1. Carrera en cinta para revelar el alcance de la lesión muscular en modelos de ratón <ol><li> Establecer el ángulo de la superficie de la cinta para su uso durante el protocolo de funcionamiento. Por lo general, una superficie plana o un ángulo de entre 7 ° y 15 ° grados hacia abajo o hacia arriba se utiliza. Algunas cintas tienen en el aparato integral para ajustar la inclinación, mientras que otros requieren de la cinta para ser elevada a través de otros medios. </li><li> Coloque una bandeja o una plataforma de laboratorio de color azul por debajo de la cinta antes de poner los animales en la cinta para recoger los residuos de los animales durante el protocolo de funcionamiento. </li><li> Antes de ratones corriendo debe aclimatarse al ambiente de la cinta. Esto implica la colocación de los animales en la cinta durante 15 minutos con la red eléctrica y el motor de accionamiento por correa, pero en la cinta no se mueve (es decir, con la velocidad ajustada a 0 m / s). </li><li> Encienda la motivación red eléctrica. La intensidad y la frecuencia de los pulsos utilizados usualmente se puede controlar en cintas de correr, pero varía de un fabricante a otro. En general, la intensidad máxima no está obligado a motivar a los ratones a correr, mientras que una alta frecuencia (al menos una vez cada dos segundos) mejorará el cumplimiento. </li><li> Activar el cinturón de cinta para iniciar el protocolo de funcionamiento. Una velocidad inicial de aproximadamente 5 m / min se debe utilizar para un período de calentamiento para los ratones. La velocidad de la cinta se puede acelerar lentamente, por lo general mediante la adición de 1.2 metros / minuto por cada minuto después del comienzo de la cinta. </li><li> El cumplimiento de los animales en la mayoría de los protocolos se pueden mejorar mediante la realización de una serie de tiradas cortas (5 minutos) a una velocidad de calentamiento de 3 a 10 días antes de la marcha experimental se inicia. </li><li> Un ejercicio de agotamiento agudo suele implicar el aumento de la velocidad de la cinta con el tiempo hasta una velocidad máxima (generalmente &lt;30 m / m) se logra y se mantiene hasta que los ratones muestran signos de agotamiento. Criterios para juzgar el agotamiento varían, pero generalmente incluyen un ratón de gastar más de la mitad del tiempo en la red eléctrica o 5 segundos consecutivos en la red eléctrica sin tener que regresar a la superficie cinta de correr. Después de un ratón individual se agota, puede ser removido de la cinta y el tiempo total de funcionamiento se pueden grabar. </li><li> Cambiar el ángulo de la cinta puede ser utilizado en ensayos agudos en ejecución para aumentar la carga de ejercicio (con un ángulo hacia arriba) o para inducir a dañar las contracciones excéntricas (con un descenso del ángulo) que destruyen las membranas del sarcolema de una fibra muscular. Colorante azul de Evans puede ser inyectado en los animales antes de estos procedimientos para su uso como colorante histológico para identificar las fibras musculares dañadas 2,3. </li><li> El entrenamiento de resistencia corriendo protocolos proporcionan una carga de ejercicio para el animal durante un período prolongado de tiempo (hasta meses) a fin de producir la remodelación del músculo o el sistema cardiovascular. Calentamiento procedimiento es el mismo que el anterior (paso 1.5), sin embargo la velocidad máxima suele ser menor y los tiempos de funcionamiento puede ser bastante largo (&gt; 1 hora). </li><li> Después de terminar de correr a los ratones pueden ser devueltos a sus jaulas. Cintas de correr por lo general llegar a ser muy sucia, mientras que los ratones se están ejecutando, en especial a través de protocolos de largo. Es necesario limpiar la cinta, por lo general con un spray de etanol al 70%, después de cada uso. </li></ol> 2. Ex ensayo in vivo de la capacidad de reparación de membrana de las fibras musculares aisladas después de la radiación UV-láser daños <ol><li> Diseccionar la capa superficial del flexor corto de los dedos (FDB) los músculos del pie del ratón. En primer lugar, cortar la piel de la única abierta en la línea media, teniendo cuidado de no dañar el músculo debajo, a continuación, hacer cortes horizontales y quitar la piel. El tendón del músculo blanco plano de la FDB (tendón proximal) se puede ver inserta en el hueso calcáneo. Sin rodeos por separado del tendón por las pinzas y cortar el tendón cerca del sitio de unión, toma el tendón sin la ayuda de fórceps y tire hacia arriba suavemente para separar la FDB de los tejidos circundantes al cortar cualquier tejido conectivo que permanecer unidos. Al ver a la rama de tendones distales a los dígitos puede ser la FDB mediante cortes en los tendones conectan a la capa más profunda de los músculos. </li><li> Ponga el paquete muscular FDB en 1 ml de solución de colagenasa pre-calentado a 37 ° C en un tubo Eppendorf de 1,5 ml, la cinta del tubo en posición horizontal en un 37 ° C agitador orbital y agitar a 200 rpm durante 65 min. Tiempos de incubación puede tener que ser ajustados para garantizar una digestión suficiente, lo que se indica con un aspecto desgastado y el color pálido de los músculos. </li><li> Transferir cuidadosamente el paquete de FDB digerido en un tubo de centrífuga de 1,5 l que contiene unos 600 l de 2,5 Ca 2 + Tyrode a través de una punta de pipeta de 1 ml con un extremo de corte que tiene un diámetro suficiente para permitir que el paquete de digerir para pasar fácilmente a través de sin interrupción. Mueva suavemente el tubo para sacudir las fibras sueltas del paquete. </li><li> Cortar una punta de pipeta de 30 l para que el diameter es sólo ligeramente menor que el haz muscular (entre 15 a 20 micras de diámetro) Use la pipeta para sacar con cuidado el paquete en la pipeta y luego empuje hacia atrás en la solución.. Repita este proceso hasta que la mayoría de las fibras se desvinculan del paquete. </li><li> Mezcla de fibras disociadas y girando suavemente el tubo, tome la cantidad deseada y colocar en un plato con fondo de vidrio delta T. El volumen de carga puede variar en función de la eficacia del aislamiento y el número de fibras útiles que se necesitan en un plato para un protocolo determinado. Las fibras restantes se pueden almacenar en el tubo a 4 ° C durante aproximadamente 6 horas de estudios adicionales. </li><li> Dejar que la cápsula que se siente en reposo durante 5 minutos. Esto permite que las fibras se adhieren al fondo de cristal de la placa. </li><li> Coloque el plato con fondo de cristal en un microscopio confocal equipado con un láser UV. Observe las fibras bajo el microscopio de fase con un aumento de&gt; 100 veces para comprobar la presencia de un patrón de estriación normal y una barra recta, como la forma. </li><li> Añadir FM1-43 o FM4-64 tintes styrylpyridinium 4 a solución a una concentración final de 2,5 M 5. </li><li> Para inducir daño a la posición de la fibra en la ventana de imagen por lo que la fibra está orientado en un ángulo de 45 ° desde la parte superior izquierda del campo de visión de la parte inferior derecha (Figura 1). Irradiar un área de píxeles de 5x5 (aproximadamente 0.9μmx0.9μm) de la membrana plasmática utilizando un láser UV (80 mW o más, 351/364 nm), establecido a la máxima potencia durante 5 segundos. La región irradiada debe partir de la membrana plasmática, es decir, la mitad de la caja de 5x5 debe estar dentro de la fibra, mientras que el resto debe estar fuera de la fibra (Figura 1). </li><li> Capturar imágenes de entrada tinte en la fibra, a intervalos de 5 segundos cada uno durante un máximo de 5 minutos. </li><li> Repita el paso 2.8 para no más de 3 fibras por plato, ya que el colorante fluorescente con el tiempo se endocitosis en la fibra y complican cualquier análisis de datos. Después de 3 fibras de un nuevo plato debe estar preparado en el paso 2.5. </li><li> Analizar los datos mediante el cálculo del cambio en la intensidad de fluorescencia (Df / F 0) entre cada fotograma capturado para medir la cantidad de entrada de medio de contraste. Esto requiere la medición de la fluorescencia media de un área de aproximadamente 200 m 2 con el software de análisis, tales como la disposición del público ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Para la comparación entre las fibras, el siguiente cálculo debe ser realizado para cada cuadro: Df / F 0, donde F 0 es la media de fluorescencia de la región de interés en el primer fotograma capturado (t = 0, antes de la lesión), y es Df el cambio en la fluorescencia de cada fotograma siguiente (FF 0). </li></ol> 3. En vivo de imágenes de células confocal para vigilar el proceso dinámico de Reparación de la Membrana Celular <ol><li> Micropipetas se hicieron a partir PYREX capilares. El capilar se coloca en un extractor de micropipeta y tirado por el programa pre-establecido (calor = 695; Tire = 50; Vel .= 55; hora = 250). </li><li> Micropipeta se adjuntó a una de 3 ejes (XYZ) micromanipulador. </li><li> Las células son transfectadas con el plásmido de ADN utilizando los métodos normales en un plato con fondo de cristal delta T. Los medios de comunicación deben ser cambiados a 2,5 mm de Ca 2 + tampón de Tyrode antes de comenzar los experimentos. </li><li> Los platos de cristal que contiene las células transfectadas fueron colocados en un microscopio confocal de barrido láser con el objetivo de 40X 1.3NA inmersión en aceite. </li><li> La aguda de células vivas daños se llevó a cabo mediante la inserción de la micropipeta en la membrana celular y rápidamente retirar la micropipeta fuera de la célula 3,6. Consecutivos imágenes de células vivas se han obtenido en un intervalo de 1,54 s / marco. </li><li> Para el ensayo de saponina inducida disrupción de la membrana, 0,005% de saponina (Sigma) en 2,5 mm de Ca 2 + tampón de Tyrode fue perfundido por un sistema de perfusión de flujo por gravedad a medida montado 7. La velocidad de perfusión es de aproximadamente 1 ml / min y la punta de la perfusión se debe colocar directamente sobre la célula se va a examinar. </li></ol> 4. Los resultados representativos: Una película representativa de la carrera en cinta ergométrica ratón se pueden hacer durante el rodaje. La película se ilustra la disminución de la capacidad de funcionamiento de la mg53-/ - ratones debido a daños en el músculo esquelético. La extensión del daño causado por el protocolo de los rayos UV-láser se detalla más arriba depende de la capacidad de reparación de la membrana de la fibra analizado. Esta capacidad se ve afectada por el genotipo del ratón desde que se aisló de la fibra, las condiciones extracelular, y cualquier alteración de la expresión de proteínas (transfección o infección). Una fibra normal de tipo salvaje permitirá la entrada de leve a moderada tinción (Figura 2a). Fibras musculares derivados de la mg53-/ - ratones con capacidad comprometida reparación de la membrana se mostrará la entrada más importante de colorante en la fibra (Figura 2b). Los resultados típicos para la translocación de microelectrodos muestran lesiones de MG53 contienen vesiobstáculos para el sitio de la lesión. Figura 3a y 3b muestran GFP-MG53 transfectadas C2C12 miotubos dañados mediante la inserción de la micropipeta en la membrana celular. En la celda antes de que el daño micropipeta, GFP-MG53 se encuentra tanto en la membrana plasmática y el citoplasma 3. Después de la penetración micropipeta, GFP-MG53 vesículas que contienen se movió hacia los sitios de daño (como se indica en punta de flecha). La figura 3c muestra una MG53 GFP-transfectadas C2C12 mioblastos tratados con 0,005% de saponina, un detergente que se puede permeabilizar la membrana plasmática. En el tratamiento de saponina, GFP-MG53 trasladadas desde el citosol a la membrana celular. <img src="/files/ftp_upload/2717/2717fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Weisleder, et al. Figura 1. Fibra de la alineación y la definición de región de la lesión. Correcta orientación de las fibras musculares aisladas en el campo de visión y definición de la región muestran una lesión. <img src="/files/ftp_upload/2717/2717fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Weisleder, et al. Figura 2. Daño de la fibra láser UV FDB. Las imágenes muestran las fibras antes de la lesión (0 segundos, a la izquierda) y en 200 segundos después de la lesión (derecha). Las fibras de un ratón de tipo salvaje (a) muestran lesiones leves. Las fibras procedentes de los ratones con la reparación de la membrana comprometida (b) permitir que más tinte para entrar. <img src="/files/ftp_upload/2717/2717fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Weisleder, et al. Figura 3. Daños microelectrodo y saponina a las células cultivadas. Las imágenes muestran miotubos C2C12 (a, b) y mioblastos C2C12 (c) antes de la lesión (arriba) y después de la lesión (abajo). Las células dañadas con un microelectrodo (a, b) muestran MG53 desplazamiento a los sitios de la lesión (flechas). Las células tratadas con saponina (c) muestran MG53 translocación a la membrana celular.

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Carrera en cinta ergométrica es una metodología útil a proporcionar una carga de ejercicio para los animales tratados. Como una metodología para la medición de la función muscular o la capacidad de resistencia es un enfoque notablemente ruidoso que es difícil de ejecutar en forma consistente reproducible 8. En general, los tiempos hasta el agotamiento puede ser utilizado como un punto final para resolver las diferencias principales entre los grupos experimentales, tales como las que existen entre algunas líneas de octavos de final del ratón y los ratones de tipo salvaje 9. Manipulaciones experimentales que producen diferencias más sutiles, tales como algunos ensayos farmacéuticos, no puede resolver las diferencias por encima del ruido asociado a esta técnica. Con el fin de maximizar la reproducibilidad y la sensibilidad de estas técnicas es importante para mantener las condiciones para una sesión a otra muy de cerca. La hora del día los animales se ejercen, así como las condiciones de período de calentamiento utilizado, son factores importantes y debe permanecer constante de ensayo a otro. Efectos de la tensión puede tener un impacto significativo en el diseño de los protocolos de rutina, como ciertas cepas de ratones puede funcionar durante mucho más tiempo en la cinta que otras cepas y responden de manera diferente al ejercicio de resistencia 10. Como pauta general, muchos ratones se podrá ejecutar total de 200-300 metros en un estudio de agotamiento con el aumento constante de la velocidad de la cinta (5 m / m velocidad inicial de 1 m / m añadido por cada minuto después del arranque). Para un ejercicio de resistencia de los ratones se puede ejecutar de 9 a 12 m / m durante 30 minutos dos o tres veces a la semana. Sin embargo, los estudios individuales por lo general requieren una optimización del protocolo para que coincida con las necesidades individuales de experimentación. El procedimiento de los rayos UV-láser ha demostrado ser un método eficaz para medir la capacidad de reparación de la membrana de las fibras musculares esqueléticas 3,6,11. Un componente vital para el éxito de estos experimentos es el uso de las fibras musculares que sólo mostrar una apariencia recta, en forma de varilla con un patrón regular de estrías y un sarcolema suave que no parece arrugada. Si las fibras musculares de otro tipo son seleccionados daño de la membrana puede estar ya presente en las fibras y la interpretación de los resultados de estos experimentos pueden ser complicados. También es importante que la orientación de la fibra y la definición de la región irradiada que se definen en la Figura 1. Esto proporciona una lesión de tamaño reproducible, permitiendo así la comparación entre las fibras. Si la región definida de la lesión se encuentra por completo dentro de la fibra, una lesión, se creará en lugar de interrumpir el sarcolema. Además, el valor calculado para Df / F 0 es muy sensible a la región de interés seleccionados para la medición de la fluorescencia media. Un área de aproximadamente 200μm 2, adyacentes e incluyendo el sitio de la lesión, es la adecuada. A diferencia de la región definida por lesión, esta área debe estar completamente dentro de la fibra. Si se incluye el espacio fuera de la fibra, el área en blanco resultante se incrementará Df / 0 F en las fibras con la entrada de tinte poco tiempo que reduce Df / 0 F en las fibras con un fenotipo más grave. Esto disminuye la sensibilidad de la prueba, con lo que la comparación entre las fibras más difícil. Para la prueba de daño micropipeta, el ángulo entre la micropipeta y un plato con fondo de cristal debe ser aproximadamente 45 grados con el fin de los daños efectivamente la membrana celular. Las células fueron elegidos por los daños micropipeta debe estar bien pegada al fondo del recipiente y de células redondeadas no debe ser utilizado desde más probable es que se separará después de meter micropipeta. Experimentos saponina permeabilzation son técnicamente menos exigentes y más rápido para llevar a cabo relativamente en comparación con los ensayos de penetración micropipeta. Sin embargo, existen varias limitaciones a los daños saponina, entre ellos el de una sola célula puede ser utilizado por plato desde la saponina se difundirá y daños en otras células en el plato.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Roedor cinta </td><td> Columbus Instrumentos Exer 03.06 o su equivalente </td><td></td></tr><tr><td> 70% de etanol </td><td> ISC Bioexpress </td><td></td></tr><tr><td> Herramientas de disección como pinzas de punta fina, tijeras de primavera </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td></td></tr><tr><td> 2 mg / ml de colagenasa tipo I </td><td> Sigma </td><td></td></tr><tr><td> 0 Ca 2 + Tyrode buffer (140 mM NaCl, KCl 5 mM, HEPES 10 mM, MgCl2 2 mM, pH 7,2, 290 mOsm) </td><td> Sigma </td><td></td></tr><tr><td> 2,5 Ca 2 + Tyrode buffer (140 mM NaCl, 2,5 mM de CaCl2, KCl 5 mM, HEPES 10 mM, 2 mM MgCl 2, pH 7,2, 290 mOsm) </td><td> Sigma </td><td></td></tr><tr><td> Temperatura controlable agitador orbital </td><td> New Brunswick o equivalente </td><td></td></tr><tr><td> Delta TPG plato </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1207133 </td></tr><tr><td> LSM 510 microscopio confocal con una empresa 80 mW láser UV o equivalente microscopio confocal </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> FM1-43 o los tintes FM4-64 </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> Los capilares de borosilicato Tamaño 0,8-1,0 x 100 mm </td><td> PYREX </td><td> Parte N º 9530-2 </td></tr><tr><td> Micropipeta extractor </td><td> Sutter Instrumentos </td><td> modelo P-97 </td></tr><tr><td> 3 ejes micromanipulador </td><td> Narishige </td><td> MHW-3 </td></tr><tr><td> Radiación láser de 2100 microscopio confocal de barrido microscopio o equivalente </td><td> BioRad </td><td> MHW-3 </td></tr><tr><td> Saponina </td><td> Sigma </td><td> 47036 </td></tr></tbody></table>

visualization of mg53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems

Reparación de una lesión aguda de la membrana celular es un proceso elemental de la fisiología celular normal y defectuosa reparación de la membrana se ha relacionado con muchas enfermedades humanas degenerativas. El reciente descubrimiento de la MG53 como un componente clave de la maquinaria de volver a sellar la membrana permite una mejor comprensión molecular de la biología básica de la reparación de tejidos, así como para posibles aplicaciones traslacional en medicina regenerativa. Aquí se detallan los protocolos experimentales para explorar la función in vivo de la MG53 en la reparación de una lesión muscular a través de protocolos esfuerzo en tapiz rodante en modelos de ratón, para las pruebas de la membrana ex vivo la capacidad de reparación mediante la medición de entrada de un colorante en las fibras musculares aisladas, y para vigilar el proceso dinámico de tráfico de vesículas MG53-mediada y reparación de la membrana celular en las células cultivadas mediante microscopía confocal de células en vivo.

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Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Aquí descritos son protocolos que se utilizan para visualizar el proceso dinámico de la MG53 mediada por reparación de la membrana celular en todo el animal y en el nivel celular. Estos métodos se pueden aplicar para investigar la biología celular de volver a sellar la membrana plasmática y la medicina regenerativa.

Visualización de MG53 mediada por reparación de la membrana celular mediante In vivo Y In vitro Sistemas de

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

visualization-mg53-mediated-cell-membrane-repair-using-vivo-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

12.3K vistas.  Robert Wood Johnson Medical School. Aquí descritos son protocolos que se utilizan para visualizar el proceso dinámico de la MG53 mediada por reparación de la membrana celular en todo el animal y en el nivel celular. Estos métodos se pueden aplicar para investigar la biología celular de volver a sellar la membrana plasmática y la medicina regenerativa.

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Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

Utilizando Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) para desarrollar herramientas de diagnóstico

Investigación

Biología

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

Vídeo Bioinformática Análisis de Crecimiento Humano Colonia células madre embrionarias

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

El análisis de Schwann-astrocito interacciones utilizando In Vitro Ensayos

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level. There are several methods, both in vitro and in vivo, to evaluate protein binding, and at least two methods that complement the shortcomings of each other should be conducted to obtain reliable insights. 
For an in vivo assay, the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay represents the most popular and least invasive approach that enables to detect protein-protein interaction within living cells, as well as identify the intracellular localization of the interacting proteins 1,2. In this assay, non-fluorescent N- and C-terminal halves of GFP or its variants are fused to tested proteins, and when the two fusion proteins are brought together due to the tested proteins&#x2019; interactions, the fluorescent signal is reconstituted3-6. Because its signal is readily detectable by epifluorescence or confocal microscopy, BiFC has emerged as a powerful tool of choice among cell biologists for studying about protein-protein interactions in living cells 3. This assay, however, can sometimes produce false positive results. For example, the fluorescent signal can be reconstituted by two GFP fragments arranged as far as 7 nm from each other due to close packing in a small subcellular compartment, rather that due to specific interactions7.
Due to these limitations, the results obtained from live cell imaging technologies should be confirmed by an independent approach based on a different principle for detecting protein interactions. Co-immunoprecipitation (Co-IP) or glutathione transferase (GST) pull-down assays represent such alternative methods that are commonly used to analyze protein-protein interactions in vitro. However, iIn these assays, however, the tested proteins must be readily soluble in the buffer that supportsused for the binding reaction. Therefore, specific interactions involving an insoluble protein cannot be assessed by these techniques.
 Here, we illustrate the protocol for the protein membrane overlay binding assay, which circumvents this difficulty. In this technique, interaction between soluble and insoluble proteins can be reliably tested because one of the proteins is immobilized on a membrane matrix. This method, in combination with in vivo experiments, such as BiFC, provides a reliable approach to investigate and characterize interactions faithfully between soluble and insoluble proteins. In this article, binding between Tobacco mosaic virus (TMV) movement protein (MP), which exerts multiple functions during viral cell-to-cell transport8-14, and a recently identified plant cellular interactor, tobacco ankyrin repeat-containing protein (ANK) 15, is demonstrated using this technique.

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Testing protein-protein interaction is indispensable for dissection of protein functionality. Here, we introduce an in vitro protein-protein binding assay to probe a membrane-immobilized protein with a soluble protein. This assay provides a reliable method to test interaction between an insoluble protein and a protein in solution.

De proteínas de membrana de superposición de ensayo: Un protocolo de prueba de interacción entre las proteínas soluble e insoluble In vitro</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualización y Análisis de las moléculas de ARNm mediante fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly understood. Here assays are described to monitor the ability and kinetics of healing of cultured cells following localized injury. The first protocol describes an end point based approach to simultaneously assess cell membrane repair ability of hundreds of cells. The second protocol describes a real time imaging approach to monitor the kinetics of cell membrane repair in individual cells following localized injury with a pulsed laser. As healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of injury, the third protocol describes the use of above end point based approach to assess one such trafficking event (lysosomal exocytosis) in hundreds of cells injured simultaneously and the last protocol describes the use of pulsed laser injury together with TIRF microscopy to monitor the dynamics of individual subcellular compartments in injured cells at high spatial and temporal resolution. While the protocols here describe the use of these approaches to study the link between cell membrane repair and lysosomal exocytosis in cultured muscle cells, they can be applied as such for any other adherent cultured cell and subcellular compartment of choice.

The process of healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of cell membrane injury. This protocol describes assays to monitor these processes.

Imágenes de células lesión de la membrana y procesos subcelulares implicadas en la reparación

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes precursor mRNA beyond the end of mature RNAs, and an active process of endonuclease activity is required at a specific site. Cleavage of the precursor RNA normally occurs 10-30 nt downstream from the consensus polyA site (AAUAAA) after the CA dinucleotides. Proteins from the cleavage complex, a multifactorial protein complex of approximately 800 kDa, accomplish this specific nuclease activity. Specific RNA sequences upstream and downstream of the polyA site control the recruitment of the cleavage complex. Immediately after cleavage, pre-mRNAs are polyadenylated by the polyA polymerase (PAP) to produce mature stable RNA messages.
Processing of the 3&#8217; end of an RNA transcript may be studied using cellular nuclear extracts with specific radiolabeled RNA substrates. In sum, a long 32P-labeled uncleaved precursor RNA is incubated with nuclear extracts in vitro, and cleavage is assessed by gel electrophoresis and autoradiography. When proper cleavage occurs, a shorter 5&#8217; cleaved product is detected and quantified. Here, we describe the cleavage assay in detail using, as an example, the 3&#8217; end processing of HIV-1 mRNAs.

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3&#039; End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

RNA polymerase II synthesizes a precursor RNA that extends beyond the 3' end of the mature mRNA. The end of the mature RNA is generated cotranscriptionally, at a site dictated by RNA sequences, via the endonuclease activity of the cleavage complex. Here, we detail the method to study cleavage reactions in vitro.

Análisis de las reacciones de procesamiento del ARN que utilizan teléfonos Free Systems: 3 &#39;End división de pre-mRNA Sustratos<em&gt; In vitro</em

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

La medición de la rigidez de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ratón aortas Usando microscopía de fuerza atómica

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.

In Vitro e In Vivo métodos para determinar la permeabilidad de la célula epitelial Intestinal

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.