Este trabajo fue apoyado por becas de ED de la Fundación James S. McDonnell 21 Programa de Premios del siglo XXI, y el Premio a la Innovación Nuevo Director del NIH. GAB fue apoyado en parte por una beca postdoctoral del Instituto de Medicina Regenerativa de California.

1. Análisis de calidad de control de la muestra de ARN con 2100 Bioanalyzer Antes de empezar, <ol><li> Desnaturalizar la escalera y las muestras a 70 ° C durante 10 min. Enfriar inmediatamente en hielo. </li><li> Limpie los electrodos con el instrumento RNaseZAP durante 1 minuto, seguido por RNasa libre de agua durante 10 segundos. Permita que los electrodos se seque al aire. </li><li> Preparar la matriz de gel de pipeta 550 l de la matriz de gel en un filtro de giro incluye en el kit. Centrifugar a 1500 rcf durante 10 min a temperatura ambiente. Alícuota del filtrado de gel en 65 alícuotas y se almacenan a 4 ° C durante un máximo de un mes. </li><li> Para preparar la estación de cebado de chips, <ol class="lalpha"><li> Inserte una jeringa de 1 ml a través del clip y en el adaptador luer lock. </li><li> Ajuste de la placa base a la posición C aflojando el tornillo en la base, el levantamiento de la placa y volver a apretar el tornillo. </li><li> Ajuste el clip de la jeringa hasta la primera posición. </li></ol></li><li> Equilibre el concentrado de tinte a la temperatura ambiente. Vortex durante 10 segundos. Añadir 1 l de medio de contraste para una alícuota de 65 l de gel filtrados. Vortex bien y se centrifuga a 13.000 rcf durante 10 min a temperatura ambiente. Utilizar en un día. Cuando esté listo para ejecutar sus muestras, </li><li> Posición de un chip en la estación de cebado. En este protocolo se está utilizando ARN de 6.000 fichas nano. Para cargar el gel, <ol class="lalpha"><li> Pipetear 9 l de la mezcla de gel colorante en la bien marcada con un fondo de &quot;G&quot; sobre un fondo negro. Asegúrese de que su punta se coloca en el fondo del pozo. </li><li> La posición del émbolo de la jeringa de 1 ml. Cerca de la estación de cebado. Asegúrese de que un clic. </li><li> Presione el émbolo lentamente pero sin pausa hasta que se lleva a cabo por el clip. </li><li> Espere 30 segundos. Suelte el clip. </li><li> Deje que el émbolo sube por sí mismo. Después de que deje de moverse, esperar unos segundos y tire del émbolo hacia atrás a la posición de 1 ml. Abra la estación de cebado. </li></ol></li><li> Pipetear 9 l de la mezcla de gel colorante en cada uno de los dos pozos de la marca &quot;G&quot;. </li><li> Pipeta de 5 l de la marca en cada uno de los 12 pozos de la muestra y en la escalera también. </li><li> Pipeta de 1 l de la escalera en escalera y preparada. </li><li> Pipeta de 1 l de cada muestra en los pocillos de la muestra. </li><li> Pipeta de 1 l de la marca en cada muestra pozo abandonado. </li><li> Vortex el chip durante 1 minuto a 2.400 rpm. </li><li> Para ejecutar el chip, <ol class="lalpha"><li> Inicie el software de expertos para el 2100. </li><li> Coloque el chip y cierre la tapa. Si el instrumento está en línea, aparecerá un icono si la tapa está abierta o cerrada y qué tipo de chip se inserta. Asegúrese de que el puerto correcto está seleccionado. </li><li> Realizar el ensayo dentro de los 5 min de la carga de las muestras para evitar la evaporación. </li></ol></li></ol> 2. Amplificación y etiquetado Para prepararse para el análisis de microarrays, el RNA de muestras se amplifican y etiquetado, por lo general en una reacción basada en la RNA polimerasa T7 3. CDNA de doble cadena se genera por la transcripción reversa. cDNA se utiliza en una reacción de transcripción in vitro para generar lo que se conoce como cRNA. Esta reacción se lleva a cabo en presencia de ribonucleótidos etiquetado, la producción de cantidades de microgramos de ARN marcado para la hibridación de la matriz. La elección de los métodos de amplificación / etiquetado depende de la plataforma de microarrays después de ser utilizado. En esta sección, se describe la generación de la etiqueta fluorescente del ARN utilizando rápida Agilent kit etiquetado Amp. <ol><li> Pipeta de 50 ng a 5 g de ARN en un tubo de 1,5 ml. El volumen no debe superar los 8,3 l. Si es necesario, el concentrado de la muestra de RNA por centrifugación al vacío o precipitación con alcohol. </li><li> Añadir 1,2 l de imprimación T7. </li><li> Llevar a un volumen final de 11,5 ml con agua libre de RNasa. </li><li> Se incuba a 65 ° C durante 10 minutos para desnaturalizar el ARN. Recomendamos el uso de un termociclador con una tapa caliente para evitar la condensación en la parte superior del tubo. </li><li> Durante los 10 minutos de incubación, cálido Buffer 5X primer capítulo a 80 ° C durante 5 min. Vortex y centrifugar. Mantener a temperatura ambiente hasta que esté listo para su uso. </li><li> Después de la incubación de 10 minutos, enfriar rápidamente por la desnaturalización de muestras de ARN en el hielo. </li><li> Prepare la mezcla maestra cDNA. Por reacción, añadir lo siguiente: <ol class="lalpha"><li> 4 l Buffer 5X primer capítulo </li><li> 2 l 0,1 M TDT </li><li> 1 l 10 mM dNTPs </li><li> 1 l MMLV-RT enzima </li><li> 0,5 l de salida RNasa. </li></ol></li><li> Mezcle los componentes invirtiendo el tubo 4 veces. No vórtice. Girar hacia abajo para recoger el contenido en la parte inferior del tubo. </li><li> Añadir 8,5 l de mezcla maestra por muestra. Mix de pipeta hacia arriba y abajo. </li><li> Incubar durante 2 horas a 40 ° C, seguido por 10 min a 65 ° C. Recomendamos el uso de un termociclador con una tapa caliente. </li><li> La transferencia de los tubos en hielo durante 5 min. </li><li> Prepare la mezcla maestra de transcripción. Por reacción, añadir lo siguiente: <ol class="lalpha"><li> 15,3 l agua libre de nucleasa </li><li> 20 lTampón de transcripción 4X </li><li> 6 l 0,1 M TDT </li><li> 8 PNT l </li><li> 6.4 l 50% de PEG (PEG debe precalentado a 40 ° C y vortex para asegurar la resuspensión) </li><li> 0,5 l de RNasa de salida </li><li> 0.6 pirofosfatasa inorgánica l </li><li> 0,8 l T7 RNA polimerasa </li><li> 2,4 l CTP Cy3 o Cy5 </li></ol></li><li> En pocas palabras girar las muestras a recoger el contenido en la parte inferior del tubo. </li><li> Añadir 60 l de mezcla de transcripción maestro por cada muestra. </li><li> Se incuba a 40 ° C durante 2 horas. </li><li> Añadir 20 l de agua libre de RNasa. </li><li> Purificar el cRNA marcado para eliminar los nucleótidos no incorporados. Recomendamos el uso de columnas RNeasy Mini Qiagen. </li><li> Cuantificar la etiqueta cRNA. Recomendamos el uso de un espectrofotómetro NanoDrop2000 en el modo de medición de microarrays. Asegúrese de seleccionar el ARN-40 como el tipo de muestra. </li><li> Registro de concentración de la muestra, el rendimiento (calculado como la concentración multiplicada por el volumen) y la actividad específica (calculada en 1000, multiplicado por la ración de la concentración de colorante sobre la concentración de cRNA). Para la hibridación de microarrays, es necesario para lograr un rendimiento de al menos 825 ng y una actividad específica de al menos 8 pmol / mg. </li></ol> 3. Microarrays de hibridación <ol><li> Encienda la estación de hibridación y regulado a 65 ° C por lo menos 2 horas antes de la hibridación se inicia. </li><li> Para preparar la muestra de la hibridación, mezcla lo siguiente en un tubo de 1,5 ml: <ol class="lalpha"><li> 825 ng Cy3-cRNA (normalmente es el &quot;tratamiento&quot; de la muestra) </li><li> 825 ng Cy5-cRNA (normalmente es el de &quot;referencia&quot; de la muestra) </li><li> 11 l agente de bloqueo de 10 veces. </li><li> Añadir RNasa libre de agua hasta un volumen final de 52,8 l </li><li> Añadir 2,2 l de amortiguación fragmentación. </li></ol></li><li> Vortex a baja velocidad para mezclar. </li><li> Se incuba a 60 ° C durante exactamente 30 minutos. Este es el paso cRNA fragmentación, lo que genera fragmentos etiquetados para la hibridación de la matriz. Es muy importante para la incubación de exactamente como se describe. Se recomienda el uso de un termociclador con una tapa caliente. Es muy importante para la incubación de exactamente como se describe para generar sondas de la longitud media correcta. La fragmentación excesiva o insuficiente, dará lugar a falsos negativos o falsos positivos. </li><li> Añadir 55 l de tampón de hibridación 2X para detener la fragmentación. Mezclar con la pipeta, teniendo especial cuidado de no introducir burbujas. </li><li> Centrifugar durante 1 minuto a velocidad máxima para recoger el contenido en la parte inferior del tubo. Si se observan burbujas, ya centrífuga para eliminarlos. </li><li> Coloque el tubo en hielo, protegido de la luz. Cargue la muestra en la matriz tan pronto como sea posible. </li><li> Para cargar la matriz, primero preparar la cámara de hibridación. Este protocolo describe el uso de arrays 4x44K Agilent con el sistema de hibridación Roche-Nimblegen y cámaras A4 mezclador. <ol class="lalpha"><li> Coloque una diapositiva de microarrays en la parte de código de barras de montaje / desmontaje de herramientas, en primer lugar. </li><li> Abrir una mesa de mezclas A4 y exponer el adhesivo. La celebración de la matriz y el montaje / desmontaje de herramientas para impedir cualquier movimiento, coloque la mezcla A4 en la diapositiva, comenzando en el extremo. Asegúrese de que esté correctamente alineado con la herramienta. Pegue la mesa de mezclas a lo largo de la diapositiva matriz. </li><li> Tire del extremo de la mesa de mezclas para eliminar la diapositiva / dispositivo de mezclas. </li><li> Con la herramienta rebuzno, la prensa a lo largo de la junta adhesiva para asegurarse de que está bien pegado a theslide. Las pequeñas burbujas de aire atrapadas entre el adhesivo y deslice la puede ver sobre un fondo oscuro. Tómese un tiempo extra para eliminar estas burbujas con la herramienta de rebuznar. Su matriz está ahora listo para ser cargado. </li></ol></li><li> Utilice una pipeta de desplazamiento positivo para carga de 100 l de la muestra de la hibridación. Presione la punta firmemente en el interior del orificio del puerto y luego prescindir lenta y suavemente para que el aire no quede atrapado en la zona de la matriz. Nunca trate de succionar la muestra una copia de seguridad. Una vez que toda la muestra se ha dispensado, mantener la punta en el orificio del puerto, sin soltar el émbolo. Cuando la muestra abarca toda la gama y el líquido comienza a salir del orificio de ventilación, eliminar rápidamente la pipeta. Sólo suelte el émbolo una vez que la punta está lejos de la diapositiva. </li><li> Frote suavemente el exceso de líquido en ambos puertos. Asegúrese de que usted no extraer la muestra de la propia cámara. </li><li> Cubrir los orificios con pegatinas con pinzas. </li><li> Poner la diapositiva en la estación de hibridación, y compruebe que los orificios de la vejiga están colocados correctamente en las juntas tóricas. Esto asegurará una mezcla adecuada durante la hibridación. </li><li> Cierre la tapa deslizante y la tapa de la estación. Conjunto de la estación de mezclar el modo B. </li><li> Hibridar la matriz a 65 ° C durante 17 horas. </li><li> Prepare el tampón de lavado 2 mediante la adición de Triton X-102 a una concentración final de 0,005%. Mantener a 37 ° C durante la noche. </li></ol> 4. Microarrays de lavado <ol><li> Añadir Triton X-102 a un tampón de lavado a una concentración final de 0,005%. Mantener a temperatur ambientee. </li><li> Cuando la hibridación es terminado, llenar un vaso plato &quot;A&quot; con el tampón de lavado 1. El plato debe ser suficientemente grande para contener la herramienta de montaje / desmontaje y permitir que algunas maniobras también. Todos los lavados se debe hacer en recipientes de vidrio. Evite los platos de plástico, ya que tienden a lixiviar los compuestos resultantes de fondo en alta en la matriz. </li><li> Ponga una rejilla de diapositivas y una barra agitadora en una placa de tinción &quot;B&quot;. Rellenar con un tampón de lavado, asegurándose de que cubre el bastidor. Colocar en una placa de agitación a temperatura ambiente. </li><li> Ponga una barra de agitación en un plato de tinción vacío &quot;C&quot; y colocar en una placa de agitación. </li><li> Eliminar la matriz y lo puso en la herramienta de montaje / desmontaje. Sumergir a toda la asamblea en el plato &quot;A&quot;. </li><li> Mientras sostiene la herramienta de montaje / desmontaje y deslice la de los lados opuestos con una mano, con cuidado retire el mezclador A4. Asegúrese de que no se rasque el área de la matriz. </li><li> Rápidamente el lugar de la diapositiva en el soporte en la tinción de plato &quot;B&quot;. A partir de ahora, la exposición al aire se debe minimizarse, ya que el tinte Cy5 es sensible a la capa de ozono. No lavar más de 8 conjuntos a la vez. </li><li> Lávese las manos por un minuto de agitación a velocidad media. </li><li> Rellene tinción plato &quot;C&quot; con tampón de lavado precalentado 2. Transferencia de las diapositivas y de lavado de 1 minuto. </li><li> Muy lentamente quitar la rejilla de diapositivas de las manchas plato &quot;C&quot; para reducir al mínimo las gotas dejaron atrás en la diapositiva. </li><li> Seco de la diapositiva al hacer girar durante 2 minutos. Si una centrífuga compatible no está disponible, se centrifuga la diapositiva en un tubo cónico de 50 ml o un golpe de gas argón en él. </li><li> Colocar los portaobjetos en un tubo cónico de 50 ml y llenarlo con gas argón. Exploración de inmediato para evitar la pérdida de señal. Se recomienda el uso del escáner GenePix 4000B de Molecular Devices. </li></ol> 5. Los resultados representativos: Buenas muestras de la calidad del ARN total debe producir sólo dos picos más importantes se ejecutan en un Bioanalyzer de control de calidad, correspondientes a las dos principales especies de ARN ribosomal. Algunos la degradación del ARN se verá como una prueba antes de que el primer pico de ARN ribosomal. Severamente degradados, el ARN de baja calidad se muestran un pico ancho y una serie de picos en los tiempos de retención baja, mientras que los dos picos de ARN ribosomal será de muy baja intensidad o no ser identificada en absoluto. Para ver ejemplos de la salida de 2100 Bioanalyzer, véase la figura 1. El experto 2100 software calculará un número de la integridad del ARN, o RIN, como una medida cuantitativa de la calidad del ARN. Muestras de alta calidad, con valores de RIN superior a 9, son, evidentemente, mejor para las aplicaciones de microarrays. Sin embargo, se han utilizado muestras con valores de RIN tan bajo como 5,2 en la generación de datos de microarrays de calidad razonable. Matrices de buena calidad debe producir una señal de alto en el PMT valores relativamente bajos. En nuestro experimento, la mayoría de las transcripciones se espera que estén presentes en niveles similares en la muestra experimental y de referencia; cambios masivos, muy extendida en la expresión de genes probablemente carecen de importancia biológica. Por lo tanto, la mayor parte de la matriz debe tener un color amarillento en vez de verde o rojo. Señales de buena calidad también debe estar en un rango dinámico de tal manera que los histogramas de señal totalmente superponen. Para ejemplos, véase la figura 2. <img src="/files/ftp_upload/2546/2546fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Ejemplo de cuatro muestras de ARN aislado de los tejidos humanos tumor cerebral. RNA fue aislado utilizando el protocolo presentado en el punto 3.1.1. Calidad de la muestra se evaluó utilizando el Bioanalyzer 2100 en un chip 6000 de ARN como se describe en el punto 3.1.3. Muestras sean representativas de cuatro distintas cualidades de ARN: una, muy buena la calidad del ARN (RIN&gt; 9), B, parcialmente degradados ARN (RIN 5-6, tenga en cuenta el pico significativamente menor de 28S ARNr), C, muy degradados ARN (RIN &lt; 3), D, casi totalmente degradadas ARN (RIN = 2). Hemos utilizado con éxito muestras con características similares o superiores a B (RIN&gt; 5.2) para aplicaciones de microarrays de aguas abajo. Puntas de flecha sólida y abierta indicar la posición del 18S y 28S rRNA especies, respectivamente. <img src="/files/ftp_upload/2546/2546fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Ejemplos de imágenes de la matriz y los diagramas de dispersión. A ver, conjunto de diapositivas, que muestra las cuatro matrices en el formato 4X44K Agilent, B, escaneo de alta resolución de una de las áreas de la matriz, tenga en cuenta que ninguna de las señales (rojo o verde) es predominante; C, gráfico de dispersión de la imagen en B, tenga en cuenta que las señales se solapan por completo y no más de 1x10 -6 características se encuentran en la intensidad de saturación.

<ol>
	<li>Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+Decade+Later:+What+has+Gene+Expression+Profiling+Told+us+About+Neuronal+Cell+Types,+Brain+Function+and+Disease.">One Decade Later: What has Gene Expression Profiling Told us About Neuronal Cell Types, Brain Function and Disease.</a> Curr Genomics. 10, 318-318 (2009).</li><li>Barisone, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Expression profiling in Neuroscience, edited by Ioannis Karamanos. , (2010).</li><li>Gelder, R. N. V. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA.">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 1663-1663 (1990).</li></ol>

Perfiles de expresión con microarrays de ADN proporciona un método sencillo para identificar genes expresados ​​diferencialmente entre las dos muestras biológicas. El éxito de los experimentos de perfiles de expresión requieren alta calidad de las muestras de ARN, el etiquetado y la hibridación robusta. En nuestra experiencia, las matrices comerciales y equipos de etiquetado de Agilent proporcionan datos de alta calidad a un costo razonable. Mientras Agilent también ofrece su hibridación y maquinaria de exploración, estamos a favor del sistema de hibridación de Roche-Nimblegen y el GenePix 4000B escáner de microarrays de Molecular Devices. Tenga en cuenta que la unidad de hibridación Roche-Nimblegen era conocido como el sistema de hibridación MAUI. Después de la reciente adquisición corporativa de Roche, los mezcladores A4 han sido descontinuados. A partir del momento de escribir esto, todavía se pueden encontrar a través de otros vendedores como los diagnósticos Kreatech ( <a href="http://www.kreatech.com/">www.kreatech.com</a> ; este sitio web también ofrece una herramienta de amplia compatibilidad conveniente), pero a largo plazo la disponibilidad de stock es incierta. Otros sistemas de hibridación están disponibles (por ejemplo, de Agilent), sin embargo, si mezcladores compatibles se pueden encontrar por la matriz utilizada, se recomienda el sistema de la Roche-NimbleGen por su calidad y reproducibilidad.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>2100 Bioanalyzer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>G2943CA</td>
<td>Includes chip priming station, vortexer, software and laptop computer</td>
</tr>
<tr>
<td>2100 Bioanalyzer electrophoresis set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>G2947CA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNA 6000 Nano kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>5067-1511</td>
<td>includes size ladder, marker, gel matrix, dye, electrode cleaners, spin filters and nanochips</td>
</tr>
<tr>
<td>RNase Zap</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems &#x2013; Ambion</td>
<td>AM9780M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Quick Amp labeling kit, two-color</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>5190-0444</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNeasy mini kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>74104</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gene Expression Hybridization Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>5188-542</td>
<td>Includes Blocking agent, Fragmentation buffer and Hybridization buffer</td>
</tr>
<tr>
<td>Gene Expression Wash Buffer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>5188-5327</td>
<td>Includes Wash Buffers 1 and 2 and Triton X-102</td>
</tr>
<tr>
<td>Hybridization Station</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Nimblegen</td>
<td>05223652001</td>
<td>4-slide model</td>
</tr>
<tr>
<td>Hybridization System Accesory Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Nimblegen</td>
<td>05327695001</td>
<td>Contains verification assembly for testing mixing, replacement O-rings, disassembly tool, forceps and brayer</td>
</tr>
<tr>
<td>A4 mixer hybridization chambers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Whole Human Genome (4x44) Oligo Microarray</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>G4112F</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Positive displacement pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gilson</td>
<td>F148504</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Capillary pistons for positive displacement pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gilson</td>
<td>F148415</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microarray dryer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nimblegen</td>
<td>05223636001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microarray fluorescent scanner, Axon GenePix 4000B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>GENEPIX4000B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GenePix Pro 6.0 software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

dna microarrays: sample quality control, array hybridization and scanning

Microarrays de perfiles de expresión del sistema nervioso proporciona un enfoque de gran alcance para la identificación de las actividades de genes en diferentes etapas de desarrollo, diferentes estados fisiológicos o patológicos, la respuesta al tratamiento, y, en general, cualquier condición que está siendo probado experimentalmente 1. Perfiles de expresión de los tejidos neurales requiere el aislamiento de ARN de alta calidad, la amplificación del ARN aislado y la hibridación de microarrays de ADN. En este artículo se describen los protocolos de los experimentos de microarrays reproducible a partir de tejido del tumor cerebral 2. Vamos a empezar realizando un análisis de control de calidad de aislados de muestras de ARN con 2100 de Agilent Bioanalyzer &quot;lab-on-a-chip&quot; de tecnología. De alta calidad las muestras de ARN son esenciales para el éxito de cualquier experimento de microarrays, y el Bioanalyzer 2100 proporciona una medición rápida y cuantitativa de la calidad de la muestra. Muestras de ARN se amplifican y etiquetados mediante la realización de la transcripción reversa para obtener ADNc, seguido por la transcripción in vitro en presencia de nucleótidos marcados para producir la etiqueta cRNA. Mediante el uso de un kit de marcaje de dos colores, que se etiqueta de la muestra experimental con Cy3 y una muestra de referencia con Cy5. Ambas muestras serán combinadas y se hibridan a las matrices K 4x44 de Agilent. Dos colores arrays ofrecen la ventaja de una comparación directa entre dos muestras de ARN, lo que aumenta la precisión de las mediciones, en particular para los pequeños cambios en los niveles de expresión, ya que las dos muestras de ARN se hibridan de manera competitiva a una sola micromatriz. Las matrices se analizarán en las dos longitudes de onda correspondientes, y la proporción de Cy3 a Cy5 señal para cada función se utiliza como una medida directa de la abundancia relativa del ARNm correspondiente. Este análisis identifica los genes que se expresan diferencialmente en respuesta a las condiciones experimentales se está probando.

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DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Se demuestra el uso de microarrays de ADN para la expresión de perfiles del sistema nervioso. Se describe el control de ARN de calidad, etiquetado de la muestra, y la hibridación de la matriz y de exploración.

Microarrays de ADN: Control de calidad de la muestra, la hibridación de la matriz y de escaneo

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

dna-microarrays-sample-quality-control-array-hybridization

Research

JoVE Journal

Biology

37.8K vistas.  University of California, Davis. Se demuestra el uso de microarrays de ADN para la expresión de perfiles del sistema nervioso. Se describe el control de ARN de calidad, etiquetado de la muestra, y la hibridación de la matriz y de exploración.

Video: DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Technical Demonstration of Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1. Recent advances in this technology have enabled high resolution comparison of whole genomes for the identification of genetic alterations in cancer and other genetic diseases 2. The Sub-Megabase Resolution Tiling-set array (or SMRT) array is comprised of a set of approximately thirty thousand overlapping bacterial artificial chromosome (BAC) clones that span the human genome in ~100 kilobase pair (kb) segments 2. These BAC targets are individually synthesized and spotted in duplicate on a single glass slide 2-4. Array CGH is based on the principle of competitive hybridization. Sample and reference DNA are differentially labeled with Cyanine-3 and Cyanine-5 fluorescent dyes, and co-hybridized to the array. After an incubation period the unbound samples are washed from the slide and the array is imaged. A freely available custom software package called SeeGH (www.flintbox.ca) is used to process the large volume of data collected - a single experiment generates 53,892 data points. SeeGH visualizes the log2 signal intensity ratio between the 2 samples at each BAC target which is vertically aligned with chromosomal position 5,6. The SMRT array can detect alterations as small as 50 kb in size 7. The SMRT array can detect a variety of DNA rearrangement events including DNA gains, losses, amplifications and homozygous deletions. A unique advantage of the SMRT array is that one can use DNA isolated from formalin fixed paraffin embedded samples. When combined with the low input requirements of unamplified DNA (25-100ng) this allows profiling of precious samples such as those produced by microdissection 7,8. This is attributed to the large size of each BAC hybridization target that allows the binding of sufficient labeled samples to produce signals for detection. Another advantage of this platform is the tolerance of tissue heterogeneity, decreasing the need for tedious tissue microdissection 8. This video protocol is a step-by-step tutorial from labeling the input DNA through to signal acquisition for the whole genome tiling path SMRT array.

This video is a technical demonstration of the hybridization protocol for whole genome tiling path array CGH, which scans the entire human genome using only 25-100 ng of DNA that can be isolated from a variety of sources, including archival formalin fixed material.

Demostración de técnicas de hibridación del genoma entero matriz Genómica Comparativa

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1.  Recent ...

Investigación

Biología

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

Un cabello no invasiva técnica de muestreo para obtener ADN de alta calidad de esquiva Pequeños Mamíferos

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, distinct microenvironments can impose differentiation, migration, and proliferation phenotypes, and on the tissue level the microenvironment processes as complex as morphogenesis and tumorigenesis1. Not only do the cell and molecular contents of microenvironments impact the cells within, but so do the elasticity2 and geometry3 of the tissue. Defined as the sum total of cell-cell, -ECM, and -soluble factor interactions, in addition to physical characteristics, the microenvironment is complex. The phenotypes of cells within a tissue are partially due to their genomic content and partially due to the combinatorial interactions with the microenviroment. A major challenge is to link specific combinations of microenvironmental components with distinctive behaviours.
Here, we present the microenvironment microarray (MEArray) platform for cell-based functional screening of interactions with combinatorial microenvironments4. The method allows for simultaneous control of the molecular composition and the elastic modulus, and combines the use of widely available microarray and micropatterning technologies. MEArray screens require as few as 10,000 cells per array, which facilitates functional studies of rare cell types such as adult progenitor cells. A limitation of the technology is that entire tissue microenvironments cannot be completely recapitulated on MEArrays. However, comparison of responses in the same cell type to numerous related microenvironments, for instance pairwise combinations of ECM proteins that characterize a given tissue, will provide insights into how microenvironmental components elicit tissue-specific functional phenotypes.
MEArrays can be printed using a wide variety of recombinant growth factors, cytokines, and purified ECM proteins, and combinations thereof. The platform is limited only by the availability of specific reagents. MEArrays are amenable to time-lapsed analysis, but most often are used for end point analyses of cellular functions that are measureable with fluorescent probes. For instance, DNA synthesis, apoptosis, acquisition of differentiated states, or production of specific gene products are commonly measured. Briefly, the basic flow of an MEArray experiment is to prepare slides coated with printing substrata and to prepare the master plate of proteins that are to be printed. Then the arrays are printed with a microarray robot, cells are allowed to attach, grow in culture, and then are chemically fixed upon reaching the experimental endpoint. Fluorescent or colorimetric assays, imaged with traditional microscopes or microarray scanners, are used to reveal relevant molecular and cellular phenotypes (Figure 1).

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

A combinatorial functional screening method for gaining insights into the impacts of the molecular composition of microenvironments on cellular functions is described. The method takes advantage of existing microarray-based technologies to generate arrays of defined combinatorial microenvironments that support cell adhesion and functional analysis.

Fabricación y uso de microarrays microambiente (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

Perfiles de Polímeros Glycan la pared celular vegetal utilizando microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.

Matriz de hibridación genómica comparada (CGH array) para la detección de número de copias genómicas variantes

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Método simple de ADN de fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridación a los cromosomas aplastado

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state by transmission electron microscopy (TEM). This can be achieved with very low quantity of protein and in the buffer of choice, without the use of any stain, which is very useful to determine structure-function correlations of macromolecules. When combined with single-particle image processing, the technique has found widespread usefulness for 3D structural determination of purified macromolecules. 
The protocol presented here explains how to perform cryoEM and examines the causes of most commonly encountered problems for rational troubleshooting; following all these steps should lead to acquisition of high quality cryoEM images. The technique requires access to the electron microscope instrument and to a vitrification device. Knowledge of the 3D reconstruction concepts and software is also needed for computerized image processing. Importantly, high quality results depend on finding the right purification conditions leading to a uniform population of structurally intact macromolecules. 
The ability of cryoEM to visualize macromolecules combined with the versatility of single particle image processing has proven very successful for structural determination of large proteins and macromolecular machines in their near-native state, identification of their multiple components by 3D difference mapping, and creation of pseudo-atomic structures by docking of x-ray structures. The relentless development of cryoEM instrumentation and image processing techniques for the last 30 years has resulted in the possibility to generate de novo 3D reconstructions at atomic resolution level.

Do&#039;s and Don&#039;ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

Qué hacer y qué no hacer de crio-microscopía electrónica: Una introducción a la preparación de muestras y de alta calidad de recopilación de datos para la Reconstrucción de Macromoléculas 3D

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplificación, secuenciación de próxima generación, y Genómica Mapeo de ADN retrovirales sitios de integración

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase synthesis using standard phosphoramidite chemistry. Oligonucleotides are post-synthetically labeled by two new photostable cyanine dyes using copper-catalyzed click-chemistry. The synthesis of both donor and acceptor dye is described and is performed in three consecutive steps. With the DNA as the surrounding architecture, these two dyes undergo an energy transfer when they are brought into close proximity by hybridization. Therefore, annealing of two single stranded DNA strands is visualized by a change of fluorescence color. This color change is characterized by fluorescence spectroscopy but can also be directly observed by using a handheld ultraviolet (UV) lamp. The concept of a dual fluorescence color readout makes these oligonucleotide probes excellent tools for molecular imaging especially when the described photostable dyes are used. Thereby, photobleaching of the imaging probes is prevented, and biological processes can be observed in real time for a longer time period.

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

Síntesis de ADN sondas de hibridación de longitud de onda de desplazamiento mediante fotoestable Cyanine Dyes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

Estudiar el Sistema de Control de Calidad de la Proteína<em&gt; D. discoideum</em&gt; Uso de imágenes de células vivas con temperatura controlada

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...