Este ensayo fue desarrollado para abordar cuestiones clave en el campo de la biología de la membrana plasmática y para establecer cómo las células dañadas pueden volver a sellar su membrana plasmática. Esta técnica se puede utilizar para medir la eficiencia del resaculo de membrana plasmática en una capacidad de alto rendimiento e identificar proteínas específicas y las vías correspondientes que median el resaector de membrana plasmática. Comience agregando 20 mililitros de una 2,5 veces 10 a las quintas células de HeLa por mililitro de suspensión media de crecimiento en una cuenca de pipeta estéril y utilice una pipeta serológica de 10 mililitros para mezclar a fondo las células.
A continuación, utilice una micropipeta multicanal para sembrar 100 microlitros de células por pozo en triplicado en una placa tratada de cultivo de tejido de poliestireno negro de 96 pocillos. Recuerde que una distribución celular homogénea es clave para un experimento exitoso, ya que las comparaciones entre todas las condiciones experimentales requieren recuentos de células equivalentes. Después de 24 horas en la incubadora de cultivo celular humidificado a 37 grados Celsius y 5%CO2, precalienta el lector de placas a 37 grados Celsius y establece la configuración óptica en monocromador, el modo de lectura a fluorescencia y el tipo de lectura en cinético.
En la configuración de longitud de onda, seleccione una excitación de nueve nanómetros y un paso de banda de emisión de 15 nanómetros. Para ensayos que utilicen yoduro de propidio, establezca las longitudes de onda de excitación y emisión en 535 nanómetros y 617 nanómetros, respectivamente. En Tipo de placa, seleccione 96-wells para el formato de placa y seleccione una configuración de placa preestablecida correspondiente a una placa inferior transparente de pared negra.
En el área de lectura, resalte los pozos que se analizarán a lo largo del ensayo cinético. En PMT y óptica, preestablece los destellos por lectura a seis y marque la casilla para leer desde abajo. En el tiempo, introduzca cero horas 30 minutos y cero segundos en el tiempo total de ejecución para un ensayo cinético de 30 minutos e introduzca cero horas cinco minutos y cero segundos para el intervalo.
Confirme la configuración especificada en la información de configuración y haga clic en Aceptar. A continuación, haga clic en Leer para iniciar la ejecución cinética. Para establecer los parámetros de imagen dentro del modo de configuración, establezca MiniMax para la configuración óptica, la creación de imágenes para el modo de lectura y el punto final para el tipo de lectura. En longitudes de onda, seleccione la luz transmitida y las cajas de fluorescencia apropiadas correspondientes a las longitudes de onda experimentales de excitación y emisión.
Establezca el tipo de placa y el área de lectura como se acaba de demostrar y en la configuración del área de pozo, establezca el número de sitios dentro de un pozo para ser creados. En la configuración de adquisición de imágenes para GFP, configure el dispositivo para que cree una imagen de todo el pozo con un tiempo de exposición de 20 milisegundos por imagen. Para la luz transmitida, adquiera una sola imagen del centro de cada pozo con un tiempo de exposición de ocho milisegundos.
Para el yoduro de propidio, adquiera una sola imagen en el centro de cada pozo con un tiempo de exposición de 20 milisegundos. A continuación, confirme la configuración en la información de configuración y haga clic en Aceptar y lea para iniciar la imagen. Para configurar un ensayo basado en fluorescencia de alto rendimiento para las condiciones permisivas de reparación, lave las células dos veces con 200 microlitros de 37 grados Celsius M1 medio por pozo y agregue 100 microlitros de medio M1 de 37 grados Celsius fresco complementado con 30 micromolares de yoduro de propidium después de desechar el segundo lavado.
Para condiciones restrictivas de reparación, lave las células una vez con 200 microlitros de 37 grados Celsius M2 medio complementados con cinco EGTA milimétricas por pozo seguido de un lavado con 200 microlitros de M2 medio solo. Después de desechar el segundo lavado, añadir 100 microlitros de medio fresco de 37 grados Celsius M2 complementado con 30 micromolar propidium yoduro per well. A continuación, imagine la placa bajo la luz transmitida, GFP y PI como se acaba de demostrar.
Mientras se está imagenndo la placa, coloque una microplaca de polipropileno de fondo redondo de 96 pozos sobre hielo y configure la placa como se acaba de demostrar para la placa anterior. Para condiciones permisivas de reparación, añadir 100 microlitros de hielo frío M1 medio complementado con 60 micromolar propidium yoduro per bien seguido de la adición de 100 microlitros de hielo frío M1 con o sin 4X listeriolysin O per well. Para condiciones restrictivas de reparación, añadir 100 microlitros de medio M2 helado complementado con 60 micromolares proppidium yoduro per well seguido de la adición de 100 microlitros de hielo frío M2 con o sin 4X listeriolysin O per well.
Es imperativo preparar la listeriolysin O a la concentración experimental adecuada sobre hielo aproximadamente cinco minutos antes del inicio del ensayo cinético cuando la placa uno está sobre hielo y se está preparando la placa dos. Cuando la primera placa haya terminado de hacer la toma de imágenes, transfiera inmediatamente la placa a una lámina de aluminio sobre hielo. Después de cinco minutos, transfiera 100 microlitros de cada pozo de la segunda placa al pozo correspondiente apropiado en la primera placa enfriada, insertando las puntas de la pipeta por debajo del menisco de solución en cada pozo antes de expulsar el volumen sin mezclar para una distribución adecuada de la toxina.
Permita que la toxina se adhie a las células del huésped durante un minuto y transfiera inmediatamente la primera placa al lector de placas para el ensayo postcinético utilizando el modo espectrofluorómetro. Al final del ensayo cinético, adquiera inmediatamente una imagen post-cinética de la imagen de la placa como se demuestra para la imagen precinética. Para determinar el recuento de celdas en función de la fluorescencia nuclear, en el software de enumeración de celdas de microplacas en la configuración, seleccione el renálisis y, en la configuración del análisis de imágenes, seleccione el análisis de objetos discretos utilizando 541 como longitud de onda para encontrar objetos.
Dentro de la opción Buscar objetos, utilice el método de búsqueda de dibujos en imágenes, seleccione núcleos y haga clic en Aplicar, luego haga clic en Aceptar y lea para iniciar el algoritmo de recuento de celdas. La expresión de GFP no interfiere con las mediciones de intensidad de yoduro propidium en presencia o ausencia de tratamiento con listeriolysin O. La expresión de yoduro de propidio puede sangrar a través de la fluorescencia de GFP como lo demuestra un aumento de la intensidad de la fluorescencia de GFP en las células H2B-GFP de HeLA en el ensayo de imágenes postcinéticas en comparación con el análisis precinético.
Sin embargo, es importante destacar que este cruce no afecta al recuento de células, ya que el proceso de segmentación implicado en la enumeración de los núcleos no se ve afectado por un aumento de la fluorescencia GFP. En ausencia de listeriolysin O, la integridad de la membrana plasmática permanece constante en presencia o ausencia de calcio extracelular, mientras que el tratamiento con listeriolysin O en presencia de medio suplementado con calcio da como resultado un aumento constante de la intensidad de fluorescencia de yoduro propidio. En ausencia de calcio extracelular sin embargo, hay un aumento significativamente más pronunciado en la fluorescencia de yoduro propidium, lo que refleja la ausencia de resedimiento de membrana.
Alternativamente, un tinte de unión de ácido nucleico de cara nucociana con fluorescencia en el rojo lejano se puede sustituir por yoduro de propidio para minimizar la superposición espectral con la GFP. Además, el coeficiente de excitación más grande para el tinte rojo lejano exhibe una mayor relación señal-ruido y una mejor resolución entre las condiciones de reparación permisiva y restrictiva de la reparación. Al intentar este procedimiento, se recomienda etiquetar todos los tubos un día antes del experimento, ya que esto le preparará para toda la preparación del reactivo el día del experimento.
Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la citometría de imagen para responder preguntas adicionales, como si un poro forma toxina dañe todas las células uniformemente o que algunas células sean más susceptibles que otras. Después de su desarrollo, esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores en los campos de la enfermedad infecciosa y la reparación de la membrana plasmática exploren los efectos del tamaño de los poros en la eficiencia de reparación de diferentes tipos de células.
