Bu çalışma, James S. McDonnell Vakfı, 21. Yüzyıl Ödülü Programı ED hibe ve bir NIH Müdürü Yenilikçisi Ödülü tarafından desteklenmiştir . GAB California Rejeneratif Tıp Enstitüsü doktora sonrası burs kısmen desteklenmiştir.

1. 2100 Bioanalyzer RNA örnek kalite kontrol analizleri Başlamadan önce, <ol><li> 10 dakika süreyle 70 ° C, merdiven ve örnekleri denatüre. Hemen buz üzerinde soğutun. </li><li> RNaseZAP RNaz içermeyen su ile 1 dakika 10 sn ile araç elektrotlar, temizleyiniz. Elektrotlar kurumaya izin verin. </li><li> Kiti ile sağlanan bir spin filtresinin içine jel matriks 550 ul pipeting jel matris hazırlayın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1.500 RCF santrifüjleyin. Kısım için 65, 4 ul alikotları ve mağaza ° C 1 aya kadar jel süzülür. </li><li> Çip emişli istasyonu hazırlamak için, <ol class="lalpha"><li> 1 ml şırınga klip ve luer kilit adaptörü içine yerleştirin. </li><li> Taban plakası, taban altında vida gevşeme, plaka kaldırma ve vida retightening C konumuna ayarlayın. </li><li> En üst konumda şırınga klibi ayarlayın. </li></ol></li><li> Oda sıcaklığına kadar boya konsantre dengelenmesi. 10 sn vorteksleyin. Süzülmüş jel 65 ul kısım boya 1 ul ekleyin. Vortex ve oda sıcaklığında 10 dakika 13.000 RCF santrifüj. Bir gün içinde kullanın. Numunelerinin çalışılabilmesi için hazır olduğunuzda, </li><li> Emişli istasyonunda bir çip yerleştirin. Bu protokolde, RNA 6000 nano yongaları kullanıyor. Jel yüklemek için, <ol class="lalpha"><li> Pipet 9 ul de siyah bir arka plana karşı beyaz bir &quot;G&quot; ile işaretlenmiş jel boya karışımı. Ucu çok iyi altındaki yerleştiğinden emin olun. </li><li> 1 ml şırınga pistonu yerleştirin. Emişli istasyonu kapatın. Tıklatın kilitleri emin olun. </li><li> Klip tarafından düzenlenen kadar yavaş fakat istikrarlı bir pistonu aşağı doğru bastırın. </li><li> 30 saniye bekleyin. Klibi bırakın. </li><li> Piston kendisi kadar gidelim. Hareket durduktan sonra, birkaç saniye bekleyin ve 1 ml konumuna pistonu geri çekin. Emişli istasyonu açın. </li></ol></li><li> &quot;G&quot; işaretli 2 kuyuların her jel boya karışımı Pipet 9 ul. </li><li> Pipet 5, 12 örnek kuyuların her ve iyi merdiveni marker ul. </li><li> Hazırlanan merdiven merdiven Pipet 1 ul. </li><li> Pipet 1 ul örnek kuyu içine her bir örnek. </li><li> Pipet 1 de her kullanılmayan örnek marker ul. </li><li> Vorteks 2,400 rpm&#39;de 1 dakika için çip. </li><li> Çalıştırmak için çip <ol class="lalpha"><li> 2100 Uzman Yazılım başlayın. </li><li> Çip yerleştirin ve kapağını kapatın. Cihaz on-line ise, bir simge, kapağı açık ya da kapalı ve ne tür çip takılı olmadığını gösterecektir. Doğru bağlantı noktasının seçili olduğundan emin olun. </li><li> 5 dakika içinde buharlaşmasını önlemek için numunelerin yükleme testinin çalıştırın. </li></ol></li></ol> 2. Amplifikasyonu ve etiketleme Mikroarray analizi için hazırlamak için, RNA örnekleri T7 RNA polimeraz 3 dayanan bir tepki, genellikle amplifiye ve etiketlenir. Çift ters transkripsiyon tarafından oluşturulan cDNA mahsur. in vitro transkripsiyon reaksiyonu bir cDNA Crna olarak bilinir oluşturmak için kullanılır. Bu reaksiyon dizisi hibridizasyon için etiketli RNA mikrogram miktarlarda üreten etiketli ribonucleotides varlığı yapılır. Amplifikasyon / etiketleme yöntemleri tercih kullanılacak sonraki mikroarray platformu bağlıdır. Bu bölümde, Agilent Hızlı Amp etiketleme kiti kullanılarak floresan etiketli RNA üretimi açıklar. <ol><li> Pipet 50 ng 1.5 ml tüp RNA 5 mg. Hacmi 8.3 ul geçmemelidir. Gerekirse, vakum santrifüj veya alkol ile yağış RNA örnek konsantre. </li><li> 1.2 T7 astar ul ekleyin. </li><li> 11.5 ul RNaz içermeyen su ile son hacim kazandırın. </li><li> RNA denatüre 65 ° C&#39;de 10 dakika süreyle inkübe edin. Biz tüp üst yoğuşmayı önlemek için sıcak bir kapak ile bir termalcycler kullanmanızı öneririz. </li><li> 10 dakika inkübasyon sıcak, 5X İlk Strand Tampon sırasında 80 ° C 5 dk. Vortex ve aşağı doğru döndürün. Kullanıma hazır olana kadar oda sıcaklığında tutun. </li><li> 10 dakika inkübasyondan sonra, hızlı bir şekilde buz üzerinde denatüre RNA örnekleri soğumasını. </li><li> CDNA ana karışımı hazırlayın. Reaksiyon başına, aşağıdakileri ekleyin: <ol class="lalpha"><li> 4 ul 5X İlk Strand Tampon </li><li> 2 ul 0.1 M DTT </li><li> 1 ul 10 mM dNTP </li><li> 1 ul MMLV-RT enzimi </li><li> 0.5 ul RNaz Out. </li></ol></li><li> Bileşenlerin tersine tüp 4 kez karıştırın. Girdap değil. Tüpün dibinde içeriğini toplamak için aşağı spin. </li><li> Örnek başına 8.5 ul ana karışımı ekleyin. Yukarı ve aşağı pipeting karıştırın. </li><li> 2 saat boyunca inkübe 40 ° C, 10 dakika 65 ° C Isıtılmış bir kapak ile bir termalcycler kullanmanızı öneririz. </li><li> Tüpler 5 dakika buz aktarın. </li><li> Transkripsiyon ana karışımı hazırlayın. Reaksiyon başına, aşağıdakileri ekleyin: <ol class="lalpha"><li> 15.3 ul nükleaz ücretsiz su </li><li> 20 ul4X transkripsiyon tamponu </li><li> 6 ul 0.1 M DTT </li><li> 8 ul UTP&#39;larının </li><li> 6.4 ul% 50 PEG (PEG 40 ° C prewarmed ve tabanda sağlamak için vortekslenmiş olmalıdır) </li><li> 0.5 ul RNaz Out </li><li> 0.6 ul inorganik pyrophosphatase </li><li> 0.8 ul T7 RNA polimeraz </li><li> 2.4 ul Cy3 veya Cy5 CTP </li></ol></li><li> Kısaca örnekler tüpün dibinde içeriğini toplamak için dönerler. </li><li> Transkripsiyon Master Mix örnek başına 60 ul ekleyin. </li><li> 2 saat 40 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 20 ul RNaz ücretsiz su ekleyin. </li><li> Tüzel kişiliği olmayan nükleotidlerin kaldırmak için etiketli Crna arındırın. Biz Qiagen Kullanıcı RNeasy Mini sütunları kullanmanızı öneririz. </li><li> Sayısal olarak etiketlenir Crna. Biz Mikroarray Ölçüm modunda bir NanoDrop2000 spektrofotometre kullanmanızı öneririz. Örnek türü olarak RNA-40 seçin emin olun. </li><li> Kayıt örnek konsantrasyonu, verim (ses ile çarpılır konsantrasyon olarak hesaplanmıştır) ve spesifik aktivite (Crna konsantrasyonu üzerindeki boya konsantrasyonu rasyon ile çarpılarak 1000 olarak hesaplanmıştır). Mikroarray hibridizasyon için, en az 825 ng ve en az 8 pmol / mg belirli bir faaliyet bir verim elde etmek için gereklidir. </li></ol> 3. Mikroarray hibridizasyon <ol><li> Hibridizasyon istasyonu ve set açın 65 ° C&#39;de en az 2 saat önce hibridizasyon başlar. </li><li> Hibridizasyon örneği hazırlamak için, 1.5 ml tüp aşağıdaki karışımı: <ol class="lalpha"><li> 825 ng Cy3 Crna (bu genellikle &quot;tedavi&quot; örnek) </li><li> 825 ng Cy5 Crna (bu genellikle &quot;referans&quot; örnek) </li><li> 11 ul 10X Engelleme ajan. </li><li> Son bir hacim 52.8 ul RNaz ücretsiz su ekleyin </li><li> 2.2 ul parçalanma tampon ekleyin. </li></ol></li><li> Karıştırmak için düşük hızda karıştırın. </li><li> 60 ° C&#39;de tam 30 dakika boyunca inkübe. Bu dizi hibridizasyon etiketli parçaları oluşturur Crna parçalanma adımdır. Tam olarak tarif inkübe için çok önemlidir. Biz ısıtmalı bir kapak ile bir termalcycler kullanmanızı öneririz. Bu tam olarak doğru ortalama uzunluğu probları oluşturmak için açıklanan inkübe için çok önemlidir. Aşırı veya yetersiz parçalanma, yanlış negatif veya yanlış pozitif sonuçlanacaktır. </li><li> Parçalanma durdurmak için 55 ul 2X Hibridizasyon tamponu ekleyin. Pipetleme kabarcıkları tanıtmak için özel bir özen karıştırın. </li><li> Tüpün dibinde içerik toplamak için maksimum hızda 1 dakika boyunca santrifüjleyin. Kabarcıkları gözlenmesi halinde, bunları kaldırmak için uzun santrifüjlenir. </li><li> Tüp, ışıktan korumalı buz koyun. Mümkün olduğunca çabuk dizi örnek yükleyin. </li><li> Dizi yüklemek için, ilk melezleme odası hazırlamak. Bu protokol ile Agilent 4x44K dizileri Roche-NimbleGen melezleme sistemi ve A4 mikser odaları kullanımı anlatılmaktadır. <ol class="lalpha"><li> Ilk montaj / sökme aracı, barkod tarafında bir mikroarray slayt yerleştirin. </li><li> Bir A4 mikseri açın ve yapıştırıcı maruz. Dizi ve herhangi bir hareketi önlemek için montaj / sökme aracı Holding ucunda başlayarak, slayt A4 mikseri. Bu aracı doğru hizalandığından emin olun. Mikser, tüm dizi slayt boyunca sopa. </li><li> Slayt / karıştırıcı montaj kaldırmak için mikser ucundan çekin. </li><li> Anırma aracını kullanarak, sıkı theslide yapıştırılmış emin olmak için yapışkanlı conta boyunca tüm basın. Yapıştırıcı ve slayt arasında sıkışıp kalmış küçük hava kabarcıkları karanlık bir arka plana karşı görülebilir. Anırma aracı ile bu kabarcıklarını çıkarmak için fazladan zaman ayırın. Dizi şimdi yüklenecek hazırdır. </li></ol></li><li> Hibridizasyon örnek 100 ul yüklemek için pozitif deplasmanlı pipet kullanın. Ucu liman deliğin içinde sıkıca bastırın; sonra hava dizi alanda sıkışıp olmadığını, yavaş ve yumuşak bir şekilde dağıtmak. Geri örnek emmek için deneyin. Tüm örnek reçete edildikten sonra, piston bırakmadan liman delik ucundan tutun. Örnek Dizinin tamamını kaplar ve sıvı havalandırma portu çıkmaya başlar, hızlı bir pipet çıkarın. Sadece piston ucu slayttan sonra bırakın. </li><li> Iki limanlarında yavaşça dab aşırı sıvı. Odanın kendisi örnek çizmezseniz emin olun. </li><li> Cımbız kullanarak etiketleri ile port delikleri örtün. </li><li> Hibridizasyon istasyonu slayt koyun ve mesane delikleri O-ring içinde doğru konumda olduğunu kontrol edin. Bu hibridizasyon sırasında karıştırma uygun sağlayacaktır. </li><li> Slayt kapağı ve istasyon kapağı kapatın. Karıştırma modu B. istasyonu ayarlayın </li><li> 65 ° C&#39;de 17 saat süreyle dizi melezleşme. </li><li> Triton X-102% 0.005 &#39;i son bir konsantrasyonu ekleyerek hazırlayın Tampon 2 yıkayın. ° C gecede 37 tutun. </li></ol> 4. Mikroarray yıkama <ol><li> Tampon 1,% 0.005 &#39;i son bir konsantrasyon Wash Triton X-102 ekleyin. Oda sıcaklığı az tutun.e. </li><li> Hibridizasyon bittiğinde, Yıkama Tampon 1 ile cam tabak &quot;A&quot; doldurun. Çanak montaj / sökme aracı tutun ve bazı manevra de izin vermek için yeterince büyük olmalıdır. Tüm yıkar züccaciye yapılmalıdır. Dizi yüksek bir arka plan ile sonuçlanan leach bileşikler etme eğilimi, plastik tabaklar kaçının. </li><li> &quot;B&quot; bir leke tabağına bir slayt rafı ve bir heyecan bar koyun. Raf kapsar emin olun, Yıkama tampon 1 ile doldurun. , Oda sıcaklığında bir heyecan plaka üzerine yerleştirin. </li><li> Bir heyecan bir heyecan plaka üzerinde boş bir leke tabağına &quot;C&quot; ve yer bar koyun. </li><li> Dizi çıkarın ve montaj / sökme aracı koyun. &quot;A&quot; çanak Batmak tüm montaj. </li><li> A4 karıştırıcı dikkatlice soyulabilir, bir yandan ters taraftan montaj / sökme aracı ve slayt tutarken. Dizi alanda çizmez emin olun. </li><li> Tabak boyama &quot;B&quot; rafa slayt hızla yerleştirin. Şu andan itibaren Cy5 boya ozona duyarlı olduğundan, havaya maruz kalma minimize edilmelidir. Bir seferde 8 dizileri fazla yıkamayın. </li><li> Orta hızda 1 dakika karıştırarak yıkayınız. </li><li> Önceden ısıtılmış Yıkama tampon 2 ile &quot;C&quot; çanak boyama doldurun. Slaytları transferi ve 1 dakika boyunca yıkayın. </li><li> Çok yavaş, slayt bıraktığı damlacıklar en aza indirmek için çanak &quot;C&quot; boyama slayt rafa kaldırın. </li><li> 2 dakika boyunca iplik slayt kurulayın. Uyumlu bir santrifüj mevcut değilse, slayt santrifüj ya da 50 ml konik tüp içinde argon gazı darbe. </li><li> 50 ml konik tüp slaytlar ve argon gazı ile doldurun. Sinyal kaybını önlemek için hemen tarayın. Moleküler Cihazlar GenePix 4000B tarayıcı kullanmanızı tavsiye ederiz. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: İyi kalite toplam RNA örnekleri 2 büyük ribozomal RNA türlerinin karşılık, kalite kontrol için Bioanalyzer çalıştırdığınızda sadece iki ana zirve üretmek gerekir. Bazı RNA bozulması, ilk ribozomal RNA zirve öncesinde bir karalama olarak gösterecektir. Ağır bozulmuş 2 ribozomal RNA zirveleri çok düşük yoğunluklu ya da tanımlanabilir olacak iken, düşük kaliteli RNA, geniş bir tepe ya da düşük tutma zaman zirveleri bir dizi gösterecektir. 2100 Bioanalyzer çıkış örnekler için, bakınız şekil 1. Uzman 2100 yazılımı, RNA kalite kantitatif bir ölçüm olarak, bir RNA Bütünlük sayısı, ya da RIN hesaplar. 9 daha yüksek RIN değerleri ile yüksek kaliteli ses örnekleri, mikroarray uygulamalar için en iyi tabii ki. Ancak, makul kalite mikroarray veri üreten 5.2 gibi düşük RIN değerleri örnekleri kullanmıştır. İyi kaliteli diziler, nispeten düşük PMT değerleri yüksek sinyal üretmek gerekir. Yaptığımız denemelerde, transkript çoğu deneysel ve referans örnek benzer seviyelerde mevcut olması bekleniyor; gen ekspresyonu kitlesel, yaygın değişiklikler muhtemelen herhangi bir biyolojik önemi yoksun olacak. Bu nedenle, dizi, yeşil ya da kırmızı yerine daha sarı görünmelidir. İyi kalite sinyalleri de sinyal histogramlar tam örtüşme böyle bir dinamik aralık olmalıdır. Örnekler için, bakınız şekil 2. <img src="/files/ftp_upload/2546/2546fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 insan beyninde tümör dokusundan izole edilen dört RNA örnekleri örneği . RNA 3.1.1 sunulan protokolü kullanılarak izole edilmiştir. Örnek kalite 3.1.3 &#39;te açıklandığı gibi bir RNA 6000 çipi, 2100 Bioanalyzer kullanılarak ölçüldü. Örnekleri 4 farklı RNA nitelikleri temsil etmektedir: A, çok iyi bir RNA kalitesi (RIN&gt; 9), B, kısmen bozulmuş RNA (RIN 5-6, 28S rRNA için önemli ölçüde daha düşük tepe dikkat edin); C, son derece bozulmuş RNA (RIN &lt; 3); D, neredeyse tamamen bozulmuş RNA (RIN = 2). Biz downstream mikroarray uygulamaları için benzer ya da B (RIN&gt; 5.2) daha iyi niteliklere sahip örnekleri başarıyla kullanılmaktadır. Katı ve açık ok uçları, 18S ve 28S rRNA türler sırasıyla konumu, göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/2546/2546fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 dizisi görüntüleri ve dağılım araziler örnekleri. 4X44K Agilent formatında dört dizileri gösteren, tüm slayt önizleme, B, dizi alanlarından biri olan yüksek çözünürlüklü tarama, sinyallerin ne (kırmızı veya yeşil) baskın olduğuna dikkat, C, görüntü scatter plot B sinyalleri tamamen örtüşen ve artık daha 1x10 -6 özellikleri doyurarak yoğunlukta olduğunu unutmayın.

<ol>
	<li>Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+Decade+Later:+What+has+Gene+Expression+Profiling+Told+us+About+Neuronal+Cell+Types,+Brain+Function+and+Disease.">One Decade Later: What has Gene Expression Profiling Told us About Neuronal Cell Types, Brain Function and Disease.</a> Curr Genomics. 10, 318-318 (2009).</li><li>Barisone, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Expression profiling in Neuroscience, edited by Ioannis Karamanos. , (2010).</li><li>Gelder, R. N. V. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA.">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 1663-1663 (1990).</li></ol>

DNA mikrodizilerinin İfade profil iki biyolojik örnekler arasında farklı genlerin tanımlamak için basit bir yaklaşım sağlar. Başarılı ifade profil deneyleri, yüksek kalite RNA örnekleri, sağlam bir etiket ve hibridizasyon gerektirir. Agilent ticari diziler ve etiketleme kitleri Deneyimlerimize göre, makul bir maliyetle yüksek kaliteli veri sağlar. Agilent de kendi hibridizasyon ve tarama makineleri sunarken, biz Roche-NimbleGen ve Moleküler Cihazlar GenePix 4000B mikroarray tarayıcı melezleme sistemi lehine. Roche-NimbleGen hibridizasyon ünitesi eski Maui melezleme sistemi olarak bilinen olduğunu unutmayın. Roche&#39;un yeni şirket satın alınmasından sonra, A4 karıştırıcılar üretilmiyor edilmiştir. Bu yazının yazıldığı an itibariyle hala Kreatech Diagnostics (diğer satıcılar aracılığıyla olabilir <a href="http://www.kreatech.com/">www.kreatech.com</a> , bu web sitesi de uygun bir dizi uyumluluk aracı sunuyor), ancak uzun vadeli stok durumu belirsiz. Diğer hibridizasyon sistemleri (örneğin, Agilent) mevcuttur; Ancak, dizi olduğu için uyumlu karıştırıcı olabilir, biz kalite ve tekrarlanabilirlik için Roche-NimbleGen sistem öneriyoruz.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>2100 Bioanalyzer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>G2943CA</td>
<td>Includes chip priming station, vortexer, software and laptop computer</td>
</tr>
<tr>
<td>2100 Bioanalyzer electrophoresis set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>G2947CA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNA 6000 Nano kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>5067-1511</td>
<td>includes size ladder, marker, gel matrix, dye, electrode cleaners, spin filters and nanochips</td>
</tr>
<tr>
<td>RNase Zap</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems &#x2013; Ambion</td>
<td>AM9780M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Quick Amp labeling kit, two-color</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>5190-0444</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNeasy mini kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>74104</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gene Expression Hybridization Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>5188-542</td>
<td>Includes Blocking agent, Fragmentation buffer and Hybridization buffer</td>
</tr>
<tr>
<td>Gene Expression Wash Buffer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>5188-5327</td>
<td>Includes Wash Buffers 1 and 2 and Triton X-102</td>
</tr>
<tr>
<td>Hybridization Station</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Nimblegen</td>
<td>05223652001</td>
<td>4-slide model</td>
</tr>
<tr>
<td>Hybridization System Accesory Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Nimblegen</td>
<td>05327695001</td>
<td>Contains verification assembly for testing mixing, replacement O-rings, disassembly tool, forceps and brayer</td>
</tr>
<tr>
<td>A4 mixer hybridization chambers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Whole Human Genome (4x44) Oligo Microarray</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>G4112F</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Positive displacement pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gilson</td>
<td>F148504</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Capillary pistons for positive displacement pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gilson</td>
<td>F148415</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microarray dryer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nimblegen</td>
<td>05223636001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microarray fluorescent scanner, Axon GenePix 4000B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>GENEPIX4000B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GenePix Pro 6.0 software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

dna microarrays: sample quality control, array hybridization and scanning

Sinir sistemi Mikroarray ifade profil, genel olarak, deneysel olarak test edilmektedir 1 herhangi bir durum farklı gelişim aşamalarında, farklı fizyolojik veya patolojik durumlar, tedaviye yanıt, gen faaliyetlerinin belirlenmesi ve güçlü bir yaklaşım sağlar. Sinir dokularının İfade profil izolasyonu yüksek kalitede RNA, izole edilmiş DNA, RNA ve DNA mikrodizilerinin hibridizasyon amplifikasyonu gerektirir. Bu yazıda, beyin tümörü doku 2, tekrarlanabilir mikroarray deneyler için protokolleri açıklar . Biz hücresi 2100 Bioanalyzer &quot;lab-on-a-chip&quot; teknolojisi ile izole RNA örneklerinde bir kalite kontrol analizleri yaparak başlayacak. Yüksek kaliteli RNA örnekleri herhangi bir mikroarray deneyinin başarısı için kritik öneme sahiptir ve 2100 Bioanalyzer örnek kalitesini hızlı bir şekilde, kantitatif bir ölçüm sağlar. RNA örnekleri sonra amplifiye ve cDNA elde etmek için ters transkripsiyon gerçekleştirerek etiketli etiketli Crna üretmek için etiketli nükleotidlerin varlığı in vitro transkripsiyon izledi. Çift renkli etiketleme kiti kullanılarak, biz Cy3 ve Cy5 ile referans örnek ile deneysel numune etiketi. Her iki örnek daha sonra birleştirilir ve Agilent 4x44 K dizileri için melezleşmiştir olacaktır. Çift renkli diziler, böylece iki RNA örnekleri tek bir mikroarray rekabetçi melezleşmiştir çünkü ifade seviyelerinde küçük değişiklikler için, özellikle de ölçümlerin doğruluğu arttırarak, iki RNA örnekleri arasında doğrudan bir karşılaştırma avantajı sunuyoruz. Diziler ilgili iki dalga boylarında taranmış olacak ve her özellik için Cy3 Cy5 sinyal oranı göreceli bolluk ilgili mRNA doğrudan bir ölçü olarak kullanılır. Bu analiz, farklı test edilen deneysel koşullara yanıt olarak ifade edilir genler belirler.

Watch this Scientific Journal Video about DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning at JoVE.com

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Biz sinir sistemi ifade profil için DNA mikrodizilerinin kullanımını göstermektedir. Biz, RNA kalite kontrol, örnek etiketleme ve dizi hibridizasyon ve tarama açıklar.

DNA Mikroarray&#39;ler: Örnek Kalite Kontrol, Dizi Hibridizasyon ve Tarama

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

dna-microarrays-sample-quality-control-array-hybridization

Research

JoVE Journal

Biology

37.9K Görüntüleme.  University of California, Davis. Biz sinir sistemi ifade profil için DNA mikrodizilerinin kullanımını göstermektedir. Biz, RNA kalite kontrol, örnek etiketleme ve dizi hibridizasyon ve tarama açıklar.

Video: DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Bakteriyel Gen İfadesi Analizi Mikroarray&#39;ler Kullanımı

Biyoloji

Technical Demonstration of Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1. Recent advances in this technology have enabled high resolution comparison of whole genomes for the identification of genetic alterations in cancer and other genetic diseases 2. The Sub-Megabase Resolution Tiling-set array (or SMRT) array is comprised of a set of approximately thirty thousand overlapping bacterial artificial chromosome (BAC) clones that span the human genome in ~100 kilobase pair (kb) segments 2. These BAC targets are individually synthesized and spotted in duplicate on a single glass slide 2-4. Array CGH is based on the principle of competitive hybridization. Sample and reference DNA are differentially labeled with Cyanine-3 and Cyanine-5 fluorescent dyes, and co-hybridized to the array. After an incubation period the unbound samples are washed from the slide and the array is imaged. A freely available custom software package called SeeGH (www.flintbox.ca) is used to process the large volume of data collected - a single experiment generates 53,892 data points. SeeGH visualizes the log2 signal intensity ratio between the 2 samples at each BAC target which is vertically aligned with chromosomal position 5,6. The SMRT array can detect alterations as small as 50 kb in size 7. The SMRT array can detect a variety of DNA rearrangement events including DNA gains, losses, amplifications and homozygous deletions. A unique advantage of the SMRT array is that one can use DNA isolated from formalin fixed paraffin embedded samples. When combined with the low input requirements of unamplified DNA (25-100ng) this allows profiling of precious samples such as those produced by microdissection 7,8. This is attributed to the large size of each BAC hybridization target that allows the binding of sufficient labeled samples to produce signals for detection. Another advantage of this platform is the tolerance of tissue heterogeneity, decreasing the need for tedious tissue microdissection 8. This video protocol is a step-by-step tutorial from labeling the input DNA through to signal acquisition for the whole genome tiling path SMRT array.

This video is a technical demonstration of the hybridization protocol for whole genome tiling path array CGH, which scans the entire human genome using only 25-100 ng of DNA that can be isolated from a variety of sources, including archival formalin fixed material.

Tüm Genom Dizisi Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon Teknik gösteri

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1.  Recent ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

Elusive Küçük Memeliler Yüksek Kalite DNA Edinme Noninvaziv Saç Örnekleme Tekniği

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, distinct microenvironments can impose differentiation, migration, and proliferation phenotypes, and on the tissue level the microenvironment processes as complex as morphogenesis and tumorigenesis1. Not only do the cell and molecular contents of microenvironments impact the cells within, but so do the elasticity2 and geometry3 of the tissue. Defined as the sum total of cell-cell, -ECM, and -soluble factor interactions, in addition to physical characteristics, the microenvironment is complex. The phenotypes of cells within a tissue are partially due to their genomic content and partially due to the combinatorial interactions with the microenviroment. A major challenge is to link specific combinations of microenvironmental components with distinctive behaviours.
Here, we present the microenvironment microarray (MEArray) platform for cell-based functional screening of interactions with combinatorial microenvironments4. The method allows for simultaneous control of the molecular composition and the elastic modulus, and combines the use of widely available microarray and micropatterning technologies. MEArray screens require as few as 10,000 cells per array, which facilitates functional studies of rare cell types such as adult progenitor cells. A limitation of the technology is that entire tissue microenvironments cannot be completely recapitulated on MEArrays. However, comparison of responses in the same cell type to numerous related microenvironments, for instance pairwise combinations of ECM proteins that characterize a given tissue, will provide insights into how microenvironmental components elicit tissue-specific functional phenotypes.
MEArrays can be printed using a wide variety of recombinant growth factors, cytokines, and purified ECM proteins, and combinations thereof. The platform is limited only by the availability of specific reagents. MEArrays are amenable to time-lapsed analysis, but most often are used for end point analyses of cellular functions that are measureable with fluorescent probes. For instance, DNA synthesis, apoptosis, acquisition of differentiated states, or production of specific gene products are commonly measured. Briefly, the basic flow of an MEArray experiment is to prepare slides coated with printing substrata and to prepare the master plate of proteins that are to be printed. Then the arrays are printed with a microarray robot, cells are allowed to attach, grow in culture, and then are chemically fixed upon reaching the experimental endpoint. Fluorescent or colorimetric assays, imaged with traditional microscopes or microarray scanners, are used to reveal relevant molecular and cellular phenotypes (Figure 1).

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

A combinatorial functional screening method for gaining insights into the impacts of the molecular composition of microenvironments on cellular functions is described. The method takes advantage of existing microarray-based technologies to generate arrays of defined combinatorial microenvironments that support cell adhesion and functional analysis.

Fabrikasyon ve mikroçevresindeki microarrays Kullanımı (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.

Genomik Kopya Sayısı Variantların Algılama için dizi Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon (CGH Array)

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Floresan DNA için Basit Bir Yöntem<em&gt; In Situ</em&gt; Ezilmiş Kromozomlar için Hibridizasyon

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state by transmission electron microscopy (TEM). This can be achieved with very low quantity of protein and in the buffer of choice, without the use of any stain, which is very useful to determine structure-function correlations of macromolecules. When combined with single-particle image processing, the technique has found widespread usefulness for 3D structural determination of purified macromolecules. 
The protocol presented here explains how to perform cryoEM and examines the causes of most commonly encountered problems for rational troubleshooting; following all these steps should lead to acquisition of high quality cryoEM images. The technique requires access to the electron microscope instrument and to a vitrification device. Knowledge of the 3D reconstruction concepts and software is also needed for computerized image processing. Importantly, high quality results depend on finding the right purification conditions leading to a uniform population of structurally intact macromolecules. 
The ability of cryoEM to visualize macromolecules combined with the versatility of single particle image processing has proven very successful for structural determination of large proteins and macromolecular machines in their near-native state, identification of their multiple components by 3D difference mapping, and creation of pseudo-atomic structures by docking of x-ray structures. The relentless development of cryoEM instrumentation and image processing techniques for the last 30 years has resulted in the possibility to generate de novo 3D reconstructions at atomic resolution level.

Do&#039;s and Don&#039;ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

Makromoleküler 3D İmar için bir örnek Hazırlanması Astar ve Yüksek Kalite Veri Toplama: Cryo-elektron mikroskobu Yapılması ve Yapılmaması Gerekenler

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Retroviral Entegrasyon Siteleri Amplifikasyon, Yeni Nesil Sıralama ve Genomik DNA Haritalama

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase synthesis using standard phosphoramidite chemistry. Oligonucleotides are post-synthetically labeled by two new photostable cyanine dyes using copper-catalyzed click-chemistry. The synthesis of both donor and acceptor dye is described and is performed in three consecutive steps. With the DNA as the surrounding architecture, these two dyes undergo an energy transfer when they are brought into close proximity by hybridization. Therefore, annealing of two single stranded DNA strands is visualized by a change of fluorescence color. This color change is characterized by fluorescence spectroscopy but can also be directly observed by using a handheld ultraviolet (UV) lamp. The concept of a dual fluorescence color readout makes these oligonucleotide probes excellent tools for molecular imaging especially when the described photostable dyes are used. Thereby, photobleaching of the imaging probes is prevented, and biological processes can be observed in real time for a longer time period.

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

Işığa siyanin boyası kullanarak Dalgaboyu değiştiren DNA Hibridizasyon Sondalar Sentezi

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

Protein Kalite Kontrol Sistemi incelenmesi<em&gt; D. diskodeyum</em&gt; Sıcaklık kontrollü Canlı Hücre Görüntüleme kullanarak

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...