Este protocolo presenta los métodos de menor costo y menor tecnología para servir el envejecimiento en elegans marinos. Un organismo modelo influyente en la biología del envejecimiento. La mayor ventaja de estos métodos es la facilidad de implementación, utilizando equipos y materiales de bajo costo.
Haciéndolos susceptibles para cualquier investigador, independientemente de su experiencia o financiación disponible. Como un viejo estudio de envejecimiento hay variabilidad natural en la salud dentro de las poblaciones. Por lo tanto, es esencial que los experimentos se realicen en animales sanos, bien alimentados y estrechamente sincronizados.
Para garantizar la discapacidad por rasgadura, comience la preparación de un medio de crecimiento de nematodos de un litro o una placa de barrena NGM. Agregue 2.5 gramos de tono pep, 3.0 gramos de cloruro de sodio y 20 gramos de barrena en un matraz de un litro con una barra de agitación y agregue agua destilada a un volumen final de 970 mililitros. Esterilizar la solución de sinfín NGM en un matraz de un litro utilizando un esterilizador de medios o autoclave estándar.
Y deje que la solución se revuelva hasta que se enfríe a 60 a 75 grados centígrados. Mientras la solución se enfría, caliente un baño de cuentas a 65 a 70 grados centígrados. Una vez que la solución de barrena NGM se enfría a 60 a 75 grados centígrados.
Agregue los aditivos líquidos y deje que la solución se mezcle completamente durante cinco minutos. Luego sumerja el matraz en un baño de cuentas a 65 a 70 grados centígrados para evitar que el medio se solidifique mientras se vierte en la placa. Pipete de nueve a 11 mililitros de la solución en cada placa de 60 mililitros.
Cuando haya terminado, vuelva a colocar la pipeta en la solución calentada para mantener la temperatura y evitar que cualquier medio se solidifique en la pipeta. Repita el procedimiento para todas las placas y permita que las placas NGM se solidifiquen durante la noche. Una vez solidificados, utilícelos para sembrar placas con bacterias o almacene las placas en recipientes sellados hasta por tres meses a cuatro grados centígrados para sincronizar los gusanos a través del blanqueo.
Recoja los nematodos vertiendo una pequeña cantidad de solución M9 en una placa que contenga los gusanos sin llenar demasiado la placa de Petri. Luego agite suavemente la solución M nueve para aflojar los gusanos de los céspedes bacterianos. A continuación, recoja los gusanos grávidos adultos en un tubo de 15 mililitros con una pipeta serológica.
Evitar perforar la barrena con la punta de la pipeta. Pellet los animales por centr durante 30 segundos a 1100 veces G, y aspirar el sobrenadante. Agregue cinco mililitros de la solución blanqueadora recién preparada a la bolita de gusano y verifique los gusanos bajo un microscopio de disección cada pocos minutos junto con una agitación vigorosa intermitente hasta que todos los cuerpos de gusanos adultos se disuelvan y solo queden huevos en la mezcla.
A continuación, pellet los huevos girando la mezcla de blanqueador de huevo durante 30 segundos a 1100 veces G y aspirar la solución blanqueadora. Luego lave los huevos granulados agregando hasta 15 mililitros de solución M9 e invirtiendo el tubo cuatro o cinco veces para dispersar los huevos y la solución. Nuevamente, centrifugar el tubo durante 30 segundos a 1100 veces G para granular los huevos y aspirar la solución M9.
Realice el lavado cuatro veces para eliminar cualquier blanqueador de la mezcla de huevo. Después del cuarto lavado, la centrifusión aspire la solución M9 de 100 microlitros a dos mililitros, dependiendo del número total de gusanos blanqueados. Agite bien los huevos para romper los grumos y asegúrese de que los huevos estén completamente resuspendidos en la solución M9.
Alternativamente, los animales pueden ser detenidos para una sincronización temporal más estrecha agregando de 10 a 12 mililitros de solución M9 a la bolita de huevo en un tubo de crónica de 15 mililitros. Deje que los gusanos giren en un rotador durante un máximo de 24 horas a 20 grados centígrados. Para aproximar el huevo o L una concentración pipeta cuatro microlitros de la mezcla de huevo en una placa NGM asentada con bacterias.
Luego cuente y calcule los huevos presentes por microlitro de medio. Repita el conteo tres o cuatro veces para mejorar la aproximación, basándose en la placa de aproximación, el número apropiado de huevos o L uno de animales detenidos en la placa de barrena NGM sembrada con bacterias de elección. Para medir el comportamiento locomotor de los gusanos a través de golpes.
Mueva un pequeño número de gusanos adultos del día uno de una placa de barrena NGM a 10 a 20 microlitros de solución M9 bajo un endoscopio de disección. Luego concéntrese en un gusano a la vez y cuente el número de veces que la muestra cambia de una formación cóncava a una convexa en 15 segundos. Use un contador de manos y un temporizador y repita el procedimiento para 10 a 15 gusanos.
Envejecer los gusanos a la edad deseada y repetir las mediciones de golpeo en todas las edades deseadas. Como se visualiza, los gusanos más viejos golpean a velocidades significativamente más lentas. Para mediciones de cantidad y fertilidad.
En 10 a 15 gusanos Caenorhabditis elegans, seleccione L cuatro gusanos en una placa de barrena NGM separada sembrada con bacterias de elección. Permita que los animales crezcan durante la noche a 20 grados centígrados y asegúrese de que un lote de placas recién sembrado esté listo para el día siguiente. Para medir la cantidad de huevos puestos por Caenorhabditis elegans, transfiera los gusanos adultos a una hoja de barrena NGM fresca sembrada con esa bacteria saqueada cada 12 a 24 horas durante siete a ocho días o hasta que los huevos ya no sean visibles y cuente el número de huevos puestos en las placas.
Para medir el tamaño de la cría de Caenorhabditis elegans Transfiera los gusanos adultos a una placa de barrena NGM fresca sembrada con bacterias cada 12 a 24 horas, o de siete a ocho días o hasta que la progenie ya no sea visible. Mantenga todos los platos que contienen huevos a 20 grados centígrados. Dos días después de transferir los gusanos.
Cuenta la progenie desarrollada en el plato. Cuente todos los gusanos vivos y en desarrollo en la etapa L cuatro o antes para asegurarse de que la generación F dos no confunda los resultados. Retire todos los gusanos del plato a medida que se cuentan.
Mantenga las placas durante uno o dos días adicionales antes de volver a marcarlas para asegurarse de que no se pierda ningún animal con retraso en la eclosión o el desarrollo. El efecto del método de esterilización en la esperanza de vida de los nematodos salvajes de tipo N2 mostró que los cambios en la vida útil de los gusanos cultivados en las placas de barrena NGM fueron similares a los de los gusanos cultivados en las placas FUDR de barrena NGM o los cuatro animales mutantes BN2 de glp cultivados en las placas de barrena NGM. El animal de corta duración HSF One knockdown mostró una disminución significativa en la vida útil de todas las condiciones.
Se encontró una disminución sustancial en el número de huevos puestos y el tamaño de la cría en el HSF uno sobre los animales de expresión en comparación con los controles de tipo salvaje. Algunos animales HSF uno sobre expresión exhibieron esterilidad total, lo que indica que la salud reproductiva puede correlacionarse inversamente con la longevidad. La tasa de golpes proporcionó un método confiable para medir la salud durante el envejecimiento, medido por una disminución significativa en la paliza en animales viejos en comparación con los jóvenes.
La supervivencia al estrés son ensayos confiables para medir la salud del organismo, la tunicamicina que causa estrés del retículo resultó en una vida útil reducida independientemente de la concentración en comparación con el control de DMSO. Los altos niveles de paraquat acortaron significativamente la vida útil, mientras que las bajas concentraciones de paraquat aumentaron la vida útil debido al efecto hormético. En los ensayos de tolerancia térmica, la sobreexpresión de HSF uno aumentó la tolerancia térmica a 37 grados centígrados para todos los experimentos de vida útil y envejecimiento.
Es importante recordar que las técnicas de esterilización pueden tener un efecto pleiotrópico en la salud del organismo, lo que afecta los resultados. Existen muchos enfoques adicionales y complementarios para medir la duración de la salud si se dispone de equipos e infraestructura, incluidas las mediciones de transcripción, agregación de proteínas de traducción, orgánulos, morfología y funciones metabólicas.
