Agradecemos al profesor Hiraoka para el envío de las cepas. Reconocemos el apoyo de la Fundación Goran Gustafssons y la Sociedad Sueca del Cáncer (2008/939).

1. Cultura de la levadura de fisión <ol><li> Prepare Edimburgo Minimal los medios de comunicación (EMM) y EMM sin ​​ammoniumchloride (EMM-N) 8. Para reducir la autofluorescencia de la solución de glucosa no debe esterilizarse en autoclave, sino esterilizada por filtración usando un filtro de 0,2 micras y posteriormente se añadió a los medios de autoclave. </li><li> Inocular las células de la levadura de fisión recién cultivadas en una placa de agar con medios sofisticados, YEA 8, en 3 ml de EMM medio líquido con glucosa esterilizada filtro. Use tubos de 13ml con una ligera empujó en la tapa para asegurar una buena ventilación de las celdas. Deje que las células crecen por agitación con 225 rpm en 30 ° C. Mantener el crecimiento de las células en la fase de registro (1 x 10 6 - 2 x 10 7 células / ml) durante 2 días, contando ellos con una cámara de Burker seguido por dilución adecuada, todas las mañanas y por la tarde. </li><li> En el día del experimento, asegúrese de tener las células en la fase de registro temprano, 5 x 10 6 - 1 X 10 7 células / ml. </li><li> A morir de hambre tque las células de nitrógeno durante 20 minutos de cambiar los medios de comunicación EMM EMM-N los medios de comunicación. Esto se hace por la recolección de 3 ml de células en un tubo Eppendorf de 1,5 ml en una centrífuga de mesa superior al máximo de 1,5 fcr como la centrifugación a una velocidad mayor podría inducir una respuesta de estrés en la levadura de fisión 9. Utilice la técnica de doble giro, lo que significa; primera vuelta de 2 minutos, luego gire el tubo de Eppendorf de 180 ° y girar de nuevo a 1,5 fcr 2 min 10. Esto ayuda a mantener todas las celdas de una bolita en la parte inferior del tubo. Lavar una vez con EMM-N y luego disolver el precipitado en EMM-N e incubar las células durante 15 minutos a 30 ° C con agitación a 225 rpm y luego continuar con el punto 2. Preparación de la muestra. </li></ol> 2. Preparación de la muestra <ol><li> Cosecha de 1,5 ml de células en un tubo Eppendorf de 1,5 ml en una centrífuga de mesa superior al máximo de 1,5 fcr como la centrifugación a una velocidad mayor podría inducir una respuesta de estrés en la levadura de fisión 9. Utilice la técnica de doble giro, Meaning, primera spin durante 2 minutos, luego gire el tubo de Eppendorf de 180 ° y girar de nuevo a 1,5 rcf durante 2 min 10. Esto ayuda a mantener todas las celdas de una bolita en la parte inferior del tubo. </li><li> Eliminar el sobrenadante, pero dejan 10-15 l y resuspender las células en los medios restantes. Por otra parte añadir 10 l de medio fresco para resuspender el botón celular. </li><li> Asegúrese de tener las diapositivas de vidrio transparente y cubierta de vidrio (no 1.5). Normalmente, usted no tiene que limpiar, pero asegúrese de que no se llena de polvo. </li><li> Saca del congelador una parte alícuota de una solución de reserva de la lectina de 1mg/ml que ha sido esterilizada por filtración. La solución de lectina puede volver a congelar un par de veces. La lectina se utiliza para fijar las células de levadura en la cubierta de vidrio. </li><li> Coloque 5 l de EMM con glucosa esterilizada por filtración en el vaso objetivo. </li><li> Coloque 5 l de solución de lectina en la esquina de la cubierta de vidrio. Posteriormente el lugar 5 l de cultivo de células en la misma esquina, es decir, en la caída de la lectina. Mezclar con la pipeta un par de veces y luego se extendió el cultivo de células-lectina mezcla a lo largo de la cubierta de vidrio con el lado largo de la punta de la pipeta. Dependiendo de la densidad de la mezcla de células dejar todo o succionar el exceso de líquido en la esquina opuesta de la cubierta de vidrio. </li><li> Coloque la tapa de vidrio, hasta la parte superior, con una cara en el cristal del objetivo y el otro lado en el banco. Dejar que la cubierta de cristal se seque un poco durante unos minutos. No debe absolutamente estar completamente seca, pero no debe ser demasiado líquido en el vaso. </li><li> Coloque la tapa de vidrio con un Ángel · aproximadamente el 70 desde el cristal objetivo por la caída de la EMM. Dejar de lado la tapa de vidrio para que se caen de arriba hacia abajo en la caída de la EMM. </li><li> Para sellar los bordes con grasa de silicona preparar una jeringa de 2 ml. Cortar el extremo ancho de la punta de 200 l, y adjuntarlo a la jeringa. Llene la jeringa con aproximadamente 1 ml de grasa de silicona. Una línea muy fina de silicio se aplica a los bordes de la cubierta de vidrio suavemente pushing el émbolo de la jeringa. Ahora usted tiene una cámara de pequeño crecimiento de S. pombe células. </li></ol> 3. Microscopía <ol><li> Inicia el microscopio de fluorescencia mediante la activación de la lámpara de mercurio / xenon, el microscopio y la computadora. Coloque la cámara de crecimiento de la levadura en el microscopio de fluorescencia. Utilice un objetivo de 63 X o un objetivo X 100 con NA = 1.3 o superior. Si un objetivo se utiliza el aceite, añadir el aceite. </li><li> Utilice el campo luminoso de encontrar las células y obtener una imagen nítida. </li><li> La configuración de la microscopía de fluorescencia variar en función de los fluorocromos utilizados para identificar a las células de levadura y el microscopio. Nosotros usamos un microscopio confocal Zeiss LSM 700 microscopio de escaneo láser con 63x Plan-Apochromat lente objetiva de petróleo (NA = 1,4) con la de 16 líneas ajuste promedio de escaneo plano. El agujero se debe establecer en 1 a 1,1 unidades de Airy, lo que da una porción óptica de 0,8 mm. Detectamos las buenas prácticas agrarias en la pista 1 usando el conjunto de filtros para Alexa 488 con un divisor de haz de 582 nm, por lo tanto detecting longitudes de onda entre 488 y 582 nm. En la pista 2 se utiliza un conjunto de filtros óptimos para mCherry utilizando un divisor de haz a 578 nm, por lo tanto detectar longitudes de onda entre 578 nm y 600 nm. Esto significa que en la pista 2, tanto la mRFP (SPB) y NM (mCherry) será detectado. </li><li> Tome todas las imágenes que necesitan para ser capaces de medir en 60 células diferentes para cada cepa. Por lo general, 15 fotografías de los campos de la microscopía independientes son suficientes. Se recomienda que una cámara de crecimiento con células frescas se hace si el tiempo de microscopía supera los 60 minutos. </li></ol> 4. La medición cuantitativa de las distancias subcelular <ol><li> Abrir las imágenes en el programa Zeiss Zen Light Edition. Utilizando la herramienta de medida de las mediciones de la distancia en micras entre los fluorocromos diferentes en todas las células, donde todas las señales están en el mismo plano focal. Ajustar la intensidad de la luz y el contraste para identificar el centro de la señal fluorescente. Este protocolo simplificado sólo utiliza dos diferentes colours y por lo tanto el SPB y NM están en el mismo canal. El SPB se destaca por su gran estructura redonda en el NM. La transferencia de las distancias a una hoja de bloc de notas. Medida en al menos 60 células. Otros programas, como ImageJ también podría ser utilizado para medir la distancia, pero la luz Zeiss Zen es preferido debido a su mayor resolución de la imagen y la facilidad para acercar y alejar con ese programa. Las imágenes en formato lsm abrió sus puertas en ImageJ tendrá los dos canales en la parte superior de cada uno. Para hacer una foto con los dos canales, primero divide los dos canales, y posteriormente unirlos. A partir de entonces la herramienta de línea se puede utilizar para medir las distancias como se describió anteriormente. </li><li> Comparar las distancias subcelular media o la mediana entre las diferentes cepas y tratamientos con un programa estadístico, por ejemplo, t-test o prueba de Mann-Whitney rango suma, por ejemplo, utilizando el software SigmaStat-3.5. Con frecuencia los datos no se distribuyen normalmente, ya que habrá una selección de las células con una menordistancias entre las señales fluorescentes como todas las señales tienen que estar en el mismo plano focal a medir. Una t-test sólo se puede utilizar cuando los datos tiene una distribución normal, mientras que una prueba de Rango de Mann-Whitney suma permite la comparación de los conjuntos de datos que carecen de una distribución normal. En un t-test la media de dos diferentes conjuntos de datos se comparan, mientras que en una prueba de Rango de Mann-Whitney suma de la media se compara. </li></ol> 5. Resultados representante Tensión PJ1185: (h + + his7:: dis1placR - GFP chr1 [:: ura4 + hphMX6 laco] sid4-mRFP:: kanMX6 cut11-mCherry:: natMX6 ura4-D18-32 leu1 ade6-DN / N) se cultivó en EMM . Una muestra fue retirada y se monta en una cámara de crecimiento de la pequeña y se tomaron las fotografías (Fig. 1A + N). Posteriormente, el medio de cultivo fue reemplazado por EMM w / o ammoniumchloride (EMM-N), y las células se grown durante 15 minutos con agitación. Las células de nitrógeno hambre se montaron en una cámara de crecimiento con EMM-N y se tomaron las fotografías (Fig. 1A-N). La herramienta de medición se utilizó para medir la distancia entre el lugar (GFP) y el SPB (Fig. 1B y Tabla 1). Además, la distancia entre el lugar (GFP) y NM se midió (Fig. 1B y Tabla 2). Las distancias promedio subcelular antes y después del agotamiento de nitrógeno se compararon mediante la SigmaStat-3.5 del software (Tabla 3). Hubo un cambio estadísticamente significativo en la localización de la agrupación de genes en movimiento lejos de la NM hacia el PAS. Los datos de la medición de la distancia entre las buenas prácticas agrarias y la PAS había una distribución normal y por lo tanto las distancias medias (1.777 m + N y 1.587 m-N) se podría comparar con un t-test (Tabla 1 y 3). Hubo una diferencia significativa entre los dos valores medios (P = 0.008, t-test). Los datos de la medición de la distancia entre las buenas prácticas agrarias y NM no tenía una normal, distribution y por lo tanto las distancias promedio (0 m + N y 0,390 m-N) se compararon mediante la prueba de Rango de Mann-Whitney suma (Cuadro 2 y 3). Hubo una diferencia significativa entre los dos valores de la mediana (P &lt;0,001, Mann-Whitney suma de rangos). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454fig1.jpg" /> Figura 1. La localización de un grupo de genes llamado chr1, marcada por las buenas prácticas agrarias, cambió después de la muerte por inanición de nitrógeno. (A) en la columna izquierda, + N, núcleo de una célula de un representante de células cultivadas en la columna derecha EMM,-N, un representante del núcleo de la célula de una célula crece en EMM-N. El verde es la señal de las buenas prácticas agrarias de etiquetado del cluster chr1, el rojo es el mRFP mCherry y etiquetado del SPB y NM, respectivamente. (B) núcleo de la célula Igual que (A), pero ahora con las distancias medidas subnuclear, amarillo: el diámetro del núcleo de la célula, azul: la distancia entre el SPB y la señal de las buenas prácticas agrarias y de color rosa: la distancia entre la señal de las buenas prácticas agrarias y la membrana nuclear. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="Tabla 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1a.jpg" /> <img alt="Tabla 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1b.jpg" /> <img alt="Tabla 1" src="/files/ftp_upload/3454/3454table1c.jpg" /> Tabla 1. Las distancias medidas en micras subnuclear de la cepa PJ1185 crecido en EMM. Primera fila, el diámetro de la célula (d), segunda fila, la distancia entre las buenas prácticas agrarias y el SPB, la tercera fila, la distancia entre las buenas prácticas agrarias y el NM. <img alt="Tabla 2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2a.jpg" /> <img alt="Tabla 2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2b.jpg" /> <img alt="Tabla 2" src="/files/ftp_upload/3454/3454table2c.jpg" /> Tabla 2. Las distancias medidas en micras subnuclear de la cepa cultivada en PJ1185 EMM-N. Primera fila, el diámetro de la célula (d), segunda fila, la distancia entre las buenas prácticas agrarias y el SPB, la tercera fila, la distancia entre las buenas prácticas agrarias y el NM. <imgalt = &quot;Tabla 3&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3454/3454table3.jpg&quot; /&gt; Tabla 3. Estadística descriptiva de las distancias observadas subnuclear en la cepa PJ1185 antes (+ N) y después (-N) hambre de nitrógeno. Primera fila: el número de celular medida, de la segunda fila: el diámetro medio (d), tercera fila: diámetro medio (d), el cuarto consecutivo: la distancia media entre las buenas prácticas agrarias y el SPB, quinta fila: distancia media entre la GFP y NM.

<ol>
	<li>Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-802 (1994).</li><li>Robinett, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+localization+of+DNA+sequences+and+visualization+of+large-scale+chromatin+organization+using+lac+operator/repressor+recognition.">In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition.</a> J. Cell. Biol. 135, 1685-1685 (1996).</li><li>Bahler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+modules+for+efficient+and+versatile+PCR-based+gene+targeting+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe.</a> Yeast. 14, 943-943 (1998).</li><li>Asakawa, H., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+fluorescence+imaging+of+meiotic+chromosome+dynamics+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Live-cell fluorescence imaging of meiotic chromosome dynamics in Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods. Mol. Biol. 558, 53-53 (2009).</li><li>Alfredsson-Timmins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+chromatin+is+an+early+response+to+nitrogen+starvation+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Reorganization of chromatin is an early response to nitrogen starvation in Schizosaccharomyces pombe.</a> Chromosoma. 118, 99-99 (2009).</li><li>Kristell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+depletion+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe+causes+nucleosome+loss+in+both+promoters+and+coding+regions+of+activated+genes.">Nitrogen depletion in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe causes nucleosome loss in both promoters and coding regions of activated genes.</a> Genome. Res. 20, 361-361 (2010).</li><li>West, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cut11(+):+A+gene+required+for+cell+cycle-dependent+spindle+pole+body+anchoring+in+the+nuclear+envelope+and+bipolar+spindle+formation+in+Schizosaccharomyces+pombe.">cut11(+): A gene required for cell cycle-dependent spindle pole body anchoring in the nuclear envelope and bipolar spindle formation in Schizosaccharomyces pombe.</a> Mol. Biol. Cell. 9, 2839-2839 (1998).</li><li>Tomlin, G. C., Morrell, J. L., Gould, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+pole+body+protein+Cdc11p+links+Sid4p+to+the+fission+yeast+septation+initiation+network.">The spindle pole body protein Cdc11p links Sid4p to the fission yeast septation initiation network.</a> Mol. Biol. Cell. 13, 1203-1203 (2002).</li><li>Funabiki, H., Hagan, I., Uzawa, S., Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle-dependent+specific+positioning+and+clustering+of+centromeres+and+telomeres+in+fission+yeast.">Cell cycle-dependent specific positioning and clustering of centromeres and telomeres in fission yeast.</a> J. Cell. Biol. 121, 961-961 (1993).</li><li>Moreno, S., Klar, A., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+analysis+of+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods. Enzymol. 194, 795-795 (1991).</li><li>Soto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+of+centrifugation-induced+gravity+forces+through+mitogen-activated+protein+kinase+pathways+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe.">Transduction of centrifugation-induced gravity forces through mitogen-activated protein kinase pathways in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Microbiology. 153, 1519-1519 (2007).</li><li>Hagan, I. M., Ayscough, K. R., Allan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescence microscopy in yeast. , (2000).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+and+exploiting+the+fluorescent+protein+paintbox+(Nobel+Lecture).">Constructing and exploiting the fluorescent protein paintbox (Nobel Lecture).</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48, 5612-5612 (2009).</li><li>Mackay, D. R., Ullman, K. S., Rodesch, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Imaging+of+Mitosis+After+siRNA+Transfection.">Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection.</a> J. Vis. Exp. (40), e1878-e1878 (2010).</li></ol>

No tenemos nada que revelar.

Durante la última década el uso de imágenes de células vivas para controlar los eventos celulares se ha convertido cada vez más popular. Todo comenzó con el uso de proteína de fluorescencia verde de la medusa Aequorea victoria, y ahora muchos fluorocromos diferentes están disponibles emitir fluorescencia a través de un espectro amplio de cian (475 nm) a rojo lejano (648 nm) 11. Una de las principales ventajas de imágenes de células vivas por inmunofluorescencia es que las células no están fijadas por el formaldehído o el tratamiento con etanol / acetona antes de microscopía, evitando así posibles artefactos en el proceso de fijación. Además, imágenes de células vivas ofrece la posibilidad de seguir las células individuales y tomar fotos a intervalos frecuentes durante horas o días de incubación, lo que permite obtener películas de eventos celulares 12. Las células de mamíferos tienen la ventaja de tener un mayor tamaño, con diámetros de alrededor de 100 micras, en comparación con la célula de levadura más pequeños con un diámetro de alrededor de 3.4 ymu; m. Por otro lado, la ventaja con la levadura es el genoma fácilmente manipulable. La recombinación homóloga se produce de manera muy eficiente en la levadura y se utiliza para fusionar las proteínas de interés para diferentes fluorocromos 3. Por otra parte, mediante la integración específica de secuencias de Laco y posterior expresión de LACR-proteína GFP permite la detección de una parte específica del genoma en el núcleo de la célula 2. Con S. pombe células en la microscopía tiene ventajas adicionales, ya que son naturales los organismos unicelulares que crecen con un tiempo de generación rápida de bajo coste condiciones de cultivo celular. Por otra parte, S. pombe es un organismo eucariota modelo excelente ya que se ha metazoos genes homólogos. Una de las principales limitaciones de esta técnica es de autofluorescencia en la célula de levadura preocupante la detección de la señal real. Este problema se puede superar mediante el uso de medios mínimos de crecimiento con glucosa filtro en lugar de esterilizar en autoclave. EnAdemás de las células de la levadura debe ser cultivado durante 2 días en la fase de registro antes de su montaje. El protocolo que aquí se presenta ofrece un método relativamente simple, pero todavía cuantitativa para determinar la localización subcelular de las proteínas dentro de la célula de levadura. Además de tomar fotografías en diferentes momentos podemos seguir los eventos celulares.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / equipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentario </td></tr><tr><td> Lectina </td><td> Sigma </td><td> L1395 </td><td></td></tr><tr><td> Grasa de silicona </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscopio de barrido láser LSM 700 </td><td> Zeiss </td><td> LSM 700 </td><td> Microscopio confocal se podrían utilizar otros. </td></tr><tr><td> SigmaStat 3.5 </td><td> Statcon </td><td> SigmaStat 3.5 </td><td> Cualquier tipo de software para el análisis estadístico se podría utilizar. </td></tr></tbody></table>

quantitative live cell fluorescence-microscopy analysis of fission yeast

Varias técnicas de microscopia están disponibles hoy en día que pueden detectar una proteína específica dentro de la célula. Durante la última década imágenes de células vivas con fluorocromos como la proteína verde fluorescente (GFP) directamente unido a la proteína de interés se ha convertido en un cada vez más popular. Utilizando las buenas prácticas agrarias y fluorocromos similares las localizaciones subcelulares y los movimientos de las proteínas puede ser detectada en un microscopio de fluorescencia. Por otra parte, también la localización subnuclear de una determinada región de un cromosoma puede ser estudiado con esta técnica. GFP es fusionada con la proteína represor lac (LACR) y expresó ectópica en la celda en repeticiones en tándem de la secuencia de laco se ha insertado en la región de interés en el cromosoma 2. El LACR-GFP se unirá a las repeticiones de Laco y el área del genoma será visible como un punto verde en el microscopio de fluorescencia. La levadura es especialmente adecuado para este tipo de manipulación desde homólogarecombinación es muy eficiente, y permite así la integración específica de las repeticiones de Laco y proteínas de ingeniería de fusión con GFP 3. Aquí se describe un método cuantitativo para el análisis de células vivas de levadura de fisión. Protocolos adicionales para el análisis de células vivas de levadura de fisión se puede encontrar, por ejemplo sobre cómo hacer una película de los 4 comportamiento cromosómico meiótico. En este experimento en particular nos centramos en la organización subnuclear y cómo se ve afectada durante la inducción de genes. Hemos llamado a un grupo de genes, llamado chr1, por la introducción de sitios laco obligatorio en las proximidades de los genes. El grupo de genes se enriquece de los genes que se inducen durante la hambruna de principios de nitrógeno de la levadura de fisión 5. En la tensión de la membrana nuclear (NM) es marcado por la unión de mCherry a la proteína Cut11 NM dando lugar a una señal fluorescente de color rojo. El polo del eje corporal (SPB) compuesto Sid4 está fusionado a la proteína roja fluorescente (Sid4-mRFP) 6 </sa&gt;. En células de levadura crece vegetativamente los centrómeros van siempre unidas a las SPB que está incrustado en el NM 7. El SPB se identifica como una gran estructura redonda en el NM. Por imágenes de antes y 20 minutos después de agotamiento de la fuente de nitrógeno que puede determinar la distancia entre el grupo de genes (GFP) y el NM / SPB. La distancia media o la mediana, antes y después de agotamiento de nitrógeno se comparan y que podemos cuantificar si existe o no un cambio en la localización subcelular de la agrupación de genes después de la depleción de nitrógeno.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast at JoVE.com

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

La levadura de fisión,<em&gt; Schizosaccharomyces pombe</em&gt;, Es un sistema de buen modelo para estudiar los procesos celulares básicos. Aquí se describe un método para realizar el análisis cuantitativo de células vivas de levadura de fisión. En este experimento en particular nos centramos en la organización del genoma en el núcleo de la célula, pero el método también puede utilizarse para estudiar los factores citosólica.

Cuantitativa de células vivas por fluorescencia microscopia análisis de la levadura de fisión

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

quantitative-live-cell-fluorescence-microscopy-analysis-fission

Research

JoVE Journal

Biology

20.1K vistas.  University of Uppsala. La levadura de fisión, Schizosaccharomyces pombe, Es un sistema de buen modelo para estudiar los procesos celulares básicos. Aquí se describe un método para realizar el análisis cuantitativo de células vivas de levadura de fisión. En este experimento en particular nos centramos en la organización del genoma en el núcleo de la célula, pero el método también puede utilizarse para estudiar los factores citosólica.

Video: Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Time-lapse de imágenes de mitosis después de la transfección de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Investigación

Biología

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Células vivas, imágenes y análisis cuantitativo de las células epiteliales embrionarias en Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

Electrofusión de células visualiza con microscopía de fluorescencia

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Un ensayo de microscopía de fluorescencia para Mitophagy Vigilancia de la levadura Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is a complementary series of experimental and computational methods for estimating microbial culture fitnesses. QFA estimates the effect of genetic mutations, drugs or other applied treatments on microbe growth. Experiments scaling from focussed analysis of single cultures to thousands of parallel cultures can be designed.

Un flujo de trabajo de Análisis Cuantitativo Gimnasio

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Análisis cuantitativo de la autofagia mediante microscopía de fluorescencia avanzada 3D

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Análisis rápido y exploración de microscopía de fluorescencia de Imágenes

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Microscopía de la levadura de fisión del ciclo de vida sexual

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Aplicaciones de pHluorin para cuantitativa, cinética y de alto rendimiento Análisis de la endocitosis de levadura en ciernes

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and development. Cytokinesis involves a series of events that are well coordinated in time and space. Cytokinesis involves the formation of an actomyosin ring at the division site, followed by ring constriction, membrane furrow formation and extra cellular matrix remodeling. The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe (S.&#160;pombe)&#160;is a well-studied model system that has revealed with substantial clarity the initial events in cytokinesis. However, we do not understand clearly how different cytokinetic events are coordinated spatiotemporally. To determine this, one needs to analyze the different cytokinetic events in great details in both time and in space. Here we describe a microscopy approach to examine different cytokinetic events in live cells. With this approach it is possible to time different cytokinetic events and determine the time of recruitment of different proteins during cytokinesis. In addition, we describe protocols to compare protein localization, and distribution at the site of cell division. This is a basic protocol to study cytokinesis in fission yeast and can also be used for other yeasts and fungal systems.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe&#160;is an excellent model system to study cytokinesis, the final stage in cell division. Here we describe a microscopy approach to analyze different cytokinetic events in live fission yeast cells.

Análisis espacio-temporal de cytokinetic Eventos en la levadura de fisión

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...