y la Parte 5 se describe cómo preparar las soluciones necesarias. Experimentos de vida útil tomar varias semanas para completarse. Para cada paso de la semana del protocolo, el día y hora del día se incluye para facilitar la planificación. La etapa L4 (día 0) se utiliza como punto de referencia para todo el protocolo. 1. Preparación de bacterias Alimentación En esta sección se describe la preparación de las bacterias de alimentación. Los objetivos específicos E. coli cepa utilizada para alimentar a C.elegans se llama OP50. Antes de este protocolo, para evitar la contaminación cruzada de la lombricultura con otras bacterias, la cepa OP50 se ha hecho carbenicilina / resistentes a la ampicilina 21. Preparar el OP50 cuatro a cinco días de antelación. Todos los materiales que entran en contacto con OP50 debe ser estéril. Día 7: jueves (semana 1): Inocular 5 ml de la tuberculosis con 100 mg / ml ampicilina y 0,1 mg / ml de anfotericina B con una sola colonia OP50 e incubar durante la noche a 37 ° C en un agitador de bacterias. -6 Día: viernes (semana 1). Mañana 08:30. Inocular temprano para dar tiempo suficiente para que la cultura para alcanzar la saturación <ol><li> Diluir el cultivo de una noche de OP50 1:2000 en TB 300 ml contiene 50 mg / ml de ampicilina. Incubar el cultivo de bacterias en un agitador durante 8-12 horas a 37 º C hasta que se alcanza la saturación. No permita que la cultura crezca más de 14 horas. </li><li> Transferir el OP50 en un tubo estéril, centrifugación pre-ponderado. Se precipitan los OP50 por centrifugación durante 10 minutos a 3500 rpm (2.200 xg) en una centrífuga de mesa. </li><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet OP50 en agua estéril y volver a una pastilla por centrifugación. Repetir este lavado dos veces. </li><li> Tras el segundo lavado, retire con cuidado toda el agua restante. No se debe dejar el agua en el tubo. Pesar el tubo de centrifugación que contiene la pastilla y restar el peso del tubo de centrifugación vacío con el fin de determinar el peso de la pastilla. </li><li> Bien volver a suspender el pellet en S-completa a una concentración de 100 mg / mL. No se debe dejar grumos. </li><li> La concentración de 100 mg / mL OP50 debe corresponder a 2 x 10 10 bacterias / ml. El uso de un espectrómetro de fotos para determinar el número de bacterias por ml, si la relación entre la densidad óptica y el número de bacterias por mL se conoce. Si es necesario, ajustar la concentración de la solución de alimentación OP50 a 2 x 10 10 bacterias / ml. </li><li> Guarde el OP50solution a 4 ° C hasta que se utiliza para el cultivo del gusano. </li></ol> 2. Preparación de una cultura del gusano síncrona En esta sección se describe la preparación de la lombricultura. Su objetivo es generar una población en edad sincrónica de los gusanos. Todos los materiales que entran en contacto con C.elegans después del tratamiento blanqueador en el paso 5, debe ser estéril. Las placas se mantienen a 20 º C a menos que se indique lo contrario. -6 Día: viernes (semana 1), 4:00 pm: Traslado de los animales a un plato fresco <ol><li> Tome un plato días 50-10 NGM de edad en la que la mayoría de la población del gusano consiste en larvas L1 de hambre. </li><li> Esterilizar una espátula de metal por poco más de calor que un mechero de Bunsen. Deje que se enfríe. Use la espátula de refrigeración para cortar trozos de agar de la placa que contiene los gusanos de hambre. La transferencia de varios de estos trozos en una nueva placa de 10 cm NGM sembrado con OP50. Incubar durante aprox. 65 horas a 20 ° C hasta que la mayoría de la población de gusanos adultos se compone de gravidez. El tiempo necesario para que los animales muertos de hambre L1 se conviertan en adultos grávidas pueden variar de cepa a cepa. </li></ol> -3 Día: Lunes (2 semanas) 10:00 am: Establecer una población síncrono <ol start="3"><li> Recoger los gusanos de la placa de 10 cm, lávelos de la placa con 50-10 ml de agua estéril. Transferir la solución gusano / agua en un tubo cónico de 15 ml. </li><li> Lavar los gusanos mediante la centrifugación de 2 minutos en una centrífuga de mesa a 1200 rpm (280 xg). Desechar el sobrenadante y agregar 10 ml de agua. Repetir. </li><li> Aspirar el sobrenadante y añadir 5 ml de lejía recién preparada / solución de NaOH (2,5 cloro de uso doméstico ml, 1 ml NaOH 10N, 6,5 mL H 2 O). Incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente hasta que los gusanos se abren. Asegúrese de vórtice suavemente cada minuto. Monitorear el progreso de la reacción bajo el microscopio de disección. </li><li> Tan pronto como todos los adultos se disuelven, añadir 5 ml de buffer M9 para neutralizar la reacción. </li><li> Lavar los huevos tres veces con 10 ml de buffer M9 mediante la centrifugación de 2 minutos a 2500 rpm (1100 xg). </li><li> Lavar los huevos una vez con 10 ml S-completa mediante la centrifugación de 2 minutos a 2500 rpm (1.100 xg). </li><li> Eliminar el sobrenadante, agregar 10 ml de S-completa y transferir la solución a un nuevo tubo cónico de 50 ml. Añadir 30 ml de S-completa a un volumen final de 40 ml. Agite suavemente el tubo de la noche a temperatura ambiente en un nutator o dispositivo similar. </li></ol> Día -2: Martes (semana 2), 12:00 pm: La semilla de los animales en las placas <ol start="10"><li> Bajo el microscopio de disección, comprobar si los gusanos nacidos durante la noche. Determinar la concentración de los gusanos en la solución de S-completa, contando el número de gusanos en 10 gotas l usando un microscopio de disección. Contar con al menos 10 gotas de cada muestra. </li><li> Vuelva a suspender los gusanos a una concentración de 80 a 100 lombrices / mL en el S-completo. Añadir carbenicilina (stock 100 mg / mL) a una concentración final de 50 mcg / ml y anfotericina B (stock 250 mg / mL) a una concentración final de 0,1 mg / ml. Agitar en un nutator. Si la preparación de grandes cantidades de gusanos, use un frasco de 600 ml Nunclon con la tapa del filtro. </li><li> A las 2:30 pm agregar el OP50 preparados en la parte 1 a una concentración final de 6 mg / ml (= 1,2 x 10 9 bacterias / mL). Devolver el OP50 a 4 ° C. </li><li> Transferencia de 120 l de la solución worm/OP50 en cada pocillo de una placa y 96. Use placas de 96 pocillos con fondo transparente. Asegúrese de mantener a los gusanos en la suspensión, mientras que la pipeta. </li><li> Sellar la placa con un sellador de cinta para evitar la contaminación y la evaporación. Agitar la placa en un agitador de microplacas durante 2 min y se incuba durante 2 días a 20 ° C hasta que los animales llegan a la etapa L4. </li></ol> Día 0: jueves (2 semanas) antes del mediodía: Esterilizar los animales mediante la adición de fluorodesoxiuridina (FUDR) <ol start="15"><li> Para esterilizar a los animales añadir 30 l de una solución madre 0,6 mM FUDR a cada pocillo. En este paso el volumen final en cada pocillo a 150 l, y reduce la concentración final de OP50 de 6 mg / ml a 5 mg / ml (1x10 9 bacterias / mL). Sellar la placa con cinta de selladores y agitar durante 2-3 min en un agitador de microplacas. Si el OP50 se añadió a las 2:30 en el día -2, es importante que el FUDR se añade antes del mediodía. Volver placas a los 20 ° C incubadora </li></ol> Día 1: viernes (semana 2): Agregar a la cultura de las drogas <ol start="16"><li> A las 9:00 am la mayoría de los animales deberán ser grávidas y contienen varios huevos cada una. Añadir las drogas cuyo efecto sobre el ciclo de vida se va a probar en la concentración deseada. Si la disolución de la droga en las concentraciones de DMSO final de DMSO no debe ser superior a 0,6%, como las concentraciones de DMSO 0,6% más alto que acortan la vida útil C.elegans. Después de la adición de las drogas, sellar las placas con cinta selladora y agitar durante 2-3 min en un agitador de microplacas. Volver placas a los 20 ° C incubadora </li><li> Adición de las drogas en ocasiones puede matar a algunos animales por plato, especialmente si se utiliza un solvente que el agua. El uso de un microscopio invertido para comprobar si hay animales muertos. Generalmente, no debe ser inferior a 10 animales muertos por placa de 96 pocillos. Volver placas a los 20 ° C incubadora. </li></ol> Día 4: Lunes (3 semanas): selladores de Cambio <ol start="18"><li> Para permitir que el oxígeno fresco entre la cultura de quitar el sellador, espere un minuto y vuelva a sellar la placa. Agitar la placa durante 2-3 minutos en un agitador de microplacas. Repetir una vez a la semana. </li></ol> Día 5: Martes (semana 3): Añadir nuevas OP50 para evitar el hambre <ol start="19"><li> Añadir 5 l de los 100 mg / mL OP50 solución que se preparó en una parte a cada uno de los 96 pozos para evitar el hambre. </li></ol> 3. La puntuación de vida. En esta sección se describe cómo la supervivencia de la población de lombrices sincronizado de la Parte 2 se controla hasta que los animales murieron. Para observar a los animales en el 96 y placas, el uso de un microscopio invertido con un objetivo de 2x o 2.5x. Registro de datos de supervivencia de tres veces a la semana, lunes, miércoles y viernes. Usar el movimiento para determinar si los animales están vivos o muertos. Una luz intensa, especialmente por la luz azul, induce a los animales a moverse. No retire los animales muertos de la prueba. De vez en cuando, los animales que no se movió y se determinó el número de muertos en la anterior podría pasar más adelante. <ol><li> En el día 0, al inicio del experimento contar el número total de gusanos en cada pozo. Censor pozos que contienen más de 18 animales a partir del análisis de los animales en estos pozos no tienen suficiente OP50 y mostrará los efectos de la restricción dietética. </li><li> Con el fin de aumentar la probabilidad de que los animales se mueven, sacudir la placa de 96 pocillos en un agitador de microplacas durante 2 min. antes del conteo. </li><li> En cada fecha de registro de conteo de sesiones y número de animales quese mueven como animales vivos. Movimiento en el líquido es mucho más fácil que en medio sólido y puede ser inducida por luz intensa. El uso de un mayor aumento puede ayudar a detectar movimientos muy sutiles, como los de la punta de la faringe. Estos movimientos sutiles son a menudo el movimiento sólo se observa en los animales muy viejos. </li><li> Volver placas a los 20 ° C incubadora </li><li> Repita el paso 2-4 cada dos o tres días hasta que todos los animales están muertos. </li></ol> 4. Los resultados representativos. En esta sección se muestra un ejemplo de cómo llevar un registro de los datos de esperanza de vida generada por este análisis y algunos resultados representativos. La figura 1A muestra un ejemplo de cómo registrar los datos de esperanza de vida durante este ensayo. Una hoja de Excel se utiliza para realizar un seguimiento de la supervivencia de las poblaciones en cada pozo. Para cada pozo es de coordenadas en la placa, la tensión, las drogas, la concentración de la droga y el número total de animales vivos en el día 0 (X0) se registra en el inicio del experimento. Fecha de registro, así como el número de animales muertos que viven y tres veces por semana para seguir a la supervivencia de las distintas poblaciones en cada pozo. Para graficar los resultados, calcular la fracción de animales vivos por cada día y la trama como una función del tiempo en días. P-valores deben ser calculados usando paquetes estadísticos como STATA o software similar. El medio de vida de C. elegans es dependiente de la temperatura. Figura 1B muestra que los cambios dependen de la temperatura en la longevidad se reproducen con precisión por la esperanza de vida basado en microtitulación ensayo 22. Del mismo modo, el ensayo de placa de microtitulación reproduce los cambios en la vida de los mutantes informó que tienen esperanzas de vida diferentes a los animales salvajes de tipo N2 23-24 25 (fig. 1C). El ensayo también puede utilizarse para hacer declaraciones más cuantitativo. En la media de Fig1D vida se representa como una función de la concentración mirtazepina 7. Cada punto representa la media de esperanza de vida de la población 7-12, cada uno vive de una manera diferente también. A pesar de que el número de animales por pozo es relativamente baja (5-15 animales) y la variación a pozo es relativamente pequeño, como puede verse en las barras de error. <img src="/files/ftp_upload/2496/2496fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. La placa de microtitulación basado vida ensayo reproduce con precisión los cambios en la esperanza de vida en la literatura. (A) los datos de la muestra recogida en una hoja de cálculo Excel. En cada fecha de la sesión de conteo, las coordenadas del bien y el número de animales vivos y los muertos se registró. Al comienzo del experimento, el número total de animales en cada pozo se determinó. (B) Curva de supervivencia de tipo salvaje (N2) animales criados a 20 ° C y 25 ° C. (C) Las curvas de supervivencia de las cepas con mutaciones que afectan a la vida. Las cuatro cepas se analizaron en paralelo a 20 ° C. (D) de la curva dosis-respuesta mirtazepina N2 animales tratados. La media de esperanza de vida se representa como una función de la concentración mirtazepina. Las barras de error indican el SEM de 8 pozos por condición. 5. Los materiales. M9 buffer, 1000 ml <ul><li> 6 g Na 2 HPO 4 </li><li> 3 g KH 2 PO 4 </li><li> 5 g de NaCl </li><li> 0,25 g de MgSO 4 7H 2 O ∙ </li><li> Añadir agua destilada hasta 1000 ml </li><li> Autoclave </li></ul> Potassiumphosphate buffer de pH 6,0, 1000 ml <ul><li> 136 g KH 2 PO 4 </li><li> Añadir agua desionizada hasta 900 ml </li><li> Ajustar el pH a 6,0 con KOH 5M </li><li> Añadir agua destilada hasta 1000 ml </li><li> Autoclave </li></ul> Traza una solución de metal <ul><li> 1,86 g de Na 2 EDTA </li><li> 0,69 g FeSO 4 7H 2 O ∙ </li><li> 0,20 g MnCl2 ∙ 4H 2 O </li><li> 0,29 g ZnSO4 ∙ 7H 2 O </li><li> 0,016 g de CuSO4 </li><li> 1000 ml de agua desionizada </li><li> Autoclave y almacenar en la oscuridad. </li></ul> S-basal medio, 1.000 ml <ul><li> 5,9 g de NaCl </li><li> 50 ml de fosfato de potasio 1 M, pH 6,0 </li><li> 1000 ml de agua desionizada </li><li> Autoclave </li><li> Deje enfriar la solución y luego agregar 1 ml de colesterol 5 mg / mL (disuelto en Et-OH). </li></ul> 1M citrato de potasio, 1.000 ml <ul><li> 268,8 g de citrato tripotásico </li><li> 26.3 monohidrato de ácido cítrico </li><li> Añadir 900 ml de agua desionizada </li><li> Ajustar el pH a 6,0 con KOH 5M </li><li> Añadir agua destilada hasta 1000 ml </li><li> Autoclave </li></ul> S-medio completo, 1.000 ml <ul><li> 977 ml S-basal </li><li> 10 ml de potasio 1M citrato pH 6 (estéril) </li><li> 10 ml de traza de metales solución (estéril) </li><li> 3 ml de CaCl2 1M (estéril) </li><li> 3 ml de 1M MgSO4 (estéril) </li></ul> NGM agar <ul><li> 3,0 g de NaCl </li><li> 2.5g Pepton(A partir de la caseína, digerido pancreático) </li><li> Agar 17g </li><li> Añadir agua desionizada hasta 975 ml y una barra de agitación </li><li> Autoclave </li><li> Después del autoclave se enfríe a 55 ° C y añadir los siguientes componentes: <ul><li> 0,5 ml de 1 M de CaCl2 (estéril) </li><li> 1 ml de colesterol 5 mg / ml en etanol </li><li> 1 ml de 1M MgSO4 (estéril) </li><li> 25 ml de tampón Potassiumphosphate, pH 6,0 (estéril) </li></ul></li></ul> TB, 1000 ml <ul><li> 12 g de triptona Bacto </li><li> 24 g de extracto de levadura </li><li> 4 ml de glicerol </li><li> Añadir 900 ml de agua desionizada </li><li> Autoclave </li><li> Después del autoclave se enfríe a 55 ° C y añadir los siguientes componentes: <ul><li> Añadir 100 ml de 0,17 KH 2 PO 4 / 0.72MK 2 HPO 4 </li></ul></li></ul> 0,6 mM fluorodesoxiuridina (FUDR, Sigma cat # F0503), 1000 ml <ul><li> 100 mg FUDR </li><li> Se disuelven en 670 mL estéril S-completa, hacer 10 o 45 ml alícuotas ml. </li><li> Almacenar a -20 ° C. </li></ul> 100 mg / carbenicilina ml, 10 ml <ul><li> 1 g carbenicilina </li><li> 10 ml de agua desionizada estéril </li><li> Filtrado estéril y alícuota </li><li> Almacenar a -20 ° C. </li><li> Usar a una concentración final de 50 mg / ml </li></ul> 250ug / ml de anfotericina B, 4 ml <ul><li> 1 mg de anfotericina B </li><li> 4 ml de Et-OH </li><li> Almacenar a -20 ° C </li><li> Usar a una concentración final de 0,1 mg / ml </li></ul>

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+major+biological+and+environmental+factors+influencing+life+span.">Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span.</a> Mech. Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).</li><li>Ailion, M., Inoue, T., Weaver, C. I., Holdcraft, R. W., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosecretory+control+of+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Neurosecretory control of aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7394-7397 (1999).</li><li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type.">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366, 461-464 (1993).</li><li>Lakowski, B., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+life-span+in+Caenorhabditis+elegans+by+four+clock+genes.">Determination of life-span in Caenorhabditis elegans by four clock genes.</a> Science. 272, 1010-1013 (1996).</li></ol>

El protocolo presentado permite la medición de la C.elegans vida en 96 placas microtiter así. Como se muestra en los resultados de la sección representativa de forma fiable replica los resultados anteriores y proporciona información cuantitativa. El uso de este ensayo hemos logrado examinados más de 89.000 moléculas por su efecto sobre C.elegans vida. A los efectos de las drogas de detección, medición de vida útil en un formato de 96 pocillos de microtitulación tiene varias ventajas sobre la prueba clásica de los medios sólidos. Se reduce el trabajo necesario para la preparación de medios, la cantidad de espacio de incubación, y la cantidad de fármaco necesaria. El formato de 96 pozos y la instalación de microscopía permiten la automatización del ensayo completo de pruebas de detección de alto rendimiento. Durante el desarrollo de la prueba de varios valores para cada variable y combinaciones de los mismos fueron evaluados por sus efectos sobre C.elegans vida. Estas pruebas incluyen la concentración de diferentes OP50 que van desde 3 a 10 mg / ml (3, 4, 6, 8, 10 mg / ml), distinto número de gusanos por pozo de entre 7 y 45 (7, 10, 15, 22, 45 gusanos / y), los volúmenes de diferentes cultura que van desde 40 hasta 150 l por pocillo (40, 60, 80, 100, 120, 150 l), y los cambios en la composición del buffer. Si se alimenta con un OP50 carbenicilina resistente, ni carbenicilina, ni la anfotericina B en las concentraciones indicadas se han encontrado para afectar C.elegans vida. Agitación continua suave de las placas, como se recomienda a menudo en la cultura C.elegans líquido, se encontró prescindible para los pequeños volúmenes utilizados en este ensayo. Agitación suave sin embargo es necesario si microplacas con los pozos más grandes se van a utilizar. Los valores indicados en este protocolo han sido cuidadosamente seleccionados sobre la base de comparación estadística de las distintas condiciones de prueba. La característica más sorprendente de este ensayo es, probablemente, el hecho de que C. elegans se puede mantener en placas de 96 pozos que están selladas con cinta adhesiva. De lado a lado comparaciones no reveló ninguna diferencia en la esperanza de vida de los animales cultivados en placas de sellado, en placas de sellado con un sellador de plástico, o en placas selladas con selladores que permitan el intercambio de aire. En las tres condiciones, los animales desarrollaron muy homogénea de L1 a adultos grávidas en 65 horas y mostró esperanzas de vida muy similares. Animales criados de forma paralela en NGM desarrollado un poco más rápido, pero esta diferencia fue independiente de la presencia o ausencia de un sellador. El protocolo presentado se basa en bacterias vivas, pero puede ser adaptado para que las bacterias muertas. Sin embargo, en un ensayo de líquido una bacteria sobrevivir solo se pueden multiplicar rápidamente y volver a llenar la cultura. En nuestras manos, la única manera confiable para matar las bacterias en la medida en que puedan ser utilizados para el cultivo líquido es por el tratamiento prolongado de las bacterias con irradiación gamma. Un punto importante a considerar en la planificación de un experimento de vida es el poder de detección. Depende del tamaño del efecto, el efecto de la droga de interés deben ser probados en múltiples pozos. En un ensayo típico de 4 tratados con el fármaco y cuatro pozos de control, que corresponde aproximadamente a 40-50 animales cada uno, debería ser suficiente para detectar un aumento del 30% en el período de vida en más del 95% de los experimentos. Aumenta del 14% sólo se detectan en el 60% de los casos y por lo tanto requieren más pozos replicar. La riqueza de los datos de esperanza de vida generada por este ensayo puede ser utilizado para desarrollar experimentos o cepa específica de los modelos de Gompertz paramétrico 1. Estos modelos Gompertz son útiles para determinar la potencia de detección y para estimar el número de falsos positivos y negativos a gran escala de pantallas. Hemos verificado las predicciones de estos modelos en experimentos ciegos y los utilizó para estimar el número de falsos negativos en las pantallas de gran tamaño (resultados no publicados). En resumen, podemos anticipar que el ensayo presentado será de gran utilidad para identificar pequeñas moléculas que prolongar la vida de C. elegans y estudiar los mecanismos subyacentes.

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Erratum: Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Amphotericin B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>cat# 171375</td>
<td>Also called Fungizone</td>
</tr>
<tr>
<td>FUDR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-aldrich</td>
<td>cat# F0503</td>
<td>FUDR is inactivated by heat, thaw in cold water</td>
</tr>
<tr>
<td>Mianserin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-aldrich</td>
<td>M2525-250MG</td>
<td>Use as positive control at 50&mu;M final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>Cyproheptadine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-aldrich</td>
<td>cat#C6022-MG</td>
<td>Alternative positive control at 10 &mu;M final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>Sealing Tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>cat# 236370</td>
<td>Polyester, non-sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>96 well plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>cat# 351172</td>
<td>Non-treated, transparent, sterile individual packaged, polystyrene</td>
</tr>
<tr>
<td>Nunclon flask</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>cat# 178883</td>
<td>used for large volumes</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

measuring caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates

Esperanza de vida es un proceso biológico regulado por varias vías genéticas. Una de las estrategias para investigar la biología del envejecimiento es el estudio de los animales, que contienen mutaciones en los componentes de la edad de regulación vías. Si estas mutaciones perturbar la función de la vía la edad reglamentaria y por lo tanto, alteran la vida de todo el organismo, que proporcionan importantes conocimientos mecánicos 1-3. Otra estrategia para investigar la regulación de la vida es el uso de pequeñas moléculas para perturbar la edad regulación vías. Hasta la fecha, un número de moléculas se sabe que extender la vida útil de varios organismos modelo y se utilizan como herramientas para estudiar la biología del envejecimiento 16.4. El número de moléculas identificadas hasta el momento es pequeña comparada con la genética &quot;herramientas&quot; que está disponible para estudiar la biología del envejecimiento. Caenorhabditis elegans es uno de los modelos de principio que se utiliza para estudiar el envejecimiento debido a su excelente genética y de corta vida útil de tres semanas. Más recientemente, C. elegans se ha convertido en un organismo modelo para las pantallas de fenotipo de drogas basado en 5,7,16-20 debido a su pequeño tamaño y su capacidad de crecer en placas de microtitulación. Aquí presentamos un ensayo para medir la C.elegans vida en 96 placas microtiter así. El ensayo fue desarrollado y utilizado con éxito a la pantalla de las grandes bibliotecas de moléculas que se extienden C.elegans vida 7. La fiabilidad del ensayo fue evaluado en varias pruebas: en primer lugar, mediante la medición del tiempo de vida de los animales de tipo salvaje crecido a diferentes temperaturas, en segundo lugar, mediante la medición del tiempo de vida de los mutantes alterados con esperanzas de vida, en tercer lugar, mediante la medición de los cambios en la esperanza de vida en respuesta a diferentes concentraciones de los antidepresivos mirtazepina. Mirtazepina ha sido demostrado prolongar la vida en C.elegans 7. Los resultados de estas pruebas muestran que el ensayo es capaz de replicar los hallazgos previos de otros ensayos y cuantitativos. El formato de microtitulación también hace que este ensayo vida compatible con los sistemas automatizados de manejo de líquidos y permite la integración en plataformas automatizadas.

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Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

En este protocolo se presenta un método para medir<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Vida en 96 placas microtiter así.

Medición Caenorhabditis elegans Duración de la vida en 96 placas de microtitulación Bueno

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

measuring-caenorhabditis-elegans-life-span-96-well-microtiter

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

36.0K vistas.  The Scripps Research Institute. En este protocolo se presenta un método para medir Caenorhabditis elegans Vida en 96 placas microtiter así.

Video: Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

Medición Caenorhabditis elegans Duración de la vida en el medio sólido

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Investigación

Biología

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and chronological life spans are two established paradigms used to study aging in yeast. Replicative aging is defined as the number of daughter cells a single yeast mother cell produces before senescence; chronological aging is defined by the length of time cells can survive in a non-dividing, quiescence-like state 2. We have developed a high-throughput method for quantitative measurement of chronological life span. This method involves aging the cells in a defined medium under agitation and at constant temperature. At each age-point, a sub-population of cells is removed from the aging culture and inoculated into rich growth medium. A high-resolution growth curve is then obtained for this sub-population of aged cells using a Bioscreen C MBR machine. An algorithm is then applied to determine the relative proportion of viable cells in each sub-population based on the growth kinetics at each age-point. This method requires substantially less time and resources compared to other chronological lifespan assays while maintaining reproducibility and precision. The high-throughput nature of this assay should allow for large-scale genetic and chemical screens to identify novel longevity modifiers for further testing in more complex organisms.

Chronological aging in yeast refers to the loss of cell viability associated with time in stationary phase. Here we describe a high-throughput method for quantitatively determining yeast chronological life span.

Cuantificar cronológico levadura Duración de la vida por consecuencia de células envejecidas

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

Medición de Span replicativa vida en la levadura en ciernes

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Time-lapse microscopía de embriogénesis temprana en Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

Capa de hielo: Un método para el cultivo Arabidopsis Y plantas de tomate en las placas de 96 pocillos de alto rendimiento para genotipado

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos de sincronización y de observación

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

Medición de la resistencia de estrés oxidativo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 96 pocillos en placas de microtitulación

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and Huntington&#8217;s disease. Recently, repeat expansion-containing RNA was shown to be the substrate for a novel type of protein translation called repeat-associated non-AUG-dependent (RAN) translation. Unlike canonical translation, RAN translation does not require a start codon and only occurs when repeats exceed a threshold length. Because there is no start codon to determine the reading frame, RAN translation occurs in all reading frames from both sense and antisense RNA templates that contain a repeat expansion sequence. Therefore, RAN translation expands the number of possible disease-associated toxic peptides from one to six. Thus far, RAN translation has been documented in eight different repeat expansion-based neurodegenerative and neuromuscular diseases. In each case, deciphering which RAN products are toxic, as well as their mechanisms of toxicity, is a critical step towards understanding how these peptides contribute to disease pathophysiology. In this paper, we present strategies to measure the toxicity of RAN peptides in the model system C. elegans. First, we describe procedures for measuring RAN peptide toxicity on the growth and motility of developing C. elegans. Second, we detail an assay for measuring postdevelopmental, age-dependent effects of RAN peptides on motility. Finally, we describe a neurotoxicity assay for evaluating the effects of RAN peptides on neuron morphology. These assays provide a broad assessment of RAN peptide toxicity and may be useful for performing large-scale genetic or small molecule screens to identify disease mechanisms or therapies.

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Repeat-associated non-ATG-dependent translational products are emerging pathogenic features of several repeat expansion-based diseases. The goal of the protocol described is to evaluate toxicity caused by these peptides using behavioral and cellular assays in the model system C. elegans.

Medición de la toxicidad del péptido RAN en C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, sequester or eliminate damaged proteins to maintain a healthy proteome, thus ensuring cellular proteostasis and preventing further protein damage. Because of redundant functions within the proteostasis network, screening for detectable phenotypes using knockdown or mutations in chaperone-encoding genes in the multicellular organism Caenorhabditis elegans results in the detection of minor or no phenotypes in most cases. We have developed a targeted screening strategy to identify chaperones required for a specific function and thus bridge the gap between phenotype and function. Specifically, we monitor novel chaperone interactions using RNAi synthetic interaction screens, knocking-down chaperone expression, one chaperone at a time, in animals carrying a mutation in a chaperone-encoding gene or over-expressing a chaperone of interest. By disrupting two chaperones that individually present no gross phenotype, we can identify chaperones that aggravate or expose a specific phenotype when both perturbed. We demonstrate that this approach can identify specific sets of chaperones that function together to modulate the folding of a protein or protein complexes associated with a given phenotype.

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

To study chaperone-chaperone and chaperone-substrate interactions, we perform synthetic interaction screens in Caenorhabditis elegans using RNA interference in combination with mild mutations or over-expression of chaperones and monitor tissue-specific protein dysfunction at the organismal level.

Uso de Caenorhabditis elegans para detectar interacciones de chaperonas específicas del tejido

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...