Este trabalho foi financiado por doações de ED da S. James McDonnell Fundação 21 de Century Award Program, eo Prêmio Diretor do NIH Innovator Novo. GAB foi apoiado em parte por uma bolsa de pós-doutorado do Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia.

1. Análise de controle de qualidade da amostra de RNA com 2100 Bioanalyzer Antes de começar, <ol><li> Desnaturar a escada e suas amostras a 70 ° C por 10 min. Frio imediatamente em gelo. </li><li> Limpe o instrumento com eletrodos RNaseZAP por 1 min, seguido por RNase água por 10 seg. Permitir que os eletrodos para secar ao ar. </li><li> Prepare a matriz de gel por pipetagem 550 mL da matriz de gel em um filtro de spin fornecido com o kit. Centrifugar a 1500 RCF por 10 min em temperatura ambiente. Alíquota do filtrado gel em 65 mL alíquotas e armazenar a 4 ° C por até 1 mês. </li><li> Para preparar a estação de priming chip, <ol class="lalpha"><li> Inserir uma seringa de 1 ml por meio do clipe e no adaptador luer lock. </li><li> Ajuste a placa de base para a posição C, soltando o parafuso sob a base, o levantamento da placa e reapertar o parafuso. </li><li> Ajustar o clip da seringa na posição superior. </li></ol></li><li> Equilibrar a concentração de corantes à temperatura ambiente. Vortex por 10 segundos. Adicionar 1 ml de tintura para uma alíquota de 65 mL de gel filtrada. Vortex bem e centrifugar a 13,000 rcf durante 10 min à temperatura ambiente. Use dentro de um dia. Quando estiver pronto para executar suas amostras, </li><li> Posição de um chip na estação de priming. Neste protocolo estamos usando RNA 6.000 fichas nano. Para carregar o gel, <ol class="lalpha"><li> Pipetar 9 mL da mistura de gel-dye na bem marcado com um branco &quot;G&quot; contra um fundo preto. Verifique se o seu ponta é posicionada na parte inferior do poço. </li><li> A posição do êmbolo da seringa de 1 ml. Perto da estação de priming. Certifique-se de um clique-locks. </li><li> Pressione o êmbolo lenta mas firmemente até que seja realizada pelo clipe. </li><li> Aguarde 30 segundos. Lançamento do clipe. </li><li> Deixe o êmbolo subir por si só. Depois que ele pára de se mover, espere alguns segundos e puxar o êmbolo de volta à posição de 1 ml. Abrir a estação de priming. </li></ol></li><li> Pipetar 9 mL da mistura de gel-dye em cada um dos dois poços marcados &quot;G&quot;. </li><li> Pipetar 5 mL do marcador em cada um dos 12 poços de amostra e na escada bem. </li><li> Pipetar 1 mL da escada em escada bem preparado. </li><li> Pipetar 1 mL de cada amostra nas cavidades da amostra. </li><li> Pipetar 1 mL do marcador em cada amostra não utilizada também. </li><li> Vortex do chip de 1 min a 2.400 rpm. </li><li> Para executar o chip, <ol class="lalpha"><li> Iniciar o Software Especialista 2100. </li><li> A posição do chip e feche a tampa. Se o instrumento está on-line, um ícone irá indicar se a tampa é aberta ou fechada e que tipo de chip é inserido. Verifique se a porta correta está selecionada. </li><li> Executar o ensaio dentro de 5 min de carga das amostras para evitar a evaporação. </li></ol></li></ol> 2. Amplificação e rotulagem Para se preparar para análise microarray, amostras de RNA são amplificados e rotulado, geralmente em uma reação com base em T7 RNA polimerase 3. CDNA dupla fita é gerado pela transcrição reversa. cDNA é usada em uma reação de transcrição in vitro para gerar o que é conhecido como cRNA. Esta reação é realizada na presença de ribonucleotídeos rotulados, produzindo quantidades micrograma de RNA marcado para a hibridização matriz. A escolha de amplificação / rotulagem métodos depende da plataforma de microarray subseqüente a ser utilizado. Nesta seção, descrevemos a geração de RNA fluorescente etiquetado utilizando kit da Agilent rotulagem rápida Amp. <ol><li> Pipeta ng 50-5 mg de RNA em um tubo de 1,5 ml. O volume não deve exceder 8,3 mL. Se necessário, concentrar a sua amostra de RNA por centrifugação a vácuo ou precipitação com álcool. </li><li> Adicionar 1,2 mL de primer T7. </li><li> Trazer para um volume final de 11,5 mL com RNase água. </li><li> Incubar a 65 ° C por 10 min para desnaturar o RNA. Recomendamos o uso de um termociclador com uma tampa quente para evitar a condensação no topo do tubo. </li><li> Durante a incubação de 10 min, Buffer Strand quente 5X Primeiro a 80 ° C por 5 min. Vortex e spin down. Mantenha em temperatura ambiente até que esteja pronto para uso. </li><li> Após a incubação de 10 min, esfriar rapidamente as amostras de RNA desnaturado no gelo. </li><li> Prepare a mistura mestre cDNA. Por reação, adicione o seguinte: <ol class="lalpha"><li> 4 mL de buffer Strand 5X First </li><li> 2 l 0,1 M DTT </li><li> 1 ml 10 mM dNTPs </li><li> Uma enzima MMLV-RT mL </li><li> 0,5 mL Out RNase. </li></ol></li><li> Misturar os componentes invertendo o tubo 4 vezes. Não vortex. Girar para coletar o conteúdo na parte inferior do tubo. </li><li> Adicionar 8,5 mL de master mix por amostra. Misture por pipetagem cima e para baixo. </li><li> Incubar por 2 horas a 40 ° C, seguido por 10 min a 65 ° C. Recomendamos o uso de um termociclador com uma tampa aquecida. </li><li> Transferir os tubos para o gelo por 5 min. </li><li> Prepare a mistura de mestre de transcrição. Por reação, adicione o seguinte: <ol class="lalpha"><li> 15,3 de água livre de nuclease mL </li><li> 20 lTampão de transcrição 4X </li><li> 6 mL 0,1 M DTT </li><li> 8 mL PNT </li><li> 6,4 mL de PEG 50% (PEG deve ser pré-aquecido a 40 ° C e agitadas para garantir a ressuspensão) </li><li> 0,5 mL de RNase Out </li><li> 0,6 mL pirofosfatase inorgânicos </li><li> 0,8 mL T7 RNA polimerase </li><li> 2,4 mL Cy3 ou Cy5 CTP </li></ol></li><li> Brevemente girar a amostras a recolher o conteúdo na parte inferior do tubo. </li><li> Adicionar 60 mL da mistura de Transcrição Mestre por amostra. </li><li> Incubar a 40 ° C por 2 horas. </li><li> Adicionar 20 mL de RNase água. </li><li> Purificar o cRNA rotulados para remover nucleotídeos sem personalidade jurídica. Recomendamos o uso de colunas RNeasy Qiagen mini. </li><li> Quantificar o cRNA rotulados. Recomendamos a utilização de um espectrofotômetro NanoDrop2000 em Microarray modo de medição. Certifique-se de selecionar RNA-40 como o tipo de amostra. </li><li> Concentração registro de exemplo, o rendimento (calculado como a concentração multiplicado pelo volume) e atividade específica (calculado como 1000 multiplicado pela ração de concentração de corante sobre a concentração cRNA). Para a hibridização microarray, é necessário para alcançar um rendimento de pelo menos 825 ng e uma atividade específica de pelo menos 8 pmol / mg. </li></ol> 3. Hibridização de microarranjos <ol><li> Ligue a estação de hibridação e regulado a 65 ° C, pelo menos, duas horas antes de hibridização começa. </li><li> Para preparar a amostra de hibridização, misture o seguinte em um tubo de 1,5 ml: <ol class="lalpha"><li> 825 ng Cy3-cRNA (isto é normalmente o &quot;tratado&quot; amostra) </li><li> 825 ng Cy5-cRNA (geralmente é a sua &quot;referência&quot; da amostra) </li><li> 11 mL 10X agente de bloqueio. </li><li> Adicionar RNase água para um volume final de 52,8 mL </li><li> Adicionar 2,2 mL de buffer fragmentação. </li></ol></li><li> Vortex em baixa velocidade para misturar. </li><li> Incubar a 60 ° C por exatamente 30 min. Este é o passo cRNA fragmentação, que gera fragmentos rotulados para a hibridização matriz. É muito importante para incubar exatamente como descrito. Recomendamos o uso de um termociclador com uma tampa aquecida. É muito importante para incubar exatamente como descrito para gerar sondas do comprimento médio correto. Fragmentação excessiva ou insuficiente resultará em falsos negativos ou falsos positivos. </li><li> Adicionar 55 mL de tampão de hibridação 2X de parar de fragmentação. Mix por pipetagem, tendo especial cuidado para não introduzir bolhas. </li><li> Centrifugar por 1 min em velocidade máxima para coletar o conteúdo na parte inferior do tubo. Se as bolhas são observadas, centrífuga mais tempo para removê-los. </li><li> Colocar o tubo no gelo, protegidas da luz. Carga da amostra sobre a matriz o mais rapidamente possível. </li><li> Para carregar a matriz, primeiro prepare a câmara de hibridização. Este protocolo descreve o uso de matrizes da Agilent 4x44K com o sistema de hibridação Roche-NimbleGen e câmaras misturador A4. <ol class="lalpha"><li> Coloque uma lâmina de microarray no lado de código de barras de montagem / desmontagem ferramenta, em primeiro lugar. </li><li> Abra um mixer A4 e expor o adesivo. Segurando a matriz e montagem / desmontagem ferramenta para evitar qualquer movimento, coloque o misturador A4 no slide, a partir da extremidade mais distante. Verifique se ele está corretamente alinhado à ferramenta. Vara do misturador ao longo de toda a lâmina matriz. </li><li> Puxe a partir do final do misturador para remover o slide / montagem mixer. </li><li> Usando a ferramenta de zurrar, pressione ao longo de toda a junta adesiva para ter certeza que está bem colado à theslide. Pequenas bolhas de ar presas entre o adesivo ea lâmina pode ser visto contra um fundo escuro. Tire um tempo extra para remover essas bolhas com a ferramenta de zurrar. Sua matriz está agora pronto para ser carregado. </li></ol></li><li> Use uma pipeta de deslocamento positivo para carregar 100 ml da amostra de hibridação. Empurre a ponta firmemente dentro do buraco da porta, então dispensar lenta e suavemente de modo que o ar não fica preso na área da matriz. Nunca tente sugar a amostra de volta. Uma vez que toda a amostra foi dispensado, manter a ponta no buraco da porta sem soltar o êmbolo. Quando a amostra cobre todo o conjunto e líquido começa a sair do porto de ventilação, remover rapidamente a pipeta. Apenas liberte o êmbolo uma vez a dica é longe do slide. </li><li> Dab delicadamente o líquido em excesso em ambas as portas. Certifique-se de não chamar a amostra para fora da câmara em si. </li><li> Cobrir os buracos da porta com etiquetas, usando uma pinça. </li><li> Coloque o slide na estação de hibridização, e verificar que os buracos da bexiga são corretamente posicionado sobre o O-rings. Isso irá garantir boa mistura durante a hibridação. </li><li> Feche a tampa deslizante ea tampa da estação. Conjunto da estação de mistura modo B. </li><li> Hibridizar a matriz a 65 ° C por 17 horas. </li><li> Prepare Wash Buffer 2 pela adição de Triton X-102 a uma concentração final de 0,005%. Mantenha a 37 ° C durante a noite. </li></ol> 4. Lavar Microarray <ol><li> Adicionar Triton X-102 a Wash Buffer 1 para uma concentração final de 0,005%. Mantê-la em sala de temperature. </li><li> Quando terminar de hibridação, encher um copo prato &quot;A&quot; com Wash Buffer 1. O prato deve ser grande o suficiente para manter a ferramenta de montagem / desmontagem e permitir que algumas manobras também. Todas as lavagens devem ser feitas em vidro. Evite pratos de plástico, uma vez que eles tendem a lixiviar compostos, resultando em alta de fundo na matriz. </li><li> Colocar um porta-lâminas e uma barra de agitação em um &quot;B&quot; coloração prato. Preencher com Tampão de lavagem 1, certificando-se que cobre o rack. Coloque em um prato agitar à temperatura ambiente. </li><li> Colocar uma barra de agitação em um prato coloração vazio &quot;C&quot; e coloque em um prato misture. </li><li> Remover a matriz e colocá-lo na ferramenta de montagem / desmontagem. Submergir o conjunto inteiro no prato &quot;A&quot;. </li><li> Enquanto segura a ferramenta de montagem / desmontagem eo slide de lados opostos com uma mão, com cuidado retire o misturador A4. Certifique-se de não arranhar a superfície da matriz. </li><li> Colocar rapidamente o slide no rack na coloração prato &quot;B&quot;. A partir de agora, a exposição ao ar deve ser minimizado desde o corante é sensível à Cy5 ozônio. Não lave mais de 8 matrizes de cada vez. </li><li> Lavar por 1 minuto mexendo na velocidade média. </li><li> Preencha coloração prato &quot;C&quot;, com pré-aquecido tampão de lavagem 2. Transferir as lâminas e lavar por 1 minuto. </li><li> Muito lentamente, remova a porta-lâminas de coloração prato &quot;C&quot; para minimizar gotículas deixadas para trás no slide. </li><li> Seca o slide, girando por 2 minutos. Se uma centrífuga compatível não estiver disponível, centrifugar o slide em um tubo de 50 ml cônico ou golpe gás argônio sobre ele. </li><li> Colocar as lâminas em um tubo cônico de 50 ml, e preenchê-lo com gás argônio. Digitalizar imediatamente para evitar perda de sinal. Recomendamos a utilização do scanner 4000B GenePix de dispositivos moleculares. </li></ol> 5. Resultados representativos: Boa qualidade total de amostras de RNA deve produzir apenas dois picos principais, quando executado em um Bioanalyzer para controle de qualidade, correspondente ao 2 principais espécies de RNA ribossômico. Alguma degradação RNA vai mostrar como uma mancha antes do pico RNA ribossomal primeiro. Severamente degradadas, RNA de baixa qualidade vai mostrar um pico amplo ou uma série de picos em tempos de retenção baixa, enquanto os dois picos ribossomal RNA será de intensidade muito baixa ou não identificáveis ​​em tudo. Para exemplos da saída Bioanalyzer 2100, veja a figura 1. O software 2100 de peritos irá calcular um número de integridade do RNA, ou RIN, como uma medida quantitativa da qualidade do RNA. Amostras de alta qualidade, com valores RIN superior a 9, são obviamente melhores para aplicações de microarray. No entanto, temos utilizado amostras com valores RIN tão baixo quanto 5,2 em geração de dados de microarray de qualidade razoável. Matrizes de boa qualidade deve produzir sinal de alta em valores relativamente baixos PMT. Em nosso experimento, a maior parte das transcrições devem estar presentes em níveis semelhantes na amostra experimental e de referência; maciça, amplas mudanças na expressão genética provavelmente não têm qualquer significado biológico. Por isso, a maioria do array deve olhar amarelo, em vez de verde ou vermelho. Sinais de boa qualidade também deve estar em uma faixa dinâmica de tal forma que os histogramas sinal completamente sobrepõem. Por exemplo, veja a figura 2. <img src="/files/ftp_upload/2546/2546fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Exemplo de quatro amostras de RNA isoladas de tecido do cérebro humano tumor. RNA foi isolado utilizando o protocolo apresentado em 3.1.1. Qualidade da amostra foi avaliada através do Bioanalyzer 2100 em um chip 6000 RNA como descrito em 3.1.3. As amostras são representativas de quatro qualidades distintas RNA: A, muito boa qualidade RNA (RIN&gt; 9); B, RNA parcialmente degradadas (RIN 5-6, observe o pico significativamente mais baixos para 28S rRNA); C, RNA altamente degradadas (RIN &lt; 3); D, quase completamente degradadas RNA (RIN = 2). Temos utilizado com sucesso amostras com qualidades semelhantes ou melhores do que B (RIN&gt; 5,2) para aplicações de microarray a jusante. Arrowheads sólida e aberta indicar a posição do 18S rRNA 28S e espécies, respectivamente. <img src="/files/ftp_upload/2546/2546fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Exemplos de imagens da matriz e gráficos de dispersão. A, visualização de slide todo, mostrando as quatro matrizes no formato Agilent 4X44K; B, varredura de alta resolução de uma das áreas de matriz, note que nenhum dos sinais (vermelho ou verde) é predominante; C, gráfico de dispersão da imagem em B, note que os sinais se sobrepõem totalmente e não mais de 1x10 -6 características são a intensidade de saturação.

<ol>
	<li>Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+Decade+Later:+What+has+Gene+Expression+Profiling+Told+us+About+Neuronal+Cell+Types,+Brain+Function+and+Disease.">One Decade Later: What has Gene Expression Profiling Told us About Neuronal Cell Types, Brain Function and Disease.</a> Curr Genomics. 10, 318-318 (2009).</li><li>Barisone, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Expression profiling in Neuroscience, edited by Ioannis Karamanos. , (2010).</li><li>Gelder, R. N. V. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA.">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 1663-1663 (1990).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Perfil de expressão com microarrays de DNA oferece uma abordagem simples para identificar genes diferencialmente expressos entre duas amostras biológicas. Experiências bem sucedidas de perfis de expressão exigir amostras de RNA de alta qualidade, etiquetagem robusta e hibridização. Em nossa experiência, as matrizes comerciais e kits de rotulagem Agilent fornecem dados de alta qualidade a um custo razoável. Enquanto Agilent também oferece sua própria hibridização e máquinas de varredura, nós somos a favor do sistema de hibridação de Roche-NimbleGen eo GenePix 4000B scanner microarray de dispositivos moleculares. Note que a unidade de hibridização Roche-NimbleGen era conhecido anteriormente como o sistema de hibridização MAUI. Após a recente aquisição empresarial pela Roche, o mixers A4 foram descontinuados. A partir do momento da redação deste texto, eles ainda podem ser encontrados através de outros vendedores, como Kreatech Diagnostics ( <a href="http://www.kreatech.com/">www.kreatech.com</a> ; este site também oferece uma ferramenta conveniente compatibilidade array), mas a longo prazo disponibilidade de estoque é incerto. Sistemas de hibridação estão disponíveis (por exemplo, de Agilent), no entanto, se mixers compatíveis podem ser encontradas para a matriz a ser utilizado, recomendamos o sistema Roche-NimbleGen para a sua qualidade e reprodutibilidade.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>2100 Bioanalyzer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>G2943CA</td>
<td>Includes chip priming station, vortexer, software and laptop computer</td>
</tr>
<tr>
<td>2100 Bioanalyzer electrophoresis set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>G2947CA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNA 6000 Nano kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>5067-1511</td>
<td>includes size ladder, marker, gel matrix, dye, electrode cleaners, spin filters and nanochips</td>
</tr>
<tr>
<td>RNase Zap</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems &#x2013; Ambion</td>
<td>AM9780M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Quick Amp labeling kit, two-color</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>5190-0444</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNeasy mini kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>74104</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gene Expression Hybridization Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>5188-542</td>
<td>Includes Blocking agent, Fragmentation buffer and Hybridization buffer</td>
</tr>
<tr>
<td>Gene Expression Wash Buffer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>5188-5327</td>
<td>Includes Wash Buffers 1 and 2 and Triton X-102</td>
</tr>
<tr>
<td>Hybridization Station</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Nimblegen</td>
<td>05223652001</td>
<td>4-slide model</td>
</tr>
<tr>
<td>Hybridization System Accesory Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Nimblegen</td>
<td>05327695001</td>
<td>Contains verification assembly for testing mixing, replacement O-rings, disassembly tool, forceps and brayer</td>
</tr>
<tr>
<td>A4 mixer hybridization chambers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Whole Human Genome (4x44) Oligo Microarray</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>G4112F</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Positive displacement pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gilson</td>
<td>F148504</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Capillary pistons for positive displacement pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gilson</td>
<td>F148415</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microarray dryer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nimblegen</td>
<td>05223636001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microarray fluorescent scanner, Axon GenePix 4000B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>GENEPIX4000B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GenePix Pro 6.0 software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

dna microarrays: sample quality control, array hybridization and scanning

Microarray perfil de expressão do sistema nervoso fornece uma abordagem poderosa para a identificação de atividades gene em diferentes estágios de desenvolvimento, diferentes estados fisiológicos ou patológicos, resposta à terapia, e, em geral, qualquer condição que está sendo testada experimentalmente 1. Perfil de expressão de tecidos neurais exige isolamento de RNA de alta qualidade, a amplificação do RNA isolado e hibridização de microarranjos de DNA. Neste artigo vamos descrever protocolos de experimentos de microarray reprodutíveis a partir do tecido de tumor cerebral 2. Vamos começar por realizar uma análise de controle de qualidade das amostras de RNA isolado com 2100 da Agilent Bioanalyzer &quot;lab-on-a-chip&quot; de tecnologia. Amostras de RNA de alta qualidade são essenciais para o sucesso de qualquer experimento de microarray, e os Bioanalyzer 2100 fornece uma medida rápida e quantitativa da qualidade da amostra. Amostras de RNA são amplificados e rotulado através da realização de transcrição reversa para a obtenção de cDNA, seguido por transcrição in vitro na presença de nucleotídeos marcados para produzir cRNA rotulados. Usando um kit rotulagem dual-cores, vamos rotular nossa amostra experimental com Cy3 e uma amostra de referência com Cy5. Ambas as amostras serão então combinadas e hibridizado com arrays 4x44 da Agilent K. Duas cores matrizes oferecem a vantagem de uma comparação direta entre duas amostras de RNA, aumentando a precisão das medições, em especial para pequenas mudanças nos níveis de expressão, porque as duas amostras de RNA são cruzados competitivamente a um microarray único. As matrizes serão verificados nos dois comprimentos de onda correspondentes, ea proporção de Cy3 para Cy5 sinal para cada recurso será usado como uma medida direta da abundância relativa do mRNA correspondente. Esta análise identifica genes que são diferencialmente expressos em resposta às condições experimentais sendo testados.

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DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Nós demonstramos o uso de microarrays de DNA para perfis de expressão do sistema nervoso. Descrevemos RNA controle de qualidade, rotulagem da amostra, e hibridização da matriz e de digitalização.

Microarrays de DNA: Controle de Qualidade da amostra, Hibridação Array e Digitalização

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

dna-microarrays-sample-quality-control-array-hybridization

Research

JoVE Journal

Biology

37.9K visualizações.  University of California, Davis. Nós demonstramos o uso de microarrays de DNA para perfis de expressão do sistema nervoso. Descrevemos RNA controle de qualidade, rotulagem da amostra, e hibridização da matriz e de digitalização.

Vídeo: DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Análise de Expressão Gênica Utilizando bacteriana Microarrays

Biologia

Technical Demonstration of Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1. Recent advances in this technology have enabled high resolution comparison of whole genomes for the identification of genetic alterations in cancer and other genetic diseases 2. The Sub-Megabase Resolution Tiling-set array (or SMRT) array is comprised of a set of approximately thirty thousand overlapping bacterial artificial chromosome (BAC) clones that span the human genome in ~100 kilobase pair (kb) segments 2. These BAC targets are individually synthesized and spotted in duplicate on a single glass slide 2-4. Array CGH is based on the principle of competitive hybridization. Sample and reference DNA are differentially labeled with Cyanine-3 and Cyanine-5 fluorescent dyes, and co-hybridized to the array. After an incubation period the unbound samples are washed from the slide and the array is imaged. A freely available custom software package called SeeGH (www.flintbox.ca) is used to process the large volume of data collected - a single experiment generates 53,892 data points. SeeGH visualizes the log2 signal intensity ratio between the 2 samples at each BAC target which is vertically aligned with chromosomal position 5,6. The SMRT array can detect alterations as small as 50 kb in size 7. The SMRT array can detect a variety of DNA rearrangement events including DNA gains, losses, amplifications and homozygous deletions. A unique advantage of the SMRT array is that one can use DNA isolated from formalin fixed paraffin embedded samples. When combined with the low input requirements of unamplified DNA (25-100ng) this allows profiling of precious samples such as those produced by microdissection 7,8. This is attributed to the large size of each BAC hybridization target that allows the binding of sufficient labeled samples to produce signals for detection. Another advantage of this platform is the tolerance of tissue heterogeneity, decreasing the need for tedious tissue microdissection 8. This video protocol is a step-by-step tutorial from labeling the input DNA through to signal acquisition for the whole genome tiling path SMRT array.

This video is a technical demonstration of the hybridization protocol for whole genome tiling path array CGH, which scans the entire human genome using only 25-100 ng of DNA that can be isolated from a variety of sources, including archival formalin fixed material.

Demonstração de técnicas Whole Genome hibridização genômica comparativa de matriz

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1.  Recent ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

A técnica de amostragem não invasiva cabelo obter DNA de alta qualidade a partir de Elusive Pequenos Mamíferos

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, distinct microenvironments can impose differentiation, migration, and proliferation phenotypes, and on the tissue level the microenvironment processes as complex as morphogenesis and tumorigenesis1. Not only do the cell and molecular contents of microenvironments impact the cells within, but so do the elasticity2 and geometry3 of the tissue. Defined as the sum total of cell-cell, -ECM, and -soluble factor interactions, in addition to physical characteristics, the microenvironment is complex. The phenotypes of cells within a tissue are partially due to their genomic content and partially due to the combinatorial interactions with the microenviroment. A major challenge is to link specific combinations of microenvironmental components with distinctive behaviours.
Here, we present the microenvironment microarray (MEArray) platform for cell-based functional screening of interactions with combinatorial microenvironments4. The method allows for simultaneous control of the molecular composition and the elastic modulus, and combines the use of widely available microarray and micropatterning technologies. MEArray screens require as few as 10,000 cells per array, which facilitates functional studies of rare cell types such as adult progenitor cells. A limitation of the technology is that entire tissue microenvironments cannot be completely recapitulated on MEArrays. However, comparison of responses in the same cell type to numerous related microenvironments, for instance pairwise combinations of ECM proteins that characterize a given tissue, will provide insights into how microenvironmental components elicit tissue-specific functional phenotypes.
MEArrays can be printed using a wide variety of recombinant growth factors, cytokines, and purified ECM proteins, and combinations thereof. The platform is limited only by the availability of specific reagents. MEArrays are amenable to time-lapsed analysis, but most often are used for end point analyses of cellular functions that are measureable with fluorescent probes. For instance, DNA synthesis, apoptosis, acquisition of differentiated states, or production of specific gene products are commonly measured. Briefly, the basic flow of an MEArray experiment is to prepare slides coated with printing substrata and to prepare the master plate of proteins that are to be printed. Then the arrays are printed with a microarray robot, cells are allowed to attach, grow in culture, and then are chemically fixed upon reaching the experimental endpoint. Fluorescent or colorimetric assays, imaged with traditional microscopes or microarray scanners, are used to reveal relevant molecular and cellular phenotypes (Figure 1).

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

A combinatorial functional screening method for gaining insights into the impacts of the molecular composition of microenvironments on cellular functions is described. The method takes advantage of existing microarray-based technologies to generate arrays of defined combinatorial microenvironments that support cell adhesion and functional analysis.

Fabricação e uso de microarranjos microambiente (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.

Matriz Hibridização Genômica Comparativa (Array CGH) para a detecção de Genomic copiar o número de variantes

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Método simples para DNA de Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação com Cromossomos Squashed

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state by transmission electron microscopy (TEM). This can be achieved with very low quantity of protein and in the buffer of choice, without the use of any stain, which is very useful to determine structure-function correlations of macromolecules. When combined with single-particle image processing, the technique has found widespread usefulness for 3D structural determination of purified macromolecules. 
The protocol presented here explains how to perform cryoEM and examines the causes of most commonly encountered problems for rational troubleshooting; following all these steps should lead to acquisition of high quality cryoEM images. The technique requires access to the electron microscope instrument and to a vitrification device. Knowledge of the 3D reconstruction concepts and software is also needed for computerized image processing. Importantly, high quality results depend on finding the right purification conditions leading to a uniform population of structurally intact macromolecules. 
The ability of cryoEM to visualize macromolecules combined with the versatility of single particle image processing has proven very successful for structural determination of large proteins and macromolecular machines in their near-native state, identification of their multiple components by 3D difference mapping, and creation of pseudo-atomic structures by docking of x-ray structures. The relentless development of cryoEM instrumentation and image processing techniques for the last 30 years has resulted in the possibility to generate de novo 3D reconstructions at atomic resolution level.

Do&#039;s and Don&#039;ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

Fazer e não fazer de Microscopia Cryo-elétron: uma cartilha sobre Preparação de Amostras e coleta de dados de alta qualidade para a Reconstrução Macromolecular 3D

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplificação, sequenciamento de próxima geração, e Genomic DNA Mapeamento das retrovirais Integração Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase synthesis using standard phosphoramidite chemistry. Oligonucleotides are post-synthetically labeled by two new photostable cyanine dyes using copper-catalyzed click-chemistry. The synthesis of both donor and acceptor dye is described and is performed in three consecutive steps. With the DNA as the surrounding architecture, these two dyes undergo an energy transfer when they are brought into close proximity by hybridization. Therefore, annealing of two single stranded DNA strands is visualized by a change of fluorescence color. This color change is characterized by fluorescence spectroscopy but can also be directly observed by using a handheld ultraviolet (UV) lamp. The concept of a dual fluorescence color readout makes these oligonucleotide probes excellent tools for molecular imaging especially when the described photostable dyes are used. Thereby, photobleaching of the imaging probes is prevented, and biological processes can be observed in real time for a longer time period.

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

Síntese de DNA sondas de hibridação de mudança de comprimento de onda usando fotoestável Cyanine Corantes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

Estudando a Proteína de Qualidade Sistema de Controle de<em&gt; D. discoideum</em&gt; Usando temperatura controlada Imagens ao vivo celular

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...