InDevR reconoce NIH / NIAID U01AI070276 y R43AI077112 para la financiación de este trabajo.

1. Muestra de amplificación mediante RT-PCR <ol><li> Extraer el ARN viral a partir de material clínico o una. Aislado viral con el virus de Qiagen MinElute Kit girar en conjunto con la plataforma automatizada QIAcube extracción de ácidos nucleicos Las extracciones se llevan a cabo en 200 muestras l con un volumen de elución final de 60 microlitros. Extractos de almacenar a -70 ° C o menos para su uso posterior. </li><li> En una plantilla libre de la zona, preparar la mezcla de RT-PCR maestro en el hielo, según el protocolo del fabricante. Para incorporar biotina durante la RT-PCR, utilice una mezcla de dNTP biotinilado en lugar de la mezcla de dNTP suministrado por el fabricante. El costo de utilizar una mezcla de dNTP biotina es menos de $ 1 USD / ensayo. Métodos alternativos de incorporación de biotina como la utilización de una cartilla con biotina también se puede utilizar. Añadir cartilla mezcla a una concentración final de 1,0 M para la gripe A, 1,0 M de la gripe B, y 0,14 M para el control interno. La gripe A primer conjunto amplifica el segmento del gen de la matriz (1032 producto nt) y el conjunto B de imprimación gripe amplifica un segmento de gen no estructural (811 producto nt). Cada conjunto de cebadores FluChip contiene una imprimación con un 5 &#39;grupo fosforilo para facilitar la generación de ADN de cadena sencilla a través de la digestión enzimática con exonucleasa lambda después de PCR. El producto resultante de cadena simple requiere mucho menos tiempo de hibridación que el equivalente de doble cadena y reduce significativamente el tiempo de ensayo general. Una mezcla previamente preparada de estas cartillas, así como el ARN de control interno de la plantilla están disponibles para los investigadores interesados ​​InDevR sobre una base limitada. </li><li> Agitar brevemente y distribución de 18 l de la mezcla maestra en tubos de pared delgada PCR. </li><li> La transferencia de los tubos en hielo a un área de trabajo adecuada para la adición de plantillas, la plantilla y añadir 2 l de cada tubo de reacción. </li><li> Transferencia de tubos PCR de un termociclador y ejecute el siguiente perfil térmico: la transcripción inversa a 50 ° C durante 30 minutos, la inactivación enzimática / activación a 95 ° C durante 15 min, 40 ciclos de PCR de 95 ° C durante 30 s, 55 ° C durante 30 años, y 72 ° C durante 1 minuto, y una extensión final a 72 ° C durante 10 min. </li></ol> 2. La hibridación de RT-PCR para microarrays de baja densidad <ol><li> Con el fin de generar una sola cadena de ADN para la hibridación FluChip, preparar la mezcla de digestión enzimática mediante la combinación de 1,0 l de enzimas exonucleasa lambda, 2,2 l de tampón de reacción que acompaña, y un 0,8 l de agua libre de nucleasa. Estas cantidades son para una sola muestra, pero puede ser simplemente reducido el número total de muestras para ser digeridos. Extraer muestras del termociclador y añadir 4 l de la mezcla preparada a cada reacción de digerir la cadena fosforilada del producto de PCR. Devolver las muestras para el termociclador y el programa del termociclador a 37 grados centígrados durante 15 minutos seguido de 95 grados centígrados durante 10 minutos para completar la digestión enzimática y los pasos de calor fragmentación. </li><li> Los microarrays de la gripe personalizados utilizados están impresos en láminas de vidrio aldehídos funcionalizados por Applied Microarrays Inc. (Tempe, AZ). 5&#39;-amino terminada la captura de secuencias se combinan con un buffer optimizado detectar e impresos a una concentración final de 20 mM (a excepción de la secuencia de control positivo que, además, tiene una modificación 3&#39;-biotina y se vio a una concentración final de 500 nM) . Un contacto no manchar el método utilizado, con un diámetro del punto óptimo de 300 micras y un centro de paso del centro de 700 micras. </li><li> Quitar microarrays de la caja de almacenamiento y aplicar un solo uso de pozos en todo el hibridación de microarrays mediante la eliminación de la lámina protectora y presionar firmemente alrededor del perímetro de bien. </li><li> Colocar los portaobjetos en un recipiente de lavado que contiene 110 ml de agua purificada para un 5 minutos antes de la hibridación de lavado utilizando un agitador orbital a 60-90 rpm. Seca la matriz tocando suavemente un limpiador de tejidos para el borde del pozo y permitiendo que el agua se evacua. </li><li> Combine 22 l de tampón de hibridación 2x ​​con cada uno de los productos fragmentados ssDNA, y una pipeta 40 ml de las soluciones de hibridación en los pozos de microarrays. </li><li> Permita que se desliza en la hibridación en cámara húmeda cerrada durante 60 minutos. </li><li> Eliminar las diapositivas de la cámara de humedad, una breve aclaración matrices con el tampón de lavado D en una botella de enjuague antes de colocar en el estante de diapositivas. Normalmente, el volumen de enjuague de tampón de lavado D es de 2 ml por cada matriz. Coloque la parrilla de diapositivas con diapositivas en un cubo de lavado que contiene 110 ml de tampón A. Wash bin Colocar en un agitador orbital a 60-90 rpm durante 1 minuto. </li><li> Quitar bastidor de diapositivas de tampón de lavado A, brevemente enjuague con el tampón de lavado D, rack de transferencia de diapositivas a un bin que contiene el tampón de lavado B, y agitar a 60-90 rpm durante 5 minutos. </li><li> Seque la matriz en cada diapositiva, y el lugar se desliza en la cámara de secado de humedad en la preparación de medidas ampliPHOX detección colorimétrica. </li></ol> 3. ampliPHOX: etiquetado de los productos híbridos y fichas de calibración con ampliTAG <ol><li> Combinar<html> 10 l de ampliTAG, 20 l de tampón ampliTAG 2x, y 10 l de agua purificada para cada matriz para ser procesado. Volúmenes de reactivos puede ser simplemente reducido el número total de muestras. Asegúrese de preparar la mezcla de etiquetado suficiente para dar cuenta de todas las matrices de la muestra y las matrices de calibración necesarias. El número de fichas de calibración necesarios depende de si está realizando una calibración completa (para un nuevo instrumento o nuevo lote de reactivos), o simplemente un instrumento de comprobación. Para una calibración completa, 3 fichas de calibración deben ser etiquetados, y de un cheque de reactivo, a un chip de calibración de un solo deben ser etiquetados. Tenga en cuenta que antes de que las matrices de calibración están etiquetados, deben pasar por la etapa de lavado, antes de la hibridación que se describió anteriormente para los arreglos de la influenza. </li><li> Transferencia de 40 l de mezcla de etiqueta para cada conjunto y permite el etiquetado reacción tenga lugar en una cámara húmeda cerrada durante 5 minutos. </li><li> Lavar inmediatamente matrices con el tampón de lavado D en una botella de enjuague antes de colocar los portaobjetos en una gradilla para portaobjetos. Transferencia de rack en bandeja que contiene 110 ml de tampón de lavado C y agitar a 60-90 rpm durante 5 minutos. </li><li> El uso de un bin segundo lavado con agua purificada, realizar tres caídas sucesivas de agua breve para eliminar los residuos de sal. Seca las matrices tocando suavemente un limpiador de tejidos para el borde de los pozos. </li><li> Los microarrays están debidamente etiquetados con ampliTAG, y el resto del procedimiento de detección ampliPHOX se puede realizar. Fotoactivación y las imágenes de las matrices de etiquetado debe ser completado dentro de 24 horas, y las matrices se pueden almacenar en una caja de la oscuridad hasta su uso. </li></ol> 4. ampliPHOX: calibración, amplificación de la señal, y la imagen <ol><li> A su vez ampliPHOX lector y asegúrese de software ampliVIEW está listo para la fotoactivación. </li><li> Determinar el tiempo de fotoactivación óptimo el uso de chips de calibración. Además de la breve introducción que sigue, este procedimiento también se describen en detalle en el Manual de Operación ampliPHOX. Las fichas de calibración contiene una serie de diluciones de una secuencia de control de biotina que se utilizan para optimizar la sensibilidad de la prueba, con el objetivo de maximizar el número de filas de la ficha de calibración que produce una señal positiva según lo determinado por el software. </li><li> Quitar ampliPHY de 4 ° C, permite a la temperatura ambiente, y agitar brevemente para mezclar. Pipeta de 3 l de ampliPHY potenciador en el vial ampliPHY, y agitar bien durante 10 segundos. </li><li> De manera uniforme la transferencia de 40 ml de solución ampliPHY en el microarray y que contiene el ampliTAG marcado amplia, asegurando que no hay burbujas. Cerrar el vial ampliPHY entre cada aplicación. Insertar la diapositiva de microarrays en la bahía de fotoactivación del lector ampliPHOX. </li><li> Para la matriz de la primera calibración, el uso del tiempo de fotoactivación por defecto en el &#39;Time&#39; caja en el panel izquierdo del software, y haga clic en el verde botón &quot;Inicio&quot; para iniciar la fotoactivación. Una vez terminado, quitar la matriz y enjuague con agua purificada para eliminar el exceso de ampliPHY. Clara la formación de polímeros en algunos de los puntos debe ser visible. </li><li> Permita que los puntos de polímero que se seque durante 2 minutos, luego distribuir dos gotas de ampliRED en la matriz y permiten tinción para continuar durante 2 minutos. </li><li> Luego, enjuague rápidamente microarrays con agua purificada y seca con un pañuelo limpie. </li><li> Introduzca los microarrays en la bahía de imágenes del lector ampliPHOX, y haga clic en el botón &quot;nueva imagen de captura&quot; en la pestaña de imágenes. Una vez fotografiado, ajustar la cosecha y guardar la imagen. </li><li> En la ficha de análisis, seleccione la máscara de chip de calibración y el botón &quot;Auto de colocación&quot; para iniciar el análisis. El software automáticamente se producirá un &quot;Resumen&quot; que muestra los resultados cuantificados. Basándose en estos resultados, el tiempo de fotoactivación tiene 10 segundos para que la matriz de calibración de segundo y se repite el procedimiento. </li><li> Una vez que el tiempo óptimo de fotoactivación se ha determinado, las matrices de la muestra puede ser procesada usando la amplificación de la señal misma imagen y el protocolo utilizado para la calibración de las matrices. </li><li> Una vez que la imagen es capturada por los paneles de la muestra, una máscara para su distribución amplia en particular, como el diseño conjunto de influenza descrito aquí puede ser created.The ampliVIEW software es capaz de realizar análisis automatizado de imágenes y generación de resultados de la gripe de subtipos para cada muestra. </li></ol> 5. Los resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2682/2682fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Esquema del método de detección ampliPHOX colorimétrico. (A) ADN diana biotinilado se hibrida con cada punto de la matriz, y (B) marcadas con ampliTAG. (C) ampliPHY solución se añade, y (D) expone a la luz para formar manchas visibles polímero. (E) Los puntos de polímero se forman posteriormente teñidas con un colorante no tóxico para mejorar el contraste. CONTENIDO &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2682/2682fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. (A) La influenza de baja densidad de diseño de microarrays. Secuencias de 1-7 y 10-13 de la gripe A de destino, y las secuencias de 8, 9 objetivo de la gripe B. (B) ampliPHOX y (C) imágenes de fluorescencia de una novela de la gripe H1N1 2009 (&quot;gripe porcina&quot;) que indiquen el mismo patrón de detección tanto por métodos. <img src="/files/ftp_upload/2682/2682fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. De izquierda a derecha las imágenes, el representante de ampliPHOX para la influenza A H3N2, H1N1 de origen humano, 2009 H1N1 (de origen porcino), y una muestra negativa. Todos los 3 subtipos muestran patrones visualmente distintos en la matriz. Observe en el negativo que sólo el control interno de MS2 se ve, lo que indica la amplificación de RT-PCR no se inhibió.

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MChip:+A+Single+Gene+Diagnostic+for+Influenza+A.">MChip: A Single Gene Diagnostic for Influenza A.</a> Influenza: Molecular Virology. , (2010).</li><li>Gall, A., Hoffman, B., Harder, T., Grund, C., Ehricht, R., Beer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+hemagglutinin+subtyping+and+pathotyping+of+avian+influenza+viruses+by+a+DNA+microarray.">Rapid hemagglutinin subtyping and pathotyping of avian influenza viruses by a DNA microarray.</a> J Virol Meth. 160, 200-205 (2009).</li><li>Townsend, M. B., Dawson, E. D., Mehlmann, M., Smagala, J. A., Dankbar, D. M., Moore, C. L., Smith, C. B., Cox, N. 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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+detection+using+polymerization-based+amplification.">Antigen detection using polymerization-based amplification.</a> Lab on a Chip. 9, 653-656 (2008).</li></ol>

Todos los autores son empleados de InDevR, Inc., una entidad sin fines de lucro. InDevR está comercializando la tecnología ampliPHOX aquí se describen.

La tecnología de detección de ampliPHOX colorimétrico que aquí se presenta es una alternativa rápida y económica para la detección de un solo color de fluorescencia para aplicaciones de baja densidad de microarrays. Se muestra esquemáticamente en la Figura 1, el principio de detección se basa en el uso de una etiqueta fotoiniciador (1B). En presencia de una solución de monómero que contiene (1C), exposición a la luz hace que el fotoiniciador (ampliTAG) para desencadenar una reacción de poli...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reactivo / equipo </th><th> Fabricante </th><th> Catálogo # </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> Qiagen Virus MinElute girar Kit </td><td> Qiagen </td><td> 57704 </td><td> única de 60 l de elución </td></tr><tr><td> QIAcube </td><td> Qiagen </td><td> 9001292 </td><td> opcional </td></tr><tr><td> ABI 9800 termociclador rápido </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4441166 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen OneStep RT-PCR kit </td><td> Qiagen </td><td> 210210 </td><td> Kit dNTPs no se utiliza </td></tr><tr><td> Buffer 2x Spotting </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-5007 </td><td></td></tr><tr><td> Biotinilado dNTP Mix </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-5009 </td><td></td></tr><tr><td> Lambda exonucleasa </td><td> Epicentro Biotecnologías </td><td> LE032K </td><td> 2500 U, 10U/μl </td></tr><tr><td> FluChip mezcla de cebadores </td><td> InDevR </td><td> N / A </td><td> todavía no está disponible para la venta </td></tr><tr><td> Agitador orbital </td><td> Madell Tecnología </td><td> ZD-9556-A </td><td></td></tr><tr><td> Lávese las Papeleras </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-4002 </td><td></td></tr><tr><td> Lave Bastidores </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-4003 </td><td></td></tr><tr><td> Tampón de hibridación 2x </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-5004 </td><td></td></tr><tr><td> Fichas de calibración </td><td> InDevR Inc. </td><td> AP-5006 </td><td></td></tr><tr><td> Lave Buffers AD </td><td> InDevR Inc. </td><td> MI-5005 </td><td></td></tr><tr><td> ampliRED </td><td> InDevR Inc. </td><td> AP-5004 </td><td></td></tr><tr><td> ampliTAG </td><td> InDevR Inc. </td><td> AP-5001 </td><td></td></tr><tr><td> 2x ampliTAG Buffer </td><td> InDevR Inc. </td><td> AP-5002 </td><td></td></tr><tr><td> ampliPHY, ampliPHY potenciador </td><td> InDevR Inc. </td><td> AP-5003 </td><td></td></tr></tbody></table>

ampliphox colorimetric detection on a dna microarray for influenza

Microarrays de ADN se han convertido en una poderosa herramienta para la detección de patógenos. 1.5 Por ejemplo, muchos ejemplos de la capacidad de escribir y subtipo de virus de la influenza se ha demostrado. 11.6 La identificación y subtipificación de la influenza en microarrays de ADN tiene aplicaciones tanto en público la salud y la clínica para la detección temprana, intervención rápida, y minimizar el impacto de una pandemia de influenza. Fluorescencia tradicionales es actualmente el método de detección de microarrays de uso más común. Sin embargo, como la tecnología de microarrays avanza hacia el uso clínico, una sustitución de instrumentos caros, con tecnología de bajo costo de detección que presentan características de rendimiento similares a la fluorescencia se hacen ensayos de microarrays más atractivo y rentable. La tecnología de detección colorimétrica ampliPHOX está diseñado para aplicaciones de investigación, y tiene un límite de detección dentro de un orden de magnitud de fluorescencia tradicionales 11, con una ventaja de ser un aproximado de diez veces menor coste en comparación con el instrumento de los escáneres de microarrays confocal de fluorescencia necesaria para microarrays detección. Otra ventaja es el tamaño compacto del instrumento que permite la portabilidad y flexibilidad, a diferencia de los instrumentos tradicionales de la fluorescencia. Debido a que la tecnología de polimerización no es tan intrínsecamente lineal, como la detección por fluorescencia, sin embargo, es el más adecuado para aplicaciones de baja densidad de microarrays en el que se desea una respuesta sí / no a la presencia de una cierta secuencia, por ejemplo, para matrices de detección de patógenos. En la actualidad la densidad de punto máximo compatible con la detección de ampliPHOX es de ~ 1800 puntos / matriz. Debido a las limitaciones de densidad lugar, una mayor densidad de microarrays no son adecuados para la detección de ampliPHOX. A continuación, presentamos la tecnología de detección colorimétrica ampliPHOX como un método de amplificación de la señal en un microarray de baja densidad para la detección y caracterización de los virus de la influenza (FluChip). Aunque este protocolo utiliza el FluChip (un microarray de ADN) como una aplicación específica de ampliPHOX detección, los microarrays de la incorporación de meta con biotina puede ser etiquetada y se detecta de manera similar. El diseño de microarrays y biotinilación de la meta de ser capturados son responsabilidad del usuario. Una vez que el objetivo de biotina ha sido capturado en la matriz, la detección ampliPHOX se puede realizar mediante el etiquetado de la primera serie con un conjugado de estreptavidina-etiqueta (ampliTAG). Tras la exposición de luz mediante el instrumento ampliPHOX Reader, la polimerización de una solución de monómero (ampliPHY) sólo se produce en las regiones que contienen ampliTAG marcado objetivos. El polímero formado puede ser posteriormente se tiñeron con una solución no tóxica para mejorar el contraste visual, seguido por imágenes y análisis con un paquete de software simple (ampliVIEW). El ensayo FluChip, desde la no-extraídos de la muestra de resultados se puede realizar en unas 6 horas, y las medidas de detección ampliPHOX descrito anteriormente se puede completar en unos 30 min.

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ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

ampliPHOX tecnología de detección colorimétrica se presenta como una alternativa económica a la detección por fluorescencia de microarrays. Sobre la base de fotopolimerización, ampliPHOX produce manchas de polímero sólido visible a simple vista en tan sólo unos minutos. Resultados son imágenes e interpretado de forma automática con un paquete de software simple pero poderosa.

ampliPHOX colorimétrico de detección de un microarray de ADN para la influenza

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

ampliphox-colorimetric-detection-on-a-dna-microarray-for-influenza

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K vistas.  InDevR Inc.. ampliPHOX tecnología de detección colorimétrica se presenta como una alternativa económica a la detección por fluorescencia de microarrays. Sobre la base de fotopolimerización, ampliPHOX produce manchas de polímero sólido visible a simple vista en tan sólo unos minutos. Resultados son imágenes e interpretado de forma automática con un paquete de software simple pero poderosa.

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Generación de recombinantes del virus de influenza a partir del ADN plásmido

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Investigación

Inmunología e Infección

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Combinación de adhesivo basado en cinta de muestreo y de fluorescencia In situ La hibridación para la detección rápida de Salmonella En los productos frescos

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Utilizando imágenes bioluminiscentes encargado de investigar la sinergia entre Streptococcus pneumoniae Y el Virus de la Influenza en ratones lactantes

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

El uso de un ensayo de microarrays Pan-viral (Virochip) a la pantalla de muestras clínicas de los patógenos virales

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

De alto rendimiento Método de detección de virus de la influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Nasal Toallitas para Influenza A Detección de Virus y aislamiento de los cerdos

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

Un ensayo de microarrays miniaturizada glicanos para la evaluación de avidez y especificidad del virus de la gripe A Hemaglutininas

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

In Vitro El desmontaje de virus de influenza A cápsides por centrifugación en gradiente

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality every year. The Influenza A and B assay was the first CLIA-waived molecular rapid flu test available. The Influenza A and B test works by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. Here, the performance of the Influenza A and B assay on frozen, archived nasopharyngeal swab (NPS) specimens stored in viral transport medium (VTM) were compared to a respiratory panel assay.
The performance of the Influenza A and B assay was evaluated by comparing the results to the respiratory panel reference method. The sensitivity for total influenza virus A was 67.5% (95% CI (CI), 56.6-78.5) and the specificity was 86.9% (CI, 71.0-100). For influenza virus B testing, the sensitivity and specificity were 90.2% (CI, 68.5-100) and 98.8% (CI, 68.5-100), respectively.
This system has the advantage of a significantly shorter test time than any other currently available molecular assay and the simple, pipette-free procedure runs on a fully integrated, closed, small-footprint system. Overall, the Influenza A and B assay evaluated in this study has the potential to serve as a point-of-care rapid influenza diagnostic test.

We describe a rapid, molecular-based Influenza A and B assay. The Influenza assay detects each target within 15 min by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. The Influenza A and B assay is user-friendly and required minimal hands-on time to perform.

Detección Molecular rápida y diferenciación de virus gripales A y B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

La neuraminidasa Ensayo de inhibición basado en la fluorescencia para evaluar la susceptibilidad de los virus de la influenza a El Inhibidor de la neuraminidasa clase de antivirales

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...