Este trabajo fue apoyado por el NIH R01 GM56244 a ANI, que incluye los fondos otorgados a través de la Recuperación y Reinversión de 2009, y por el NIH R01 GM87130 a Jarp

1. Aislamiento de los embriones Nota: Todas las operaciones con ratones se debe realizar de acuerdo con el cuidado de los animales y las políticas adecuadas de uso y protocolos <ol><li> Comprobar la presencia de un tapón de apareamiento en los ratones hembra de la mañana después del apareamiento y separar las hembras apareadas de los machos estudios, colocándolos en una jaula diferente. Del mediodía del día en que el tapón de apareamiento que se observa es considerado el día embrionario 0.5 (E0.5) de desarrollo. </li><li> En E8.5, (o la etapa deseada, si es diferente), el sacrificio del ratón usando un protocolo aprobado. </li><li> Humedezca la barriga del animal sacrificado con el 70% de etanol y abrir la cavidad abdominal. Los lugares de implantación, indicando la presencia de los embriones en desarrollo son vistos como un &quot;nudo en una cuerda&quot; disposición a lo largo de la longitud de cada cuerno uterino (Figura 1). Con la tijera, quitar los cuernos uterinos, corte cada sitio de implantación de forma individual para separar (fig. 1B) y colocarlos en una placa de Petri de 100 mm que contiene la temperatura ambiente (TA) disección (DMEM, 10% de suero fetal bovino, 20 mM HEPES pH 7,4 , 60 mg / ml de penicilina, estreptomicina 2 mM). </li><li> Con unas pinzas, retire cada embrión y las membranas que rodean el tejido uterino (fig. 1C) y colocarlas en un medio de disección fresco. </li><li> Aislar embriones individuales bajo un microscopio de disección con las pinzas. En esta etapa de desarrollo, los embriones están rodeados por el parietal del saco vitelino, que en contacto con el tejido deciduum, el saco vitelino visceral y el amnios. El amnios es una membrana transparente que está en contacto directo con el embrión. La visceral del saco vitelino se encuentra entre el amnios y el saco vitelino parietal y se distingue fácilmente en E8.5-E9.5 embriones por la presencia de vasos sanguíneos importantes que nutren al embrión. Retire cada embrión a partir de las membranas que rodean su transferencia y de forma individual en una nueva placa que contiene los medios de comunicación la disección para eliminar el exceso de sangre. La etapa de desarrollo puede variar de un embrión a embrión y entre camadas, representante E8.5 embriones y embriones representante E9.5 se muestran en la Figura 1D. </li><li> La transferencia de cada embrión en un tubo eppendorf de 1,5 ml que contiene 200 l de los medios de comunicación la disección (que se describe en el paso 4). </li></ol> 2. Homogeneización de los embriones aislados <ol><li> Agregar 20 unidades de colagenasa tipo II en un volumen de 200 ul (diluida en 1X Dubbecco fosfato de solución salina tamponada; DPBS) a cada tubo eppendorf. </li><li> Agite con cuidado las muestras en un agitador de 37 ° C a 100 rpm durante 20 min. </li><li> Resuspender bien mediante pipeteo para interrumpir grupos de células. </li><li> Solicitar la suspensión de células en la parte superior del filtro de células estériles (40 micras de malla) colocado en un tubo eppendorf de 1,5 ml. </li><li> Aplicar de inmediato 600 l de la temperatura ambiente 1X DPBS en la parte superior de las células colador para completar la separación. Deseche el filtro. </li><li> Centrifugar las muestras a 4 ° C a 4000 xg durante 5 min. </li><li> Eliminar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el precipitado en 1 ml de DPBS RT 1X. </li><li> Centrifugar las muestras a 4000 xg durante 1 min a temperatura ambiente. </li><li> Eliminar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el precipitado en 200 ul de los medios de comunicación disección RT. </li><li> Contar con las células embrionarias. Hay un promedio de 3.5 x 10 6 cells/E8.5 embrión. </li></ol> 3. Reticulación de la cromatina <ol><li> Añadir 5,6 l de formaldehído al 37% de las 200 muestras l para una concentración final de 1% de formaldehído. </li><li> Incubar las muestras durante 10 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar las muestras a 4 ° C a 4000 xg durante 3 min. </li><li> Eliminar el sobrenadante. </li><li> Resuspender las células de frío 1X DPBS que contiene 80 l / ml de cóctel inhibidor de la proteasa (PIC). </li><li> Centrifugar las muestras a 4 ° C a 4000 xg durante 3 min. </li><li> Eliminar el sobrenadante. En este paso, las muestras pueden ser congeladas a -80 ° C. Las muestras congeladas, reticulado son estables por varios meses. </li></ol> 4. Sonicación <ol><li> Resuspender el botón celular en 100 l de RT lisis SDS buffer (50 mM Tris-HCl (pH 8.1), 10 mM EDTA y 1% SDS con PIC recién añadido a un volumen total PIC/800 l l). Cuando volvieron a suspender, agregar un adicional de 100 ul de buffer de lisis SDS RT para promover la resuspensión. Mezclar bien con la pipeta y la inversión. </li><li> Incubar la suspensión de células en hielo durante 10 min. </li><li> Sonicar células lisadas con el ADN de corte de entre 200 y 500 pares de bases con un Bioruptor Diagenode ™ UCD200 (5 min x 8 veces: ajuste de amplitud de 30 seg seg on/30 de lo alto (320 vatios) de potencia). Las muestras deben estar rodeados por una suspensión de hielo. No permita que las muestras se caliente por encima de 4 ° C o congelar. Hay muchos tipos de sonicadores disponibles. Condiciones sonicación deben ser optimizados para cada baño de ultrasonidos a consecuencia de cizalladura del ADN reticulado con una longitud de aproximadamente 500 pb. </li><li> Centrifugar las muestras de ultrasonidos a 4 ° C a 14000 xg durante 10 min. </li><li> Ttransferencia se entiende el sobrenadante a un tubo eppendorf pre-enfriado en hielo. </li><li> Dividir la muestra sonica en un máximo de 5 alícuotas. Hemos determinado empíricamente que un embrión E8.5 se pueden dividir en alícuotas de 5. Menor o mayor tamaño de la muestra se pueden ampliar en consecuencia. En este paso, la muestra se puede almacenar a -80 ° C hasta su uso posterior. </li><li> Reserva una alícuota para su uso como entrada y almacenar a -20 ° C hasta el paso 6 cuando el cross-links se invertirá. Diluir las alícuotas otras 10 veces en el tampón de dilución de chip (16,7 mM Tris-HCl (pH 8.1), 1.2 mM EDTA, 1,1% Triton X-100, 167 mM NaCl y 0,01% SDS), que contiene PIC recién añadido en un μl/800 l buffer. </li></ol> 5. Pre-compensación y inmunoprecipitación <ol><li> Pre-claro el sobrenadante diluido con 75 l de ADN de esperma de salmón / proteína A o G lechada de agarosa-50% a los 4 ° C, con la rotación, durante 1 hora. El uso de cualquiera de las cuentas de la proteína A o proteína G debe ser determinada por el anticuerpo que se utiliza para el chip. Por ejemplo, la proteína A cuentas se recomiendan para los anticuerpos de conejo, mientras que la proteína G cuentas se recomiendan para anticuerpos de cabra o el ratón anticuerpos IgG 1. Para obtener información más detallada, consulte las recomendaciones hechas por el fabricante de cuentas. </li><li> Se centrifuga a 4 ° C en 2500 xg durante 1 min. </li><li> Transferir el sobrenadante a un nuevo pre-enfriado tubo eppendorf. </li><li> Añadir anticuerpos (4 mg / muestra) de la alícuota de pre-limpiado y se incuba durante la noche a 4 ° C con rotación. </li></ol> 6. El lavado de la cromatina complejo de proteínas de perlas <ol><li> Añadir 60 l de ADN de esperma de salmón / proteína A o G agarosa purines en cada vial e incubar a 4 ° C con rotación durante 1 hora. Utilice el mismo tipo de cuentas utilizadas para pre-limpieza en el paso 3. </li><li> Se centrifuga a 4 ° C a 1000 xg durante 1 min. </li><li> Retire con cuidado el sobrenadante y desecharlo. Mantener el complejo ADN-proteína de perlas en el hielo. </li><li> Resuspender el precipitado y lavar como se indica a continuación con una tampones de lavado, 2, 3 y 4. Lavado de buffers 1.3 deben ser refrigerados a 4 ° C y se lava con estos buffers se debe realizar a 4 ° C. El tampón de lavado 4 debe estar a temperatura ambiente y se lava con el tampón debe llevarse a cabo a temperatura ambiente. Cada lavado es de 5 minutos con rotación a la temperatura adecuada. Después de cada lavado, centrifugar a 4 ° C (temperatura ambiente de tampón de lavado 4 lavados) a 1000 xg durante 1 minuto, luego, con cuidado aspirar o eliminar el sobrenadante. </li></ol> Tampón 1: tampón de lavado de baja de sal (20 mM Tris-HCl (pH 8.1), 2 mM EDTA, 1% Triton X-100, 150 mM NaCl y 0,1% SDS), 1 ml x 2 lavados. Tampón 2: tampón de lavado de alta sal (20 mM Tris-HCl (pH 8.1), 2 mM EDTA, 1% Triton X-100, 500 mM NaCl y 0,1% SDS), 1 ml x 2 lavados. Tampón 3: sal LiCl tampón de lavado (10 mM Tris-HCl (pH 8.1), 1 mM EDTA, 1% IGEPAL-CA630, 0,25 M LiCl y 1% de ácido desoxicólico (sal de sodio)), 1 x 1 ml de lavado. Buffer 4: buffer TE (10 mM Tris-HCl (pH 8.1), 1 mM EDTA), 1 ml x 2 lavados. 7. Elución del complejo de la cromatina-anticuerpo <ol><li> Volver a suspender el lavado de la cromatina-proteínas de cuentas complejas en 250 l de tampón de elución recién preparada (1% SDS, 0,1 M NaHCO 3). Vigorosamente vórtice de la muestra durante 5 segundos, y luego se incuban a temperatura ambiente durante 15 minutos con la rotación. </li><li> Centrifugar a 2500 xg durante 1 minuto a temperatura ambiente y la transferencia del eluido en un tubo eppendorf nuevo. </li><li> Repita los pasos 1 y 2, y combinar los eluidos en el mismo tubo eppendorf. Los eluidos se deben mantener a temperatura ambiente. Una vez finalizado este paso, los eluidos se pueden almacenar a -20 ° C hasta su uso posterior. </li></ol> 8. Inversa de la Cruz-link y recuperar el ADN <ol><li> Añadir 20 l de NaCl 5 M 500 eluido l (40 l / ml para el control de entrada). </li><li> Calentar el eluidos a 65 ° C en un baño de agua durante 4 horas o toda la noche. </li><li> 10 l de cada muestra (incluyendo el control de entrada) se puede ejecutar en un 2% en gel de agarosa al lado de los marcadores de tamaño que abarca desde 0,1 hasta 1 Kbp para comprobar el tamaño de los fragmentos de ADN. El ADN aparece como una mancha y no una banda fuerte. El resto de las muestras se puede dejar a 65 ° C, mientras que el gel se está ejecutando. </li><li> Recuperar el ADN de cada muestra mediante un QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Añadir 600 buffer QG l (suministrado en el kit) para optimizar la absorción de ADN con la membrana de sílice en una columna de centrifugación QIAquick y 200 l de isopropanol en una muestra de l 500. Tenga en cuenta que el buffer QG contiene un indicador de pH que permite determinar fácilmente el pH de la muestra. Si el color de la muestra cambia de amarillo a violeta (pH&gt; 7,5) después de la mezcla, añadir 10 l de 3 NaAcetate M (pH 5,2) a la muestra y mezclar. Esto reduce el pH de la mezcla para maximizar la unión del ADN a las cuentas de la columna. </li><li> Antes de cargar la columna, compruebe que la mezcla para determinar si cualquier precipitado SDS está presente. Si SDS precipitaciones se ha producido, la muestra debe ser calentada en un42 ° C baño de agua hasta que el precipitado desaparece. </li><li> De carga 700 l de la mezcla en la columna de centrifugación QIAquick (columna de color púrpura en el kit) y se centrifuga a temperatura ambiente a 14000 xg durante 1 min. Deseche el flujo a través de la columna antes de continuar y repetir este paso con el resto de la muestra. </li><li> Añadir 500 buffer QG l para lavar la columna. Centrifugar a 14.000 xg a RT durante 2 min. Deseche el flujo a través de la columna antes de proceder. </li><li> Lavar la columna con 700 l de tampón de lavado PE (suministrado en el kit) para que el etanol se ha añadido a las instrucciones del fabricante. Centrifugar a 14.000 xg a RT durante 1 min. Deseche el flujo a través de la columna antes de proceder. </li><li> Repita el paso de centrifugación para eliminar por completo el resto de la memoria intermedia de educación física de la columna. Deseche el flujo a través y el tubo de recogida. </li><li> Eluir el ADN de la columna a un tubo eppendorf mediante la adición de tampón EB 60 l (tampón de elución suministrado en el kit). </li><li> Se centrifuga a temperatura ambiente a 14.000 xg durante 1 min. El ADN eluido se puede almacenar a -20 ° C hasta la detección. A 260 lecturas de los materiales recuperados suelen indicar las concentraciones de 90 a 120 ng / ul, para una recuperación total de ~ 6.7 ug por alícuota. Sin embargo, la proporción de 260/280 A estas muestras es normalmente&gt; 1,8, lo que sugiere que el ARN está presente en la muestra. Así, la cantidad exacta de ADN recuperado puede ser inferior. </li></ol> 9. El análisis del ADN recuperado <ol><li> SDS puede interferir con la actividad de la Taq polimerasa PCR. SDS se debe quitar por completo antes de realizar el PCR. Incubar el ADN en el hielo para precipitar cualquier residuo de SDS y se centrifuga a 4 ° C a 14000 xg durante 1 min. Transferir el sobrenadante a un nuevo paso eppendorf tube.This es muy recomendable. </li><li> Los eluidos de ADN puede ser detectada por PCR convencional o cuantitativa en tiempo real PCR (Q-PCR) con cebadores específicos para cada secuencia a analizar. L 5-10 de eluido total de ADN puede ser utilizado para un PCR o reacción de Q-PCR. PCR con el control de entrada se puede realizar con una dilución de 5.10 veces del ADN en comparación con la cantidad de otras muestras. PCR y las condiciones de Q-PCR puede variar, sin embargo, la limitada cantidad de material de partida se necesitan más ciclos de PCR. Para la detección por PCR convencional, se recomienda iniciar con 40 ciclos y el ajuste según sea necesario. </li></ol> 10. Resultados representante Hemos utilizado este protocolo para realizar chip de ambos E8.5 y E9.5 embriones (Figura 2). Los resultados demuestran que miogenina está presente en el promotor miogenina en E8.5 y E9.5 embriones. Chip ADN purificado se analizaron mediante PCR convencional (Figura 2A) y cuantitativa en tiempo real PCR (Figura 2B). Por el contrario, no había ninguna indicación de miogenina vinculante para el promotor miogenina en el saco vitelino, donde miogenina no se expresa. El interferón-γ (IFN), promotor, que contiene secuencias de juego del sitio de unión miogenina, fue utilizado como un control de secuencia negativa. Como era de esperar, myogenin no estaba obligado a la promotora IFN en ninguna de las muestras de tejido a prueba. En E8.5 y 9,5 embriones, myogenin se expresa específicamente en las somitas (Figura 3; 6,10), que son los precursores de los músculos esqueléticos. Así, los resultados indican que miogenina se une al promotor miogenina en las somitas en E8.5 y E9.5. <img src="/files/ftp_upload/2677/2677fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. E8.5 disección de embriones. (A) Alejado del útero cuerno (panel superior, un mayor aumento, se muestra en la imagen inferior). (B) cuerno uterino se corta con tijeras para separar los sitios individuales de implantación que contienen embriones individuales. (C) Los embriones que sobresale de los tejidos del útero durante la disección. Las flechas señalan los embriones todavía está cubierto por extra-embrionarios de tejido. (D) Dos E8.5 embriones de la misma camada. El embrión de la izquierda no se ha iniciado el proceso de transformación. El embrión de la derecha está pasando por atrás. La extrema derecha - representante de embriones E9.5. <img src="/files/ftp_upload/2677/2677fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Chip de ensayo que demuestra miogenina vinculante para el promotor miogenina en E8.5 y E9.5 embriones. (Arriba) el análisis de PCR convencional de 5 ul de ADN purificado a partir de experimentos chip utilizando un anticuerpo miogenina o no específica de IgG se realizó con los primers que amplifican una parte de la promotora miogenina -79 a 69 en relación con el sitio de inicio de transcripción que contiene un sitio de unión miogenina situado en -12 o cebadores que amplifican una parte del promotor de IFN que contiene una secuencia de juego del sitio de unión situado miogenina ~ 1075 pb aguas arriba del sitio de inicio de transcripción. El primer secuencias IFN utilizados fueron 5&#39;-GCT GAC AGA TCA CCC CGA GGC-3 &#39;y 5&#39;-TGA GGA TGG GGC AGG AGG CC-3&#39;. (Abajo) cuantitativa en tiempo real PCR análisis de las mismas muestras utilizadas en (A). Lade datos se representan como% de la entrada de + / - desviación estándar. <img src="/files/ftp_upload/2677/2677fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Myogenin se expresa específicamente en las somitas de E8.5 y E9.5 embriones. Todo el montaje hibridación in situ de miogenina muestra la expresión de ARNm específicos en los somitas. Tamaño de la barra en la imagen E8.5 - 200 micras. Tamaño de la barra en la imagen E9.5 - 500 micras.

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	<li>Minard, M. E., Jain, A. K., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+epigenetic+alterations+to+chromatin+during+development.">Analysis of epigenetic alterations to chromatin during development.</a> Genesis. 47, 559-572 (2009).</li><li>Kuo, M. H., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cross-linking+and+immunoprecipitation+for+studying+dynamic+Protein:DNA+associations+in+a+chromatin+environment.">In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment.</a> Methods. 19, 425-433 (1999).</li><li>Johnson, K. D., Bresnick, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+long-range+transcriptional+mechanisms+by+chromatin+immunoprecipitation.">Dissecting long-range transcriptional mechanisms by chromatin immunoprecipitation.</a> Methods. 26, 27-36 (2002).</li><li>Yusuf, F., Brand-Saberi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eventful+somite:+patterning,+fate+determination+and+cell+division+in+the+somite.">The eventful somite: patterning, fate determination and cell division in the somite.</a> Anat Embryol (Berl). 211, 21-30 (2006).</li><li>Buckingham, M., Bajard, L., Chang, T., Daubas, P., Hadchouel, J., Meilhac, S., Montarras, D., Rocancourt, D., Relaix, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+of+skeletal+muscle:+from+somite+to+limb.">The formation of skeletal muscle: from somite to limb.</a> J Anat. 202, 59-68 (2003).</li><li>Wright, W. E., Sassoon, D. A., Lin, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenin,+a+factor+regulating+myogenesis,+has+a+domain+homologous+to+MyoD.">Myogenin, a factor regulating myogenesis, has a domain homologous to MyoD.</a> Cell. 56, 607-617 (1989).</li><li>Edmondson, D. G., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+with+homology+to+the+myc+similarity+region+of+MyoD1+is+expressed+during+myogenesis+and+is+sufficient+to+activate+the+muscle+differentiation+program.">A gene with homology to the myc similarity region of MyoD1 is expressed during myogenesis and is sufficient to activate the muscle differentiation program.</a> Genes Dev. 3, 628-640 (1989).</li><li>Nabeshima, Y., Hanaoka, K., Hayasaka, M., Esumi, E., Li, S., Nonaka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenin+gene+disruption+results+in+perinatal+lethality+because+of+severe+muscle+defect.">Myogenin gene disruption results in perinatal lethality because of severe muscle defect.</a> Nature. 364, 532-535 (1993).</li><li>Hasty, P., Bradley, A., Morris, J. H., Edmondson, D. G., Venuti, J. M., Olson, E. N., Klein, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+deficiency+and+neonatal+death+in+mice+with+a+targeted+mutation+in+the+myogenin+gene.">Muscle deficiency and neonatal death in mice with a targeted mutation in the myogenin gene.</a> Nature. 364, 501-506 (1993).</li><li>Sassoon, D., Lyons, G., Wright, W. E., Lin, V., Lassar, A., Weintraub, H., Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+two+myogenic+regulatory+factors+myogenin+and+MyoD1+during+mouse+embryogenesis.">Expression of two myogenic regulatory factors myogenin and MyoD1 during mouse embryogenesis.</a> Nature. 341, 303-307 (1989).</li><li>Brennan, T. J., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenin+resides+in+the+nucleus+and+acquires+high+affinity+for+a+conserved+enhancer+element+on+heterodimerization.">Myogenin resides in the nucleus and acquires high affinity for a conserved enhancer element on heterodimerization.</a> Genes Dev. 4, 582-595 (1990).</li><li>Rosenthal, N., Berglund, E. B., Wentworth, B. M., Donoghue, M., Winter, B., Bober, E., Braun, T., Arnold, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+conserved+enhancer+downstream+of+the+human+MLC1/3+locus+is+a+target+for+multiple+myogenic+determination+factors.">A highly conserved enhancer downstream of the human MLC1/3 locus is a target for multiple myogenic determination factors.</a> Nucleic Acids Res. 18, 6239-6246 (1990).</li><li>Braun, T., Gearing, K., Wright, W. E., Arnold, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus-expressed+myogenic+determination+factors+require+E12+complex+formation+for+binding+to+the+myosin-light-chain+enhancer.">Baculovirus-expressed myogenic determination factors require E12 complex formation for binding to the myosin-light-chain enhancer.</a> Eur J Biochem. 198, 187-193 (1991).</li><li>Chakraborty, T., Brennan, T., Olson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+trans-activation+of+a+muscle-specific+enhancer+by+myogenic+helix-loop-helix+proteins+is+separable+from+DNA+binding.">Differential trans-activation of a muscle-specific enhancer by myogenic helix-loop-helix proteins is separable from DNA binding.</a> J Biol Chem. 266, 2878-2882 (1991).</li><li>French, B. A., Chow, K. L., Olson, E. N., Schwartz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterodimers+of+myogenic+helix-loop-helix+regulatory+factors+and+E12+bind+a+complex+element+governing+myogenic+induction+of+the+avian+cardiac+alpha-actin+promoter.">Heterodimers of myogenic helix-loop-helix regulatory factors and E12 bind a complex element governing myogenic induction of the avian cardiac alpha-actin promoter.</a> Mol Cell Biol. 11, 2439-2450 (1991).</li><li>Brennan, T. J., Chakraborty, T., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+of+the+myogenin+basic+region+identifies+an+ancient+protein+motif+critical+for+activation+of+myogenesis.">Mutagenesis of the myogenin basic region identifies an ancient protein motif critical for activation of myogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 5675-5679 (1991).</li><li>Lassar, A. B., Davis, R. L., Wright, W. E., Kadesch, T., Murre, C., Voronova, A., Baltimore, D., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+activity+of+myogenic+HLH+proteins+requires+hetero-oligomerization+with+E12/E47-like+proteins+in+vivo.">Functional activity of myogenic HLH proteins requires hetero-oligomerization with E12/E47-like proteins in vivo.</a> Cell. 66, 305-315 (1991).</li><li>Chakraborty, T., Brennan, T. J., Li, L., Edmondson, D., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+homooligomerization+contributes+to+the+dependence+of+myogenin+on+E2A+products+for+efficient+DNA+binding.">Inefficient homooligomerization contributes to the dependence of myogenin on E2A products for efficient DNA binding.</a> Mol Cell Biol. 11, 3633-3641 (1991).</li><li>Cserjesi, P., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenin+induces+the+myocyte-specific+enhancer+binding+factor+MEF-2+independently+of+other+muscle-specific+gene+products.">Myogenin induces the myocyte-specific enhancer binding factor MEF-2 independently of other muscle-specific gene products.</a> Mol Cell Biol. 11, 4854-4862 (1991).</li><li>Braun, T., Arnold, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+four+human+muscle+regulatory+helix-loop-helix+proteins+Myf3-Myf6+exhibit+similar+hetero-dimerization+and+DNA+binding+properties.">The four human muscle regulatory helix-loop-helix proteins Myf3-Myf6 exhibit similar hetero-dimerization and DNA binding properties.</a> Nucleic Acids Res. 19, 5645-5651 (1991).</li><li>Serna, d. e. l. a., L, I., Ohkawa, Y., Berkes, C. A., Bergstrom, D. A., Dacwag, C. S., Tapscott, S. J., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD+targets+chromatin+remodeling+complexes+to+the+myogenin+locus+prior+to+forming+a+stable+DNA-bound+complex.">MyoD targets chromatin remodeling complexes to the myogenin locus prior to forming a stable DNA-bound complex.</a> Mol Cell Biol. 25, 3997-4009 (2005).</li><li>Blais, A., Tsikitis, M., Acosta-Alvear, D., Sharan, R., Kluger, Y., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+initial+blueprint+for+myogenic+differentiation.">An initial blueprint for myogenic differentiation.</a> Genes Dev. 19, 553-569 (2005).</li><li>Cao, Y., Kumar, R. M., Penn, B. H., Berkes, C. A., Kooperberg, C., Boyer, L. A., Young, R. A., Tapscott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+gene-specific+analyses+show+distinct+roles+for+Myod+and+Myog+at+a+common+set+of+promoters.">Global and gene-specific analyses show distinct roles for Myod and Myog at a common set of promoters.</a> EMBO J. 25, 502-511 (2006).</li><li>Ohkawa, Y., Yoshimura, S., Higashi, C., Marfella, C. G., Dacwag, C. S., Tachibana, T., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenin+and+the+SWI/SNF+ATPase+Brg1+maintain+myogenic+gene+expression+at+different+stages+of+skeletal+myogenesis.">Myogenin and the SWI/SNF ATPase Brg1 maintain myogenic gene expression at different stages of skeletal myogenesis.</a> J Biol Chem. 282, 6564-6570 (2007).</li><li>Davie, J. K., Cho, J. H., Meadows, E., Flynn, J. M., Knapp, J. R., Klein, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+gene+selectivity+of+the+myogenic+basic+helix-loop-helix+transcription+factor+myogenin+in+embryonic+muscle.">Target gene selectivity of the myogenic basic helix-loop-helix transcription factor myogenin in embryonic muscle.</a> Dev Biol. 311, 650-664 (2007).</li><li>Metivier, R., Penot, G., Hubner, M. R., Reid, G., Brand, H., Kos, M., Gannon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor-alpha+directs+ordered,+cyclical,+and+combinatorial+recruitment+of+cofactors+on+a+natural+target+promoter.">Estrogen receptor-alpha directs ordered, cyclical, and combinatorial recruitment of cofactors on a natural target promoter.</a> Cell. 115, 751-763 (2003).</li><li>Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).</li></ol>

Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por la Universidad de Massachusetts Medical School IACUC.

En el protocolo de chip se describe, se muestra que la miogenina regulador miogénico se asocia con el promotor miogenina en el tejido esquelético precursor muscular presente en un solo E8.5 y E9.5 embriones. Estudios anteriores han caracterizado ampliamente miogenina unión a la caja de E que contienen secuencias, comenzando con los primeros experimentos in vitro utilizando gel de cambio traducido in vitro o producidas por bacterias y ADN miogenina radiomarcado que codifica la porci...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>ChIP Assay Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Upstate Cell Signaling Solutions, Millipore</td>
<td>17-295</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase Type II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17101015</td>
<td>Dilution by 1 x PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s modified eagle medium (DMEM) </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco Labs, Invitrogen</td>
<td>12100-061</td>
<td>High glucose content</td>
</tr>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s phosphate buffered saline 1X (DPBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco Labs, Invitrogen</td>
<td>14190-144</td>
<td>Calcium chloride free, Magnesium chloride free</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech, Inc.</td>
<td>35-010-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gel extraction kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>QIAquick</td>
<td>28704</td>
<td>50 reaction kit</td>
</tr>
<tr>
<td>Penicillin/streptomycin stock solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco Labs, Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5000 &mu;g/ml concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P8340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Salmon sperm DNA /Protein A agarose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>16-157</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>myogenin antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td>
<td>sc-576</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Normal rabbit IgG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>12-370</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Platinum PCR Supermix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11306-016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GoTaq Q-PCR master mix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>A6001</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

chromatin immunoprecipitation assay for tissue-specific genes using early-stage mouse embryos

Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) es una poderosa herramienta para identificar las proteínas: las interacciones de la cromatina que se producen en el contexto de las células vivas 1-3. Esta técnica ha sido ampliamente explotada en las células de cultivo de tejidos, y en menor medida, en el tejido principal. La aplicación de chip en el tejido embrionario de roedores, especialmente en los momentos iniciales de desarrollo, se complica por la limitada cantidad de tejido y la heterogeneidad de las células y tipos de tejidos en el embrión. Aquí presentamos un método para llevar a cabo mediante un chip el día embrionario disociados 8.5 (E8.5) embrión. Cromatina esquilada de un solo embrión E8.5 se pueden dividir en un máximo de cinco alícuotas, lo que permite que el material suficiente para el investigador y controles para la investigación de proteínas específicas: las interacciones de la cromatina. Hemos utilizado esta técnica para comenzar a documentar las proteínas: las interacciones de la cromatina durante la especificación de los tejidos específicos de los programas de expresión génica. La heterogeneidad de los tipos de células en un embrión necesariamente restringe la aplicación de esta técnica porque el resultado es la detección de proteínas: las interacciones de la cromatina sin distinguir si las interacciones ocurren en todos, un subconjunto de, o un solo tipo de células (s). Sin embargo, el análisis de genes específicos de tejido durante o después de la aparición de tejidos específicos de la expresión génica es posible por dos razones. En primer lugar, la inmunoprecipitación de los factores específicos de tejido necesariamente aislados de la cromatina del tipo de célula donde se expresa el factor. En segundo lugar, la inmunoprecipitación de coactivadores y las histonas que contiene modificaciones post-traduccionales que se asocian con la activación de genes sólo se encuentran en los genes y secuencias reguladoras de genes en el tipo de células donde el gen está siendo o ha sido activada. La técnica debe ser aplicable al estudio de la mayoría de los tejidos específicos de los eventos de activación genética. En el ejemplo que se describe a continuación, se utilizó E8.5 y E9.5 embriones de ratón para examinar los factores de unión en un promotor del gen específico del músculo esquelético. Somitas, que son las precursoras de los tejidos que los músculos del esqueleto del tronco y las extremidades se forman, están presentes en E8.5-9,5 4,5. Myogenin es un factor de regulación necesarios para la diferenciación del músculo esquelético 6.9. Los datos demuestran que miogenina se asocia con su propio promotor en E8.5 y E9.5 embriones. Porque miogenina sólo se expresa en somitas en esta etapa de desarrollo 6,10, los datos indican que las interacciones miogenina con su propio promotor ya se han producido en las células del músculo esquelético precursor en E8.5 embriones.

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Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Demostramos una inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) para identificar las interacciones factor en genes específicos de tejido durante o después de la aparición de tejidos específicos de expresión génica en el tejido embrionario del ratón. Este protocolo debe ser ampliamente aplicable para el estudio de la activación de genes específicos de tejido, como ocurre durante el desarrollo embrionario normal.

Ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina de los genes específicos de tejido utilizando etapa temprana de embriones de ratón

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

chromatin-immunoprecipitation-assay-for-tissue-specific-genes-using

Research

JoVE Journal

Biology

18.0K vistas.  University of Massachusetts Medical School. Demostramos una inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) para identificar las interacciones factor en genes específicos de tejido durante o después de la aparición de tejidos específicos de expresión génica en el tejido embrionario del ratón. Este protocolo debe ser ampliamente aplicable para el estudio de la activación de genes específicos de tejido, como ocurre durante el desarrollo embrionario normal.

Video: Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development. These proteins have been shown to be critical for cell fate determination, cell migration, and formation of neural circuits. Neuronal induction and patterning involve bone morphogenetic protein (BMP), sonic hedgehog (SHH), fibroblast growth factor (FGF), among others. In particular, the expression pattern of Fgf8 is in close proximity to regions expressing BMP4 and SHH. This expression pattern is consistent with developmental interactions that facilitate patterning in the telencephalon.

Here we provide a visual demonstration of a method in which an in ovo preparation can be used to test the effects of Fgfs in the formation of the forebrain. Beads are coated with protein and placed in the developing neural tube to provide sustained exposure. Because the procedure uses small, carefully placed beads, it is minimally invasive and allows several beads to be placed within a single neural tube. Moreover, the method allows for continued development so that embryos can be analyzed at a more mature stage to detect changes in anatomy and in neural patterning. This simple but useful protocol allows for real time imaging. It provides a means to make spatially and temporally limited changes to endogenous protein levels.

A variety of growth factors and proteins interact to induce cells to take on different cell fates during development. Here we demonstrate the use of an in ovo preparation to address possible interactions between different proteins in development by placing beads on E2.5 chick embryos.

La colocación de crecimiento recubierto Factor-bolas en los embriones tempranos de la etapa de pollo

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

Investigación

Biología

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental factors that might result in epigenetic alterations of gene expression and other molecular pathology. Traditionally, however, expression studies in postmortem brain were confined to quantification of mRNA or protein. The limitations encountered in postmortem brain research   such as variabilities in autolysis time and tissue integrities   are also likely to impact any studies of higher order chromatin structures. However, the nucleosomal organization of genomic DNA   including DNA:core histone binding - appears to be largely preserved in representative samples provided by various brain banks. Therefore, it is possible to study the methylation pattern and other covalent modifications of the core histones at defined genomic loci in postmortem brain. Here, we present a simplified native chromatin immunoprecipitation (NChIP) protocol for frozen (never-fixed) human brain specimens. Starting with micrococcal nuclease digestion of brain homogenates, NChIP followed by qPCR can be completed within three days. The methodology presented here should be useful to elucidate epigenetic mechanisms of gene expression in normal and diseased human brain.

Until recently, expression studies on human brain were limited to quantification of RNA or protein. With the chromatin immunoprecipitation techniques described in this paper, it will be possible to map histone methylation and other epigenetic regulators of gene expression in postmortem brain.

Un ensayo de la cromatina de tejido cerebral humano

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Inmunoprecipitación de la cromatina de células estaminales embrionarias humanas

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) para el ensayo dinámico de modificación de las histonas en la expresión génica activado en las células humanas

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell nuclei1. The technique uses DNA probes with unique sequences that hybridize to whole chromosomes or specific chromosomal regions, and serves as a powerful adjunct to classic cytogenetics. For instance, many earlier studies reported the frequent detection of increased chromosome aberrations in leukemia patients related with benzene exposure, benzene-poisoning patients, and healthy workers exposed to benzene, using classic cytogenetic analysis2. Using FISH, leukemia-specific chromosomal alterations have been observed to be elevated in apparently healthy workers exposed to benzene3-6, indicating the critical roles of cytogentic changes in benzene-induced leukemogenesis. 
Generally, a single FISH assay examines only one or a few whole chromosomes or specific loci per slide, so multiple hybridizations need to be conducted on multiple slides to cover all of the human chromosomes. Spectral karyotyping (SKY) allows visualization of the whole genome simultaneously, but the requirement for special software and equipment limits its application7. Here, we describe a novel FISH assay, OctoChrome-FISH, which can be applied for Chromosomics, which we define here as the simultaneous analysis of all 24 human chromosomes on one slide in human studies, such as chromosome-wide aneuploidy study (CWAS)8. The basis of the method, marketed by Cytocell as the Chromoprobe Multiprobe System, is an OctoChrome device that is divided into 8 squares, each of which carries three different whole chromosome painting probes (Figure 1). Each of the three probes is directly labeled with a different colored fluorophore, green (FITC), red (Texas Red), and blue (Coumarin). The arrangement of chromosome combinations on the OctoChrome device has been designed to facilitate the identification of the non-random structural chromosome alterations (translocations) found in the most common leukemias and lymphomas, for instance t(9;22), t(15;17), t(8;21), t(14;18)9. Moreover, numerical changes (aneuploidy) in chromosomes can be detected concurrently. The corresponding template slide is also divided into 8 squares onto which metaphase spreads are bound (Figure 2), and is positioned over the OctoChrome device. The probes and target DNA are denatured at high-temperature and hybridized in a humid chamber, and then all 24 human chromosomes can be visualized simultaneously. 
OctoChrome FISH is a promising technique for the clinical diagnosis of leukemia and lymphoma and for detection of aneuploidies in all chromosomes. We have applied this new Chromosomic approach in a CWAS study of benzene-exposed Chinese workers8,10.

A novel fluorescence in situ hybridization (FISH) method that simultaneously examines both numerical and structural chromosome alterations, particularly the specific chromosomal translocations associated with leukemia and lymphoma, of all 24 human chromosomes on a single device in one hybridization, is described.

Chromosomics: Detección de alteraciones numéricas y estructurales en todos los 24 cromosomas humanos de manera simultánea utilizando un nuevo ensayo FISH OctoChrome

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at different developmental stages. Epigenetic regulation contributes to a broad spectrum of biological processes, including cellular differentiation during embryonic development and homeostasis in adulthood. A critical strategy in epigenetic studies is to examine how various histone modifications and chromatin factors regulate gene expression. To address this, Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) is used widely to obtain a snapshot of the association of particular factors with DNA in the cells of interest.
ChIP technique commonly uses cultured cells as starting material, which can be obtained in abundance and homogeneity to generate reproducible data. However, there are several caveats: First, the environment to grow cells in Petri dish is different from that in vivo, thus may not reflect the endogenous chromatin state of cells in a living organism. Second, not all types of cells can be cultured ex vivo. There are only a limited number of cell lines, from which people can obtain enough material for ChIP assay.
Here we describe a method to do ChIP experiment using Drosophila tissues. The starting material is dissected tissue from a living animal, thus can accurately reflect the endogenous chromatin state. The adaptability of this method with many different types of tissue will allow researchers to address a lot more biologically relevant questions regarding epigenetic regulation in vivo1, 2. Combining this method with high-throughput sequencing (ChIP-seq) will further allow researchers to obtain an epigenomic landscape.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Recently high-throughput sequencing technology has greatly increased sensitivity of Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) experiment and prompted its application using purified cells or dissected tissue. Here we delineate a method to use ChIP technique with Drosophila tissue, which can address the endogenous chromatin state in a well-characterized biological system.

Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP), utilizando Drosophila Tejido

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used method for determining the interactions of different proteins with DNA in chromatin of living cells. Examples include sequence-specific DNA binding transcription factors, histones and their different modification states, enzymes such as RNA polymerases and ancillary factors, and DNA repair components. Despite its ubiquity, there is a lack of up-to-date, detailed methodologies for both bench preparation of material and for accurate analysis allowing quantitative metrics of interaction. Due to this lack of information, and also because, like any immunoprecipitation, conditions must be re-optimized for new sets of experimental conditions, the ChIP assay is susceptible to inaccurate or poorly quantitative results.
Our protocol is ultimately derived from seminal work on transcription factor:DNA interactions1,2 , but incorporates a number of improvements to sensitivity and reproducibility for difficult-to-obtain cell types. The protocol has been used successfully3,4 , both using qPCR to quantify DNA enrichment, or using a semi-quantitative variant of the below protocol.
This quantitative analysis of PCR-amplified material is performed computationally, and represents a limiting factor in the assay. Important controls and other considerations include the use of an isotype-matched antibody, as well as evaluation of a control region of genomic DNA, such as an intergenic region predicted not to be bound by the protein under study (or anticipated not to show changes under the experimental conditions). In addition, a standard curve of input material for every ChIP sample is used to derive absolute levels of enrichment in the experimental material. Use of standard curves helps to take into account differences between primer sets, regardless of how carefully they are designed, and also efficiency differences throughout the range of template concentrations for a single primer set. Our protocol is different from others that are available5-8 in that we extensively cover the later, analysis phase.

We describe a robust method for chromatin immunoprecipitation using primary T cells. The method is founded on standard approaches, but uses a specific set of conditions and reagents that improve efficiency for limited a quantities of cells. Importantly, a detailed description of the data analysis phase is presented.

Immunoprecipitation cromatina eficiente utilizando limitación de las cantidades de biomasa

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Generación de Plantilla ADN Immunoprecipitation cromatina alta calidad para la secuenciación de alto rendimiento (chip-ss)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Aislamiento eficaz y rápida de los embriones en etapa temprana de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Semillas

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Imaging semi-automatizado de fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...