Las mitocondrias son orgánulos esenciales de células eucariotas capaces de respirar aeróbicas. Su disfunción es una fuente bien conocida de enfermedad humana. Las mitocondrias de levadura de Baker contienen un genoma circular que codifica ocho proteínas.
En este video, describimos el protocolo utilizado para ensayo de biosíntesis proteica en mitocondrias de levadura mediante etiquetado radiactivo de productos traslacionales y posterior separación por electroforesis de gel. El procedimiento incluye varios pasos principales. Levadura de rayas de cultivos de caldo congelados en platos frescos con el medio adecuado.
Ponga las placas en la incubadora de cultivo a 30 grados durante 24 a 48 horas. Inocular estos cultivos en dos mililitros de medio de la veta fresca en un tubo de 15 mililitros e incubarlos durante la noche agitando a 200 RPM a 30 grados. Mida la densidad óptica del cultivo en la longitud de onda de 600 nanómetros.
Tome el volumen correspondiente a 0,2 unidades de absorbencia en tubos estériles Las células de levadura paleta a 9.000 G durante 30 segundos a temperatura ambiente. Desecha este sobrenadante. Lave las células con 0,5 mililitros de agua estéril vórtice durante cinco segundos.
Células de levadura de palet a 9.000 G durante 30 segundos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante. Diluir las células en dos mililitros de agar de toallita fresca medio.
Incubar el borde tomado a 200 RPM y 30 grados hasta que la densidad óptica alcance de 1,5 a 1,9 de 1,5 a 1,9 valores. Transfiera el volumen de cultivo equivalente a una unidad óptica en tubo de micro centrífuga. Gire los tubos a 3000 G durante un minuto.
Deseche el sobrenadante. Lave las células con 0,5 mililitros de agua estéril vórtice durante cinco segundos. Células de levadura de palete a 9.000 G durante 30 segundos a temperatura ambiente Deseche el sobrenadante.
Vuelva a suspender las células de levadura en 0,5 mililitros de búfer de traducción estéril. Coloque la suspensión en un tubo de 15 mililitros. Añadir cicloheximida a la suspensión celular hasta la concentración final de 0,2 miligramos por mililitro Incubar durante cinco minutos borde tomado a 200 RPM y 30 grados para inhibir la traducción citosólica.
Añadir de 25 a 30 Añadir de 25 a 30 microcurie de metionina S35 de metionina S35 a suspensión celular e incubar durante 30 minutos borde tomado a 200 RPM y 30 grados. Añadir metionina fría sin etiquetar y borymicina para detener la incubación de etiquetado durante 10 minutos borde tomado a 200 RPM y 30 grados. Recoger las células de levadura por centrifugación a 9.000 G durante 30 segundos.
Lave las células con 0,5 mililitros de agua estéril vórtice durante cinco segundos. Células de levadura de palet a 9.000 G durante 30 segundos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante.
Agregue 75 microlitros de búfer de lisis a la paleta y vórtice durante cinco a 10 segundos. Añadir 500 microlitros de 0,5 tampón tris molar de 0,5 tampón tris molar con pH 6,8. Con pH 6.8.
Vórtice brevemente. Agregue 600 microlitros de metanol a la muestra. Vórtice durante cinco segundos.
Añadir 150 microlitros de cloroformo a la muestra. Vórtice durante cinco segundos. Centrífuga las muestras durante dos minutos a 12.000 G.Deseche cuidadosamente la opafa con un muestreador.
Agregue 600 microlitros de metanol a la muestra. Mezcle cuidadosamente invirtiendo el tubo varias veces. Muestras de centrífuga durante dos minutos a 12.000 G.Discard sobrenadante.
Seque el palet durante dos minutos a 80 grados. Disolver proteínas precipitadas en 60 microlitros del búfer de la muestra Laemmli. Caliente las muestras durante 10 minutos a 14 grados.
Causa el gel de poliacrilamida 17.5% Laemmli SDS. Cargue 15 microlitros de cada muestra en los bolsillos. Ejecute el gel en el cuarto frío hasta que el tinte azul alcance aproximadamente el 65% de la linfa de gel.
Manchar el gel con kumasi azul brillante y hacer escaneo o foto que se requiere como control de carga. Seque el gel en el secador de gel. Guárdalo en el cassette con pantalla de fósforo de almacenamiento durante tres a cinco días.
Escanee la pantalla en el imager de fósforo. Siguiendo el protocolo descrito anteriormente, asignamos productos de traducción mitocondrial de dos cepas saccharomyces cerevisiae. El tipo salvaje y la eliminación de variantes mutantes del gen Aim23 codifican el factor de iniciación de traducción mitocondrial tres.
Los productos de traducción mitocondrial ya estaban etiquetados activamente y separados en el gel de poliacrilamida desnaturalizado. Las muestras se recogieron cada dos minutos y medio antes de la saturación para construir el curso de tiempo. El gel fue manchado, seco y examinado después de la exposición de cinco días.
En el caso de un experimento exitoso, la imagen muestra ocho bandas asignadas de acuerdo con el patrón estándar. Sin embargo, las intensidades de las bandas individuales pueden ser altamente variables dependiendo de la tensión y las condiciones experimentales. Cada banda corresponde a un producto de traducción.
Los datos sugieren que la cepa mutante es capaz de síntesis de proteína mitocondrial porque todos los productos que aparecen en el tipo salvaje son visibles en este mutante. Sin embargo, las intensidades de las bandas son diferentes del tipo salvaje, lo que significa que esta eliminación de Aim23 afecta la expresión génica mitocondrial. Kumasi se elabora en mancha azul y sirve como control de carga.
Su resultado en datos se puede cuantificar para identificar diferencias entre cepas o condiciones experimentales utilizando el software Image G o Image Quan. Para estos, la relación de la señal correspondiente a cada producto se calcula a la señal total. Los valores medios y las desviaciones estándar se calculan en al menos tres experimentos independientes.
La cinética de la proteína sintetizada volteada se estudia en un experimento del año pasado. Las muestras se recogen en los puntos de tiempo indicados después de que la reacción de etiquetado se detiene por metionina fría y borymicina. Este control es necesario para estimar la estabilidad del producto.
La inmuno-tinción con anticuerpos Anti-Porin one es un control de carga. Describimos el método, que a menudo se utiliza para estudiar biosíntesis proteica en mitocondrias de levadura. Este protocolo es relativamente simple y rápido de realizar.
Al mismo tiempo, permite obtener información valiosa sobre la tasa de traducción de cuatro mRNAs mitocondriales de levadura, lo cual es altamente ventajoso. Sin embargo, tiene varias limitaciones que requieren experimentos adicionales y se encuentra en estos niveles interestatales de proteínas y mRNAs. Puede proporcionar la información sobre estas funciones en el sistema de traducción mitocondrial, pero se deben utilizar técnicas más avanzadas para descubrir el mecanismo.
