La molienda FIB correlativa en 3D hace que los eventos celulares específicos e incluso raros sean accesibles para Cryo-TEM. Permitiendo la revelación de la ultra estructura de este evento directamente dentro del entorno nativo. El flujo de trabajo correlativo mejora la tasa de éxito de apuntar a estructuras celulares raras y ayuda a identificarlas sin ambigüedades en el entorno celular abarrotado.
Las demostradoras del procedimiento serán Anna Bieber y Christina Capitanio, expertas en tomografía crioelectrónica correlativa. Comience la criomicroscopía de fluorescencia de las rejillas sembradas de células adquiriendo una visión general de amplio campo en modo fluorescente y "reflejado". A continuación, seleccione cuadrados de cuadrícula adecuados con señal de fluorescencia.
Después de asegurarse de que las celdas y las cuentas se distribuyan uniformemente hacia el centro de cada cuadrado, elija los cuadrados en 200 cuadrículas de malla que sean accesibles tanto para el instrumento FIB-SEM como para el TEM, y que estén al menos a tres cuadrados del borde de la cuadrícula. En cada uno de los cuadrados de cuadrícula seleccionados, adquiera una pila fluorescente con un paso enfocado apropiado. Se deben utilizar objetivos de alta apertura numérica para aumentar el recuento de fotones y la precisión de la localización.
En un microscopio confocal con un objetivo de apertura numérica de 0,9, adquiera pilas con un tamaño de paso de 300 nanómetros y sobremuestree el valor de Nyquist. Registre varias pilas de colores y almacene las cuadrículas bajo nitrógeno líquido hasta su uso posterior. Utilice las marcas de recorte u orientación para garantizar la orientación adecuada de la cuadrícula para su posterior colocación en el TEM.
Cargue las rejillas en el instrumento criogénico FIB-SEM. Asegúrese de que la dirección de fresado sea perpendicular al eje de inclinación del TEM. Para recubrir las rejillas con una capa organometálica protectora, utilice un codificador de plasma y un sistema de inyección de gas en las posiciones de etapa predefinidas por la configuración FIB-SEM.
A continuación, registre la descripción general de la cuadrícula SEM y realice una correlación 2D con las vistas generales de FLM. Encuentre los cuadrados de la cuadrícula inspeccionando manualmente las resúmenes de la cuadrícula grabadas o utilizando un paquete de software. Seleccione y marque cuatro posiciones correspondientes para los cuadrados en la vista general de la cuadrícula FLM y SEM y calcule la transformación entre los puntos marcados para la correlación FLM-SEM.
A continuación, coloque los marcadores en el centro de los cuadrados de cuadrícula correspondientes para los que se han adquirido pilas de FLM antes de predecir su posición en la vista SEM. Para cada cuadrado de cuadrícula correlacionado, tome una imagen de haz de iones de baja corriente en el ángulo de fresado FIB elegido y seleccione un campo de visión con la posición y el aumento deseados que coincidan con los datos de fluorescencia. Para 200 cuadrículas de malla, adquiera datos FIB-SEM para que contengan cuadrados de cuadrícula individuales, incluidas las barras de cuadrícula.
Luego, tome una imagen SEM del mismo cuadrado para ayudar con la identificación de las perlas correspondientes en la vista de fluorescencia y haz de iones. Realice el registro de la pila FLM 3D sin procesar o deconvocada y la vista del haz de iones 2D para cada posición con la caja de herramientas de correlación 3D, 3D CT, cargando la pila FLM 3D recortada correspondiente y la vista del haz de iones en 3D CT.In los datos de fluorescencia, seleccione cuatro perlas de referencia y haga clic con el botón derecho en la lista de posiciones para determinar la posición 3D de las perlas a través del ajuste gaussiano de la señal en X, Y y Z.A continuación, seleccione las perlas correspondientes en la imagen del haz de iones para realizar una correlación 3D inicial. Del mismo modo, agregue más cuentas al registro para verificar la precisión de la correlación.
Omita algunas perlas de referencia claramente identificables tanto en la fluorescencia como en el haz de iones comprobando su ubicación predicha frente a la real en la imagen del haz de iones. En la TC 3D, se pueden ver los valores de error cuadrático medio o RMSE para evaluar la consistencia de la correlación. Asegúrese de que los valores RMSE sean pequeños y estén en el orden de la precisión de la localización.
A continuación, seleccione las señales celulares de destino y ajuste la posición 3D en la pila FLM antes de aplicar la transformación para predecir las posiciones de destino en la vista de haz de iones. Para cada cuadrado correlacionado, transfiera las posiciones predichas de las características de interés al instrumento FIB-SEM para colocar los patrones de fresado de láminas. Si hay varias señales por celda, coloque los patrones para incluir el máximo posible de puntos de interés en la misma lámina.
Fresado en bruto de las láminas seguido de fresado fino para obtener un espesor final de 150 a 250 nanómetros. Asegúrese de que la orientación de la lámina sea perpendicular al eje de inclinación cuando cargue las rejillas en el microscopio electrónico de transmisión. Adquiera un montaje de cuadrícula y vistas generales para cada cuadrado de cuadrícula que contenga láminas con un aumento y un tiempo de exposición adecuados para visualizar las cuentas de referencia en las imágenes TEM sin aumentar significativamente la dosis total de electrones.
Adquiera mapas TEM de alta resolución de cada lámina. El registro y el 3D-2D correlacionan la pila de FLM con el cuadrado de la cuadrícula TEM y las vistas generales de las láminas en 3D CT. Realice la correlación entre FLM y TEM de menor a mayor aumento en TEM. Después de transferir las posiciones, configure y ejecute series de inclinación en posiciones correlacionadas, luego use un aumento, desenfoque y dosis total apropiados para iniciar la adquisición de imágenes en la preinclinación determinada por la lámina utilizando un esquema de inclinación simétrica de dosis.
Siga la adquisición manual o por lotes de imágenes. En el análisis representativo, se muestra que la visión general TEM de bajo aumento del sitio de molienda localiza las características biológicas de interés. Posteriormente, se correlacionó una vista de mayor aumento con la proyección de intensidad máxima de FLM y se establecieron posiciones para la adquisición de tomografías.
En las imágenes adquiridas, se pudo visualizar el depósito de proteína endocítica en su ambiente nativo. La optimización de la muestra es muy importante. La preparación de la cuadrícula debe optimizarse para tener una buena distribución de las celdas a moler y un buen número de cuentas de referencia visibles en la mayoría de los cuadrados de la cuadrícula.
El fresado correlativo en 3D ha ayudado a revelar la ultraestructura de diferentes procesos celulares, como la progresión paso a paso de la autofagia en cada célula, y se utiliza para capturar un nuevo compartimento separado por fases.
