Name: measuring the effect of chemicals on the growth and reproduction of caenorhabditis elegans
Uploaded: 2017-10-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
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Este estudio fue apoyado por el Instituto Coreano de ciencia y tecnología beca de investigación intramuros (2E27513) y el alto valor agregado alimentos tecnología desarrollo programa (IPET) financiado por el Ministerio de agricultura, alimentación y asuntos rurales (315067-03).

Nota: todo el experimento debe realizarse en un laboratorio aislado limpio mantenido a 20 ° C con poco polvo y con minimización de contaminación durante el gusano y manejo bacteriana. Para ello, deben realizarse experimentos bajo la llama de una lámpara de alcohol o de usar un banco limpio.
 1. mantenimiento de C. elegans y huevo preparación para la prueba de química <ol><li>mantenimiento C. elegans N2 (var. Bristol) en una placa de agar NGM hartos de vivir OP50 de e. coli a 20 º C 12 , 13.</li>
	<li>Prepare Huevos sincronizados de edad mediante lejía solución tratamiento 5 o el tiempo del huevo colocación método 6 , 14 , 15. 
	Nota: antes de la preparación de huevo, capa de la placa NGM que contienen etopósido con e. coli OP50 como se describe a continuación inactivadas por calor. E. coli inactivadas por calor OP50 se utiliza para reducir al mínimo la actividad metabólica de e. coli 6 , 16.</li>
</ol> 2. Preparación de inactivadas por calor de e. coli OP50 a Feed C. elegans durante la prueba de toxicidad <ol><li>preparar 500 mL de medio de doble levadura triptona (DYT) como se describe en la tabla 1 y sembrar una sola Colonia de e. coli OP50 cultivadas en placa de un agar Luria-Bertani (LB) 5.</li>
	<li>Incubar el OP50 de e. coli en un incubador de agitación de 14 h a 37 ° C y 150 rpm.</li>
	<li>Después de la centrifugación durante 30 min a 3.220 x g y 20 ° C, quitar medio DYT todo sobrenadante y agregar una premezcla de 25 mL de tampón de S, 250 μl de 1 M MgSO 4 y 25 μl de colesterol 5 mg/mL (disuelto en etanol). Todas estas soluciones son estériles.</li>
	<li>Resuspender las bacterias y transferirlos a un tubo de plástico desechable de 50 mL.</li>
	<li>Para la inactivación de calor, incubar el resuspendido OP50 de e. coli en un baño de agua durante 30 min a 65 ° C.</li>
	<li>Enfriar a temperatura ambiente y almacenar a 4 ° C hasta su uso. Esto puede conservarse hasta un mes.</li>
</ol> 3. Preparación de NGM placas que contienen ya sea 1% DMSO o 750 μm Etoposide <ol><li>preparar dos botellas de vidrio de 200 mL limpia. Añadir 0,6 g de NaCl, 0.5 g de peptona, 3,4 g de agar y 195 mL de agua destilada y un agitador magnético a una botella. Añadir un agitador magnético a la otra botella vacía.</li>
	<li>Botellas de autoclave estos dos durante 15 min a 121 ° C y después de enfriamiento las botellas en un baño de agua durante 30 min a 55 ° C.</li>
	<li>Añadir 0,2 mL de 1 M CaCl 2, 0,2 mL de colesterol 5 mg/mL, 0.2 mL de 1 M MgSO 4 y 5 mL de 1 M KPO 4 (todas estas soluciones son estériles) y luego las mezcle por agitación magnética en un plato caliente a 55 ° C.</li>
	<li>Divide el medio mixto de NGM en dos botellas con el mismo volumen (100 mL). A continuación, añadir 1 mL de DMSO a un frasco, mezcla con agitación magnética. Guarde la otra botella en un baño de agua a 55 ° C hasta el siguiente paso. Alícuota 3 mL del medio que contiene DMSO a cada 35 x 10 mm 2 caja de Petri. Aproximadamente 33 planchas NGM que contiene DMSO pueden hacerse de este paso.</li>
	<li>Mezcla la otra botella con agitación magnética, añadir 1 mL de etopósido 75 mM (caldo disuelto en DMSO), mezclar nuevamente y repita el procedimiento alícuota (paso 3.4). Aproximadamente 33 etopósido (750 μm)-que contienen planchas NGM se puede hacer de este paso. 
	Nota: En la correlación anterior papel 6, probamos 0, 250, 500 y 1.000 μm de etopósido. Basado en los datos, elegimos la 750 μm de etoposide dosis en este papel.</li>
	<li>Fresco abajo las placas NGM que contienen el producto químico a temperatura ambiente dejando a temperatura ambiente durante aproximadamente 3 h y almacenarlos a 4 ° C hasta su uso. 
	Nota: En el caso de productos químicos sensibles a la luz, bloquear la luz para minimizar la descomposición inducida por la luz. 
	Nota: Opcionalmente, hacer una placa NGM normal sin productos químicos para el análisis, que pueden realizarse mediante dos condiciones diferentes de tratamiento químico como se describe a continuación ponedora.</li>
	<li>Agregar 100 μl de inactivadas por calor OP50 de e. coli (como se describe en sección 2) y extensión en cada plato NGM. Permita que seque durante la noche en una incubadora de C. elegans a 20 ° C para la prueba química</li>
</ol> 4. Medición del crecimiento de C. elegans <ol><li>transferencia el sincronizado de edad C. elegans los huevos al plato de NGM suplementado con 1% DMSO o 750 μm etopósido.</li>
	<li>C. elegans de incubar en una incubadora a 20 ° C durante 4 días. Observar los gusanos usando un microscopio estéreo y toma imágenes microscópicas de todos los días. 20 aumentos (1 X objetivo zoom de 2 aumentos y ocular de 10 X) suele ser apropiado para la observación del crecimiento de C. elegans. También tomar una imagen microscópica del micrómetro de microscopio para la calibración de gusano tamaño. 
	Nota: El hambre afecta la prueba de toxicidad. Por lo tanto, la alimentación con suficientes bacterias o ajustar el transferido C. elegans números al principio del huevo. Observar hasta 3 días para excluir la posibilidad de hambre.</li>
	<li>Medir la longitud del cuerpo de C. elegans tratados con DMSO o etopósido en cada momento utilizando el software ImageJ. 
	Nota: Para cada medida de la muestra, 50 gusanos son suficientes para el análisis estadístico.
	<ol><li>El ImageJ en, abra la imagen de micrómetro de etapa de microscopio (&#39; archivo &#39; &#8594; &#39; abrir &#39;). 
		Nota: La imagen del micrómetro y el gusano imágenes (paso 4.2) deben ser el mismo aumento.</li>
		<li>Arrastre una línea de 1.000 μm en la imagen de calibración del micrómetro mediante el uso de &#39; recta &#39; herramienta.</li>
		<li>Haga clic en &#39; analizar &#39; &#8594; &#39; escala Set &#39; y entrada 1.000 μm en la &#39; conocida distancia &#39; caja y &#39; unidad de longitud &#39; de la caja, respectivamente. Compruebe &#39; Global &#39; y haga clic en &#39; OK &#39;.</li>
		<li>Abrir las imágenes de gusano (&#39; archivo &#39; &#8594; &#39; Open &#39;). Dibujar una línea a lo largo de la característica de cada gusano utilizando &#39; línea a mano alzada &#39; herramienta. Obtener los datos de longitud de cuerpo haciendo clic en &#39; analizar &#39; &#8594; &#39; medida &#39;.</li>
		<li>Repita estos pasos para 50 gusanos.</li>
	</ol></li></ol> 5. Ensayo de poner huevo de C. elegans <ol><li>edad-sincronizado de incubar huevos en el NGM la placa que contiene DMSO o etopósido para 64 h (antes del primer parto) hasta la etapa adulta joven a los 20 ° C. 
	Nota: Es opcional para utilizar los gusanos de los experimentos de medición de crecimiento. Es conveniente hacer la medición de crecimiento y ensayo de puesta de huevo juntos.</li>
	<li>Transferencia 5 gusanos adultos a la NGM nuevas placas sin químicos (condición 1, tratamiento químico dentro de cierto período de tiempo, de los huevos a etapa de adulto joven) o placa NGM nueva con el mismo pretratamiento químico (condición 2, la exposición continua de productos químicos durante el periodo experimental en general) y luego les incube durante 24 h. 
	Nota: Se recomienda hacer repeticiones con 3-5 placas NGM para cada tratamiento; estas repeticiones pueden utilizarse para el análisis estadístico.</li>
	<li>Transferir a la nueva placa NGM como se describió anteriormente y contar el número de huevos cada día. Cuenta los gusanos que se arrastró fuera, murieron y fueron los hatchEd.</li>
	<li>Repita estos pasos hasta que los gusanos no ponen más huevos, generalmente en 5 días.</li>
	<li>Calcular el número de huevos puestos por gusano de cada placa y sumar estos valores cada día durante 5 días para determinar el número total de huevos puestos. 
	Nota: Excluye el número de gusanos que se arrastró apagado e internamente tramado del cálculo.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Blomme, E. A., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicology+strategies+for+drug+discovery:+present+and+future.">Toxicology strategies for drug discovery: present and future.</a> Chem. Res. Toxicol. 29 (4), 473-504 (2016).</li><li>Lilienblum, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+methods+to+safety+studies+in+experimental+animals:+role+in+the+risk+assessment+of+chemicals+under+the+new+European+Chemicals+Legislation+(REACH).">Alternative methods to safety studies in experimental animals: role in the risk assessment of chemicals under the new European Chemicals Legislation (REACH).</a> Arch. Toxicol. 82 (4), 211-236 (2008).</li><li>Honnen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+powerful+alternative+model+organism+to+promote+research+in+genetic+toxicology+and+biomedicine.">Caenorhabditis elegans as a powerful alternative model organism to promote research in genetic toxicology and biomedicine.</a> Arch. Toxicol. , (2017).</li><li>Hunt, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+model+in+toxicity+testing.">The C. elegans model in toxicity testing.</a> J. Appl. Toxicol. 37 (1), 50-59 (2017).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).</li><li>Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+evaluation+of+the+topoisomerase+inhibitor,+etoposide,+in+the+model+animal+Caenorhabditis+elegans+and+3T3-L1+normal+murine+cells.">Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells.</a> Environ. Toxicol. 32 (6), 1836-1843 (2017).</li><li>Imanikia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+the+comet+assay+to+assess+the+genotoxicity+of+environmental+pollutants+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The application of the comet assay to assess the genotoxicity of environmental pollutants in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Environ. Toxicol. Pharmacol. 45, 356-361 (2016).</li><li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfluorooctane+sulfonate+exposure+causes+gonadal+developmental+toxicity+in+Caenorhabditis+elegans+through+ROS-induced+DNA+damage.">Perfluorooctane sulfonate exposure causes gonadal developmental toxicity in Caenorhabditis elegans through ROS-induced DNA damage.</a> Chemosphere. 155, 115-126 (2016).</li><li>Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+screening+platform+for+the+rapid+assessment+of+chemical+disruption+of+germline+function.">A C. elegans screening platform for the rapid assessment of chemical disruption of germline function.</a> Environ. Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).</li><li>Singh, S., Sharma, B., Kanwar, S. S., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lead+phytochemicals+for+anticancer+drug+development.">Lead phytochemicals for anticancer drug development.</a> Front. Plant Sci. 7, 1667 (2016).</li><li>Kang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+topoisomerase+inhibitor,+daurinol,+suppresses+growth+of+HCT116+cells+with+low+hematological+toxicity+compared+to+etoposide.">A novel topoisomerase inhibitor, daurinol, suppresses growth of HCT116 cells with low hematological toxicity compared to etoposide.</a> Neoplasia. 13 (11), 1043-1057 (2011).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> J. Vis. Exp. (47), e2293 (2011).</li><li>Zarse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+insulin/IGF1+signaling+extends+life+span+by+promoting+mitochondrial+L-proline+catabolism+to+induce+a+transient+ROS+signal.">Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal.</a> Cell Metab. 15 (4), 451-465 (2012).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> J. Vis. Exp. (27), e1152 (2009).</li><li>Weimer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D-Glucosamine+supplementation+extends+life+span+of+nematodes+and+of+ageing+mice.">D-Glucosamine supplementation extends life span of nematodes and of ageing mice.</a> Nat. Commun. 5, 3563 (2014).</li><li>Schmeisser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+ROS+signaling+rather+than+AMPK/sirtuin-mediated+energy+sensing+links+dietary+restriction+to+lifespan+extension.">Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension.</a> Mol. Metab. 2 (2), 92-102 (2013).</li><li>Parodi, D. A., Damoiseaux, R., Allard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+assessment+of+germline+chemical+toxicity+using+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Comprehensive assessment of germline chemical toxicity using the nematode Caenorhabditis elegans.</a> J. Vis. Exp. (96), e52445 (2015).</li><li>Hahm, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+maximum+velocity+correlates+with+healthspan+and+is+maintained+in+worms+with+an+insulin+receptor+mutation.">C. elegans maximum velocity correlates with healthspan and is maintained in worms with an insulin receptor mutation.</a> Nat. Commun. 6, 8919 (2015).</li><li>Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+spreading+and+toxicity+of+prion-like+proteins+using+the+metazoan+model+organism+C.+elegans.">Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (95), e52321 (2015).</li><li>Schmidt, B. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+acute+and+developmental+neurotoxicity+screening:+an+overview+of+cellular+platforms+and+high-throughput+technical+possibilities.">In vitro acute and developmental neurotoxicity screening: an overview of cellular platforms and high-throughput technical possibilities.</a> Arch. Toxicol. 91 (1), 1-33 (2017).</li><li>Fey, S. J., Wrzesinski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+drug+toxicity+using+3D+spheroids+constructed+from+an+immortal+human+hepatocyte+cell+line.">Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell line.</a> Toxicol. Sci. 127 (2), 403-411 (2012).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este artículo, se describe la evaluación de la toxicidad de productos químicos en C. elegans, un nematodo de suelo, uso de etopósido como un ejemplo de sustancias tóxicos. Para ello, se utilizaron dos condiciones experimentales. En el primer set, C. elegans fueron cultivadas en etopósido que contiene placas de huevos a la etapa de adulto joven, y entonces los gusanos podían poner huevos en las placas NGM normales sin productos químicos. En el segundo set experimental, C. elegans fuer...

Evaluación toxicológica es esencial para el desarrollo de productos farmacéuticos y nutracéuticos, cosmecéuticos, así como la evaluación del riesgo de varias toxinas ambientales. El modelo de roedor es uno de los sistemas más populares en vivo experimentales para este estudio de la toxicología; por otra parte, organismos no mamíferos como C. elegans son también ampliamente utilizados. Modelos de evaluación toxicológica de mamíferos no son beneficiosos debido a no sólo animal cuestiones éticas, pero también su conveniencia y utilidad considerando rentabilidad, mantenimiento, velocidad y reproducibilidad1,2 ,3,4.
C. elegans, un suelo redondo gusano, ha sido explotado como un animal modelo en varios Investigación Biología y química básica y aplicada. Es un 1 mm de largo, nematodo transparente, que simplemente se mantiene en sólidos o líquidos nematodo crecimiento medios (NGM) alimentados con la cepa bacteriana de Escherichia coli OP50. C. elegans tiene un corto ciclo de vida y tipo N2 C. elegans pone unos 300 huevos. Por lo tanto, se reproduce fácilmente para ser utilizado como material experimental3,4,5. C. elegans ha sido también ampliamente utilizado en los estudios toxicológicos de muchos fármacos y contaminantes ambientales6,7,8,9.
Porque muchas drogas anticáncer destino rápidamente dividir las células cancerosas, también pueden dañar rápidamente dividiendo las células normales como médula ósea, epitelio intestinal y las células del folículo del pelo. Por ejemplo, fármacos antineoplásicos inhibidores topoisomerasa blanco el proceso de replicación del ADN de las células cancerosas; por lo tanto, inhiben rápidamente dividiendo las células normales. Todo organismo vivo tiene Topoisomerasas y estos topoisomerase inhibidores más probable impacto ambiental de los ecosistemas6,10,11. Así, una plataforma de evaluación toxicológica de drogas usando un animal modelo es valiosa para ambos el desarrollo de fármacos y evaluación del riesgo medioambiental.
En este artículo, se describen los protocolos detallados para probar la toxicidad de etopósido, que es un agente contra el cáncer clínico objetivos del topoisomerase II, como una sustancia química tóxica de modelo en C. elegans. Para ello, describiremos el método de medición del tamaño corporal y el número total de huevos puestos en C. elegans tratados con etopósido.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Affymetrix, USA</td><td>10906</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis elegans&lt;/em&gt; N2</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>Wild type</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma, USA</td><td>C3045</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma, USA</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli &lt;/em&gt;OP50</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etoposide</td><td>Sigma, USA</td><td>E1383</td><td></td></tr><tr><td>Image J software (ver 1.4)</td><td>Natinoal Institute of Health, USA</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>Microscope camera</td><td>Jenopitk, Progress Gryphax, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Merck, USA</td><td>107213</td><td></td></tr><tr><td>35 &amp;times; 10 mm Petri dish</td><td>SPL Life Sciences, South Korea</td><td>10035</td><td></td></tr><tr><td>90 &amp;times; 15 mm Petri dish</td><td>SPL Life Sciences, South Korea</td><td>10090</td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Nikon, Japan</td><td>SMZ800N</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Becton Dickinson, USA</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring the effect of chemicals on the growth and reproduction of caenorhabditis elegans

Evaluación toxicológica es crucial para entender los efectos de sustancias químicas en los organismos vivos en los campos de la ciencia biológica básica y aplicada. Un suelo no mamíferos ronda gusano, Caenorhabditis elegans, es un organismo modelo valioso para estudios de Toxicología por su comodidad y la falta de temas de ética animal en comparación con sistemas de animales mamíferos. En este protocolo, se describe un procedimiento detallado de evaluación toxicológica de sustancias químicas en C. elegans . Un medicamento contra el cáncer clínico, etopósido, que dirige humano topoisomerasa II e inhibe la replicación del ADN de las células cancerosas humanas, fue seleccionado como modelo de pruebas químicas. Edad-sincronizado C. elegans huevos estaban expuestos a dimetilsulfóxido (DMSO) o etopósido, y entonces el crecimiento de C. elegans fue monitoreado cada día durante 4 días por la observación del microscopio estéreo. El número total de huevos puestos de C. elegans tratados con DMSO o etopósido también fue contado utilizando el microscopio estéreo. Etoposide tratamiento afectó significativamente el crecimiento y la reproducción de C. elegans. Por la comparación del número total de huevos de gusanos con períodos diferentes de tratamiento de productos químicos, se puede decidir que la toxicidad para la reproducción de productos químicos en la reproducción de C. elegans es reversible o irreversible. Estos protocolos pueden ser útiles para ambos el desarrollo de varias drogas y evaluación de riesgos de sustancias tóxicas ambientales.

El tratamiento de etopósido (24-96 h) había retarda significativamente el crecimiento de C. elegans. Después de 96 h de incubación, gusanos tratados con etopósido crecieron 0,86 mm de longitud corporal, mientras que los gusanos tratados con vehículo crecieron a 1,04 mm (figura 1). Retraso de crecimiento se observó también al parecer bajo observación microscopio estéreo (figura 2). Empezamos a ver los huevos de ...

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Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Se describe un protocolo básico para evaluar la toxicidad de productos químicos en un animal modelo, elegans de Caenorhabditis. El método es conveniente y útil para el desarrollo de productos farmacéuticos, así como para la evaluación del riesgo de diversos contaminantes ambientales.

Medir el efecto de productos químicos sobre el crecimiento y reproducción de Caenorhabditis elegans

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

16.9K vistas.  Korea Institute of Science and Technology. Se describe un protocolo básico para evaluar la toxicidad de productos químicos en un animal modelo, elegans de Caenorhabditis. El método es conveniente y útil para el desarrollo de productos farmacéuticos, así como para la evaluación del riesgo de diversos contaminantes ambientales.

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Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Evaluación completa de la línea germinal Química de toxicidad de los nematodos<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Investigación

Biología del Desarrollo

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

Un método Simple para la detección química de alto rendimiento en Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Bioquímica

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and maintenance issues. On the contrary, the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) has advantages to make it an ideal choice for toxicity testing: a short lifespan, easy cultivation, and efficient reproduction. Here, we describe a protocol for the automatic phenotypic profiling of C. elegans in a 384-well plate. The nematode worms are cultured in a 384-well plate with liquid medium and chemical treatment, and videos are taken of each well to quantify the chemical influence on 33 worm features. Experimental results demonstrate that the quantified phenotype features can classify and predict the acute toxicity for different chemical compounds and establish a priority list for further traditional chemical toxicity assessment tests in a rodent model.

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

A quantitative method has been developed to identify and predict the acute toxicity of chemicals by automatically analyzing the phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. This protocol describes how to treat worms with chemicals in a 384-well plate, capture videos, and quantify toxicological related phenotypes.

Un análisis de alto rendimiento para la predicción de toxicidad química por perfiles fenotípicos automatizado de Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

Medio ambiente

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Information about toxicities of chemicals are essential in their application and waste management. For chemicals at low concentrations, the long-term effects are very important in judging their consequences in the environment and on human health. In demonstrating long-term influences, effects of chemicals over generations in recent studies provide new insight. Here, we describe protocols for studying effects of chemicals over multiple generations using free-living nematode Caenorhabditis elegans. Two aspects are presented: (1) trans-generational (TG) and (2) multi-generational effect studies, the latter of which is separated to multi-generational exposure (MGE) and multi-generational residual (MGR) effect studies. The TG effect study is robust with a simple purpose to determine whether chemical exposure to parents can result in any residual consequences on offspring. After the effects are measured on parents, sodium hypochlorite solutions are used to kill the parents and keep the offspring so as to facilitate effect measurement on the offspring. The TG effect study is used to determine whether the offspring are affected when their parent is exposed to the pollutants. The MGE and MGR effect study is systematical used to determine whether continuous generational exposure can result in adaptive responses in offspring over generations. Careful pick-up and transfer are used to distinguish generations to facilitate effect measurement on each generation. We also combined protocols to measure locomotion behavior, reproduction, lifespan, biochemical and gene expression changes. Some example experiments are also presented to illustrate the trans- and multi-generational effect studies.

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Trans- and multi-generational effects of persistent chemicals are essential in judging their long-term consequences in the environment and on the human health. We provide novel detailed methods for studying trans- and multi-generational effects using free-living nematode Caenorhabditis elegans.

Uso de Caenorhabditis elegans para el estudio de los efectos trans y multigeneracionales de los tóxicos

Information about toxicities of chemicals are essential in their application and waste management. For chemicals at low concentrations, the long-term ...

Ensayo de alto rendimiento para medir la ingesta de alimentos y la esperanza de vida de Caenorhabditis elegans

Quantifying Food Intake in Caenorhabditis elegans by Measuring Bacterial Clearance

Feeding is an essential biological process for an organism&#39;s growth, reproduction, and survival. This assay aims to measure the food intake of Caenorhabditis elegans&#160;(C. elegans), an important parameter when studying the genetics of aging or metabolism. In most species, feeding is determined by measuring the difference between the amount of food provided and the amount left after a given time interval. The method presented here uses the same strategy to determine the feeding of C. elegans. It measures the amount of bacteria, the food source of C. elegans, cleared within 72 h. This method uses 96-well microtiter plates and has allowed the screening of hundreds of drugs for their ability to modulate food intake at a speed and depth not possible in other animal models. The strength of this assay is that it allows to measure feeding and lifespan simultaneously and directly measures the disappearance of food and, thus, is based on the same principles used for other organisms, facilitating species-to-species comparison.

Autor destacado: Explorando la relación entre la lipotoxicidad y la HFpEF 

This protocol describes an assay to quantify Caenorhabditis elegans feeding rate based on measuring the clearance of bacteria in liquid culture.

Cuantificación de la ingesta de alimentos en Caenorhabditis elegans mediante la medición del aclaramiento bacteriano

Feeding is an essential biological process for an organism&#39;s growth, reproduction, and survival. This assay aims to measure the food intake of ...

Comportamiento

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C.&#160;elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C.&#160;elegans.

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

Un ensayo para medir los efectos del etanol sobre la velocidad de locomoción<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Neurociencias

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

Medición Caenorhabditis elegans Duración de la vida en 96 placas de microtitulación Bueno

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Biología

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Medición de los efectos de las bacterias en<em&gt; C. Elegans</em&gt; Comportamiento El uso de un ensayo de retención de huevo

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Medir el efecto de productos químicos sobre el crecimiento y reproducción de Caenorhabditis elegans

Resumen

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Capítulos en este video

Evaluación completa de la línea germinal Química de toxicidad de los nematodos

Un método Simple para la detección química de alto rendimiento en Caenorhabditis Elegans

Un análisis de alto rendimiento para la predicción de toxicidad química por perfiles fenotípicos automatizado de Caenorhabditis elegans

Uso de Caenorhabditis elegans para el estudio de los efectos trans y multigeneracionales de los tóxicos

Cuantificación de la ingesta de alimentos en Caenorhabditis elegans mediante la medición del aclaramiento bacteriano

Cuantificación de la ingesta de alimentos en Caenorhabditis elegans mediante la medición del aclaramiento bacteriano

Cuantificación de la ingesta de alimentos en Caenorhabditis elegans mediante la medición del aclaramiento bacteriano

Un ensayo para medir los efectos del etanol sobre la velocidad de locomoción

Medición Caenorhabditis elegans Duración de la vida en 96 placas de microtitulación Bueno

Medición de los efectos de las bacterias en