Damos las gracias a Ron Davis, Deutschbauer Adán, y el laboratorio de HIP HOP todo en la Universidad de Toronto para el debate y asesoramiento. CN es apoyado por becas de la National Human Genome Research Institute (número de concesión HG000205), RO1 HG003317, CIHR MOP-84305, y la Sociedad Canadiense del Cáncer (# 020380). JO fue apoyada por el Programa de Entrenamiento de Stanford Genome (número de concesión T32 HG00044 de la National Human Genome Research Institute) y los Institutos Nacionales de Salud (número de concesión P01 GH000205). GG es apoyado por el NHGRI HG003317 SR1 y la Sociedad Canadiense del Cáncer, subvención n º 020380, TD y el Centro de Secuenciación Donnelly es apoyado en parte por subvenciones de la Fundación Canadiense para la Innovación a los Dres. Brenda Andrews y Greenblatt Jack. AMS es apoyado por una beca de la Universidad de Toronto en Abrir.

<ol>
	<li>Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome.">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418, 387-391 (2002).</li><li>Baba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+the+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Molecular systems biology. 2, 2006.0008-2006.0008 (2006).</li><li>Claus, H., Frosch, M., Vogel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+hotspot+for+transformation+of+Neisseria+meningitidis+by+shuttle+mutagenesis+using+signature-tagged+transposons.">Identification of a hotspot for transformation of Neisseria meningitidis by shuttle mutagenesis using signature-tagged transposons.</a> Mol Gen Genet. 259, 363-371 (1998).</li><li>Hava, D. 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No hay conflictos de interés declarado.

En este sentido, se indica un protocolo que, con la modificación de modesto, se puede adaptar fácilmente a una amplia gama de las colecciones existentes de código de barras colecciones de mutantes de microorganismos diferentes para crear colecciones de mutantes marcados. Hacemos hincapié en que, si bien nos han informado de un protocolo sobre la mutagénesis de transposones etiquetados para el patógenos levadura C. albicans, un protocolo muy similar podría ser adaptado a una amplia variedad de hongos unicelulares. Modificado, este protocolo funciona muy bien en las bacterias 13, y en la actualidad las colecciones de un número adicional de genomas de hongos y bacterias se encuentran en construcción. En la actualidad, este ensayo proporciona la única completa de todo el genoma de pantalla imparcial de las interacciones gen-molécula pequeña. Una característica particularmente atractiva de este ensayo es que ningún conocimiento previo del gen o una molécula pequeña es necesaria. A pesar del alcance y el poder de estos ensayos, que se puedan transferir a otros laboratorios se ha visto obstaculizada tanto por la inversión de capital inicial y las herramientas informáticas para el análisis de los resultados. Con la adopción de una lectura de la generación siguiente secuencia en combinación con potentes herramientas para el análisis, se espera su aprobación para aumentar.

<table border="1"><tbody><tr><td> Antibióticos </td><td> Proveedor y números de catálogo </td></tr><tr><td> Carbenicilina </td><td> Sigma, parte # C1613 </td></tr><tr><td> Kanamicina </td><td> Sigma, parte # K1876 </td></tr><tr><td> espectinomicina </td><td> Sigma, parte # S0692 </td></tr><tr><td> Cloranfenicol </td><td> Sigma, parte # C0378 </td></tr><tr><td> ADN de limpieza y kits de concentración </td><td></td></tr><tr><td> QIAprep Spin Miniprep Kit </td><td> Qiagen, parte # 27106 </td></tr><tr><td> Kit Hi-Speed ​​Maxi plásmido </td><td> Qiagen, parte # 12663 </td></tr><tr><td> QIAquick PCR kit de purificación </td><td> Qiagen, parte # 28106 </td></tr><tr><td> QIAquick Gel Extraction Kit </td><td> Qiagen, parte # 28704 </td></tr><tr><td> PCR y los reactivos de electroforesis </td><td></td></tr><tr><td> Taq ADN polimerasa (Mg libre) Buffer </td><td> New England Biolabs, parte # M0320L </td></tr><tr><td> Mezcle la solución desoxinucleótidos </td><td> New England Biolabs, parte # N0447L </td></tr><tr><td> 25 mM MgCl 2 </td><td> Sigma, parte # 63036 </td></tr><tr><td> Agarosa, colorante de carga, y el ácido nucleico mancha adecuada para electroforesis en gel </td><td> Varios </td></tr><tr><td> 10X tampón TAE </td><td> Sigma, parte # T8280 </td></tr><tr><td> Más de 1 Kb DNA Ladder </td><td> Invitrogen, parte # 10787026 </td></tr><tr><td> YPD caldo </td><td></td></tr><tr><td> 10 g de extracto de levadura </td><td> Sigma, parte # Y1625 </td></tr><tr><td> 20 g de Bacto peptona </td><td> BD Biosciences, parte # 211677 </td></tr><tr><td> 20 g de dextrosa </td><td> Sigma, parte # D9434 </td></tr><tr><td> Material de laboratorio </td><td></td></tr><tr><td> Pipetas multicanal (1000, 200, y el l 20) </td><td> Varios </td></tr><tr><td> Depósitos desechables pipeteo </td><td> Varios </td></tr><tr><td> 15 y 50 tubos de centrifugación ml </td><td> Varios </td></tr><tr><td> 96 - y 384-Pozo Profundo placas </td><td> Axygen Scientific, parte # P-2ML-SQ-CS &amp; P 384240SQCS- </td></tr><tr><td> 96 y 384 así-PCR placas y película de sellado </td><td> Varios </td></tr><tr><td> Compactador para el sellado de varias placas </td><td> Sigma, parte # R1275 </td></tr><tr><td> 30 ° C y 37 ° C agitando incubadoras para el cultivo de bacterias y levaduras en las placas y tubos </td><td> Varios </td></tr><tr><td> Transposón mutagénesis in vitro </td><td></td></tr><tr><td> EZ-Tn5 transposasa </td><td> Epicentro biotecnologías, parte # TNP92110 </td></tr><tr><td> De alto rendimiento de la transformación </td><td></td></tr><tr><td> Seqprep 96 HT Kit de Preparación plásmido </td><td> Borde Biosystems, part # 84359 </td></tr><tr><td> polietilenglicol, peso molecular 3350 </td><td> Varios </td></tr><tr><td> acetato de litio </td><td> Sigma, parte # 517992 </td></tr><tr><td> Placas de 6 pocillos, estériles </td><td> Corning, parte # 3335 </td></tr><tr><td> 50 mg / ml uridina </td><td> Sigma, parte # U3750 </td></tr><tr><td> 100X Tris-EDTA solución </td><td> Sigma, parte # T9285 </td></tr><tr><td> 1X TE/0.1M LiOAc </td><td> Varios </td></tr><tr><td> salmón testículos ADN </td><td> Sigma, parte # 1626 </td></tr><tr><td> El crecimiento de las colecciones de código de barras </td><td></td></tr><tr><td> 48 placas, y si en las placas de crecimiento de cultivos </td><td> Greiner, parte # M9437 </td></tr><tr><td> Sellos adhesivos placa </td><td> ABgene, parte # AB-0580 </td></tr><tr><td> 200 ml frascos de cultivo </td><td> Varios </td></tr><tr><td> Espectrofotómetro capaz de absorbancia </td><td> Varios </td></tr><tr><td> Con control de temperatura agitador de matraces de 250 ml o espectrofotómetro temblor </td><td> Varios </td></tr><tr><td> Safe-Lock Microcentrífuga tubo, 2 mL </td><td> Eppendorf, parte # 0030 120.094 </td></tr><tr><td> Hibridación equipo </td><td></td></tr><tr><td> Horno de hibridación 640 </td><td> Affymetrix, parte # 800138 </td></tr><tr><td> GeneChip neumático Estación 450 </td><td> Affymetrix, pieza # 00-0079 </td></tr><tr><td> GeneArray Scanner 3000 </td><td> Affymetrix, pieza # 00-0212 </td></tr><tr><td> Baño de agua hirviendo con bastidor flotante </td><td> Varios </td></tr><tr><td> Consumibles de hibridación </td><td></td></tr><tr><td> Genflex etiqueta 16K matriz v2 </td><td> Affymetrix, parte # 511331 </td></tr><tr><td> Solución de Denhardt, concentrado 50 veces </td><td> Sigma, parte # D2532 </td></tr><tr><td> Estreptavidina, R-ficoeritrina conjugado (SAPE) </td><td> Invitrogen, parte # S866 </td></tr><tr><td> Safe-Lock Microcentrífuga tubos de 0,5 mL </td><td> Eppendorf, parte # 0030 123.301 </td></tr><tr><td> Teeny Tough-Spots </td><td> Diversificación de la biotecnología, parte # LTTM-1000 </td></tr><tr><td> EDTA 0,5 M </td><td> BioRad, part # 161-0729 </td></tr><tr><td> 10% de Tween </td><td> Sigma, parte # T2700 </td></tr><tr><td> MES monohidrato de ácido libre </td><td> Sigma, parte # M5287 </td></tr><tr><td> MES sal de sodio </td><td> Sigma, parte # M5057 </td></tr><tr><td> 5 M NaCl </td><td> Sigma, parte # 71386 </td></tr><tr><td> 20X PEES </td><td> Sigma, parte # S2015 </td></tr><tr><td> La biología molecular del agua de grado </td><td> Sigma, parte # W4502 </td></tr><tr><td> Primers hibridación </td><td> Varios proveedores (desalación estándar) </td></tr><tr><td> Uptag </td><td> 5 &#39;GATGTCCACGAGGTCTCT 3&#39; </td></tr><tr><td> Buptagkanmx4 </td><td> 5 &#39;con biotina GTCGACCTGCAGCGTACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Dntag </td><td> 5 &#39;CGGTGTCGGTCTCGTAG 3&#39; </td></tr><tr><td> Bdntagkanmx4 </td><td> 5 &#39;con biotina GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3&#39; </td></tr><tr><td> B213 </td><td> 5 &#39;con biotina CTGAACGGTAGCATCTTGAC 3&#39; </td></tr><tr><td> Uptagkanmx </td><td> 5 &#39;GTCGACCTGCAGCGTACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Dntagkanmx </td><td> 5&#39;GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3 &#39; </td></tr><tr><td> Uptagcomp </td><td> 5&#39;AGAGACCTCGTGGACATC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Dntagcomp </td><td> 5&#39;CTACGAGACCGACACCG 3 &#39; </td></tr><tr><td> Upkancomp </td><td> 5&#39;CGTACGCTGCAGGTCGAC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Dnkancomp </td><td> 5&#39;CGATGAATTCGAGCTCGTTTTC 3 &#39; </td></tr><tr><td> Secuenciación Primers: Plataforma Illumina </td><td> Varios proveedores </td></tr><tr><td> UpTag Adelante (100um) </td><td> 5 &#39;AAC GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC GAT T GTC CAC GAG GTC TCT 3&#39; </td></tr><tr><td> UpTag inversa (100um) </td><td> 5 &#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T NNNNN GTC CAG CAG CTG CGT ACG 3&#39; </td></tr><tr><td> DownTag Adelante (100um) </td><td> 5 &#39;AAC GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T AAC GAA GAG CTC GAA TTC ATC G 3&#39; </td></tr><tr><td> DownTag inversa (100um) </td><td> 5 &#39;AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T NNNNN CGG TGT TCT CGG CGT AG 3&#39; </td></tr><tr><td> Leer 1 UP-tag siguientes cebadores (100um) </td><td> 5 &#39;GTC CAG CAG CTG CGT ACG 3&#39; </td></tr><tr><td> Leer 1 ABAJO-tag imprimación siguientes (100um) </td><td> 5 &#39;TGT CGG CGG CGT TCT AG 3&#39; </td></tr><tr><td> Lea 2 cebador de secuenciación Índice (de serie Illumina imprimación R1) (100um) </td><td> 5 &#39;AC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T 3&#39; </td></tr><tr><td> Reactivos adicionales Secuenciación / Equipo </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen MinElute 96 UF Kit de purificación de PCR </td><td> Qiagen, parte # 29051 </td></tr><tr><td> Bomba de vacío </td><td> Cualquier proveedor </td></tr><tr><td> Macherey-Nagel vacío en el colector </td><td> Macherey-Nagel, parte # 740 681 </td></tr><tr><td> Invitrogen Quant-iT dsDNA BR Kit de ensayo </td><td> Invitrogen, parte # Q32853 </td></tr><tr><td> Invitrogen Qubit tubos de ensayo </td><td> Invitrogen, parte # Q32856 </td></tr><tr><td> 40% de acrilamida y 1% de N, N&#39;-metilen-bis-acrilamida, 37.5:1 </td><td> Bio Rad, part # 161-0148 </td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> Sigma, parte # T1503-1kg </td></tr><tr><td> Ácido bórico </td><td> Sigma, parte # B6768-500G </td></tr><tr><td> 0,5 M EDTA, pH 8,0 </td><td> Teknova, parte # E0306 </td></tr><tr><td> Persulfato de amonio </td><td> Sigma, parte # A3678-25G </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> Bioshop, parte # TEM001.25 </td></tr><tr><td> Solución de bromuro de etidio </td><td> Bioshop, parte # ETB444.10 </td></tr><tr><td> Acetato de amonio 0,5 M </td><td> Teknova, parte # A2000 </td></tr><tr><td> 10 mM de acetato de magnesio tetrahidratado </td><td> Sigma, parte # M0631-100G </td></tr><tr><td> 1 mM EDTA, pH 8,0 </td><td> Ver 0,5 M EDTA, pH 8,0 </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Varios </td></tr><tr><td> Acetato de sodio, pH 5,2 </td><td> Teknova, parte # S0297 </td></tr><tr><td> Velocidad de vacío </td><td> Varios </td></tr><tr><td> Lea solo racimo kit de generación de </td><td> Illumina, parte # GD-300-1001 </td></tr><tr><td> 36c Secuenciación Kit v4 </td><td>Illumina, parte # FC-104-4002 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table> Receta de TBE 10X <table border="1"><tbody><tr><td> Cantidades </td><td> Reactivos </td></tr><tr><td> 108 gramos </td><td> Tris Base </td></tr><tr><td> 55 gramos </td><td> Ácido bórico </td></tr><tr><td> 40 ml </td><td> 0,5 M EDTA (pH 8,0) </td></tr><tr><td colspan="2"> Añadir dH 2 O a 1 litro marca </td></tr></tbody></table> 12% de poliacrilamida gel receta <table border="1"><tbody><tr><td> Volúmenes </td><td> Reactivos </td></tr><tr><td> 5,8 ml </td><td> 40% de acrilamida y 1% de N, N&#39;-metilen-bis-acrilamida, 37.5:1 </td></tr><tr><td> 12 ml </td><td> dH 2 O </td></tr><tr><td> 2 ml </td><td> TBE 10X </td></tr><tr><td> 140 l </td><td> 10% de persulfato de amonio </td></tr><tr><td> El volumen total de: 20 ml </td><td></td></tr></tbody></table> Uptag mezcla de cebadores: Resuspender Uptag y Buptagkanmx4 cada uno en ddH2O a 100 M, a continuación, mezclar en una proporción de 1:1 para una concentración final de 50 M cada uno. Almacenar a -20 ° C. Downtag mezcla de cebadores: Resuspender Dntag y Bdntagkanmx4 cada uno en ddH2O a 100 M, a continuación, mezclar en una proporción de 1:1 para una concentración final de 50 M cada uno. Almacenar a -20 ° C. Oligonucleótidos mixtos: Resuspender cada uno de los siguientes ocho oligos (estándar desalada) en ddH2O a 100 M: Uptag, Dntag, Uptagkanmx, Dntagkanmx, Uptagcomp, Dntagcomp, Upkancomp, Dnkancomp. Mezclar un volumen igual de los ocho oligonucleótidos para una concentración final de 12,5 M cada uno. 12X MES acciones: De 10 ml, disolver 0,7 g de monohidrato de ácido libre MES y 1,93 g de sal de sodio MES en 8 ml de agua de grado molecular biología. Después de mezclar bien, verificar el pH y ajustar si es necesario a un pH 6.5 a 6.7. Añadir agua hasta un volumen total de 10 ml. Filtro de esterilizar y almacenar a 4 ° C protegido de la luz (por ejemplo, envolver el tubo de papel de aluminio). Reemplace si la solución se vuelve visiblemente amarilla o después de 6 meses. Tampón de hibridación 2X: De 50 ml, mezclar 8,3 ml de 12X MES acciones (de 02/09/14), 17,7 ml de 5 M NaCl, 4,0 ml de EDTA 0,5 M, 0,1 ml de 10% de Tween 20 (vol / vol), y 19,9 ml de filtrado ddH 2 O. Filtro de esterilización. Lavar A: Mezclar 300 ml de 20X SSPE, 1 ml de Tween 10% (vol / vol), 699 ml ddH 2 O. Filtro de esterilización. Lave B: Mezcle 150 ml 20X SSPE, 1 ml de Tween 10% (vol / vol), 849 ml ddH 2 O. Filtro de esterilización. Cebadores de secuenciación de códigos de barras En primer secuencias UP-etiqueta de los 5 &#39;de cola (en negrita) son secuencias de Illumina adaptador específico incorporado en el primer F y R. La secuencia variable (cursiva) representa la etiqueta de indexación 5-mer utilizados en la multiplexación / índice de lectura. La cola de la 3 &#39;(subrayado) representa el primer comunes que flanquean el código de barras uptag y es necesario ampliar los códigos de barras de levadura. En ABAJO-tag imprimación secuencias 5 &#39;es idéntica a la cola 5&#39; de la cola de la UP-etiqueta de cebadores (secuencia específica de iluminación), sin embargo, el 3 &#39;de cola (subrayado) se sustituye con los primers comunes que se utilizan para amplificar la baja etiqueta de código de barras.

competitive genomic screens of barcoded yeast libraries

En virtud de los avances en las tecnologías de secuenciación de próxima generación, tenemos acceso a nuevas secuencias del genoma casi a diario. El ritmo de estos avances se está acelerando, prometiendo una mayor profundidad y amplitud. A la luz de estos avances extraordinarios, la necesidad de métodos rápidos, en paralelo a definir la función del gen se vuelve cada vez más importante. Las colecciones de mutantes de deleción en todo el genoma de las levaduras y E. coli han servido como bestias de carga para la caracterización funcional de la función del gen, pero este método no es escalable, actual deleción del gen enfoques requieren cada uno de los miles de genes que componen un genoma que se eliminan y verifican. Sólo después de este trabajo está completo podemos seguir de alto rendimiento fenotipificación. Durante la última década, nuestro laboratorio ha refinado con una cartera de la competencia, en miniatura, de alto rendimiento de todo el genoma ensayos que se pueden realizar en paralelo. Este paralelismo es posible gracias a la inclusión de &quot;etiquetas&quot; de ADN, o &quot;códigos de barras,&quot; en cada mutante, con el código de barras que sirve como indicador de la mutación y se puede medir la abundancia de código de barras que evaluará su aptitud mutante. En este estudio, se busca llenar el vacío entre la secuencia de ADN y con código de barras colecciones de mutantes. Para lograr esto, se introduce una interrupción transposón combinado-código de barras del enfoque que abre los ensayos paralelos de código de barras que recientemente secuenciado, pero mal caracterizado microbios. Para ilustrar este enfoque se presenta una nueva colección de Candida albicans interrupción de código de barras y describir cómo los microarrays basado en la próxima generación basada en la secuencia de plataformas se pueden utilizar para recoger 10.000 - 1.000.000 gen-gen y las drogas las interacciones entre genes en un solo experimento.

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Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

Hemos desarrollado completa e imparcial en todo el genoma para comprender las pantallas de genes de drogas y las interacciones genético-ambientales. Métodos para la detección de estas colecciones mutantes se presentan.

Pantallas competitiva Genómica de Bibliotecas de levadura con código de barras

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

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Research

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Biology

18.0K vistas.  University of Toronto. Hemos desarrollado completa e imparcial en todo el genoma para comprender las pantallas de genes de drogas y las interacciones genético-ambientales. Métodos para la detección de estas colecciones mutantes se presentan.