Questo lavoro è stato sostenuto dal Consiglio di ricerca australiano di Grant DP0986937.

Scegliendo opportunamente ceppi di lievito di controllo Il test si basa sulla sperimentatore visivo valutare l&#39;accumulo di fluorescenza rossa nel vacuolo lievito. Come tale, il saggio è soggettiva e si basa sulla selezione di ceppi di controllo adeguate e condizioni di crescita. Un controllo wild-type è usato per indicare i livelli di autofagia normalmente previsto. Come controllo negativo un valore nullo sforzo per l&#39;espressione di uno dei geni del nucleo autofagia (ad esempio, ATG3) è idonea; tali ceppi non in grado di fornire materiale (ad esempio, mitocondri, nucleo) al vacuolo 1. Trasformazione di cellule di lievito con DNA plasmidico Cellule di lievito può essere fatto facilmente competente per la trasformazione trattando con LiAcetate. Kit commerciali possono essere acquistati (ad esempio, EasyComp, Invitrogen) e protocolli pubblicati sono disponibili 13. In questo protocollo usiamo ceppo wild type BY4741 (MAT uno his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0), e alcuni membri di una libreria completa di ceppi mutanti di eliminazione (ad esempio, Δ atg3) che ne derivano, manca ogni espressione di una diversa non essenziali del gene. La biblioteca ceppo cancellazione rappresenta uno strumento prezioso per indagare l&#39;autofagia con Rosella basato sonde. Il giornalista impiegato in questo protocollo è mt-Rosella per mitocondri (Fig. 2A), codificato dal pAS1NB: Rosella mt-12. I passi seguenti sono basate sull&#39;uso di cellule fatte competente utilizzando il kit di trasformazione EasyComp e conservati congelati a -80 ° C per uso conveniente. <ol><li> Equilibrare Solution III (EasyComp trasformazione Kit) a temperatura ambiente 30 minuti prima di aggiungere alle cellule di lievito. </li><li> Aggiungi 2-2,5 microlitri (~ 100 ng / mL) di DNA plasmide che codifica per il reporter (pAS1NB: mt-Rosella) ad una sterile 1,7 ml tappo a scatto tubo di plastica microcentrifuga. </li><li> Aggiungere 5 ml di sospensione appena scongelato competente di cellule di lievito e mescolare pipettando gentile. </li><li> Aggiungere 50 ml di soluzione III (EasyComp trasformazione Kit) e vortex per miscelare. 1.5) Incubare le reazioni di trasformazione per 1 ora a 28-30 ° C con forte mescolando ogni 15 minuti utilizzando un vortex o manualmente sfogliando il tubo con il dito. </li><li> Trasferire accuratamente l&#39;impasto trasformazione di una singola piastra YMM crescita agar integrato con istidina, metionina e uracile, e delicatamente distribuire le cellule attorno alla superficie di agar con una spatola di vetro sterile. Cellule di lievito sono fragili in questa fase delicata e la gestione può aumentare la resa di trasformanti. </li><li> Incubare le piastre di crescita per 2 a 4 giorni a 28-30 ° C o fino a quando le colonie appaiono circa 2-3 mm di diametro. </li></ol> 2. Confermando l&#39;espressione di Rosella in cellule di lievito Prima di intraprendere esperimenti dettagliata la localizzazione corretta ed efficace espressione di Rosella dovrebbe essere confermata. <ol><li> Utilizzando stuzzicadenti sterile selezionare per ogni singolo ceppo 5 colonie dalla piastra di trasformazione e risospendere le cellule in 50 ml di acqua sterile in separato sterile 1,7 ml tappo a scatto tubo di plastica microcentrifuga. </li><li> Introdurre 10 ml di ogni sospensione cellulare su vetrini separati etichettati microscopio (76 x 26 mm) e coprire la sospensione cellulare con un quadrato coprioggetto (22 x 22 mm). </li><li> Immediatamente esaminare le cellule per l&#39;emissione di fluorescenza utilizzando un microscopio a fluorescenza (per esempio, Olympus Fluoview FV500). Cercare una forte fluorescenza verde e rosso e l&#39;etichettatura tipiche di localizzazione mitocondriale (Fig. 2B e 2C). </li><li> Il resto di ogni colonia esaminato per fluorescenza in questo modo dovrebbe essere inoculato su un piatto fresco crescita YMM. </li><li> Incubare le piastre a 28-30 ° C per 2 giorni fino colonia sono di circa 2-3 mm di diametro. </li></ol> 3. La crescita delle cellule e l&#39;induzione di autofagia Autofagia può essere indotta con una serie di diverse condizioni sperimentali, tra cui l&#39;entrata in fase stazionaria, la trasformazione in fonte di carbonio, la somministrazione di rapamicina, o per fame di azoto. Noi abitualmente uso fame di azoto come metodo per indurre mitophagy. <ol><li> Inoculare una singola colonia in 10 ml di terreno di coltura contenente etanolo e gli integratori auxotrophic appropriato. </li><li> Incubare colture di lieviti a 28-30 ° C con agitazione orbitale (200 giri) per circa 48 ore. Le cellule devono essere a metà del log fase di crescita. </li><li> Cellule pellet da duplicare campioni 1 ml di cultura in tubi di plastica sterile 1,7 ml con tappo a scatto centrifuga per centrifugazione a 2.000 xg per 2 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere con cautela e scartare il sopranatante senza disturbare il pellet. </li><li> Lavare le cellule per tre volte con 1 ml di acqua distillata sterile da risospensione seguita da centrifugazione per rimuovere residui di medium. </li><li> Dopo il terzo lavaggio risospendere le cellule in 100 ml di terreno di coltura o di azoto fame medio. </li><li> Re-inoculare le cellule risospese in 10 ml di terreno di coltura fresco o 10 ml di azoto medio-fame. Incubare con agitazione orbitale per 6-12 ore per consentire l&#39;induzione di mitophagy. Dopo aver fame preparare le cellule per la visualizzazione al microscopio a fluorescenza. </li></ol> Nota: Etichettatura del vacuolo con CMAC-Arg La prima volta che istituisce il test è utile per confermare la consegna sotto microscopio a fluorescenza di Rosella al vacuolo. Anche se il lievito vacuolo è un organulo di grandi dimensioni la cui ubicazione spesso può essere facilmente valutata in relazione alla trasmissione delle immagini della luce, in alcuni ceppi di lieviti e in alcune condizioni di crescita del vacuolo può essere frammentato e difficile da individuare. Il vacuolo può essere facilmente etichettato con un cumarina a base dye vacuolo come CMAC-Arg (7-ammino-4-chloromethylcoumarin, L-arginina amide). L&#39;azione della proteasi vacuolari sui risultati tintura in blu brillante etichettatura fluorescenza del vacuolo. L&#39;emissione blu possono essere facilmente distinguibili dalle emissioni di rosso e verde di Rosella 11. Etichettatura con CMAC-Arg non ha bisogno di essere eseguita di routine, ma è consigliato per coloro che non hanno familiarità con la posizione e l&#39;aspetto del vacuolo nel lievito. 4. L&#39;etichettatura del vacuolo con CMAC-Arg <ol><li> Aggiungere il CMAC-Arg (100 concentrazione mM finale) di cellule in crescita o azoto fame prima di imaging. Il CMAC-Arg soluzione può essere preparata in anticipo, ma la soluzione è sensibile alla luce ha bisogno di essere protetti dall&#39;esposizione alla luce. </li><li> Incubare a 28-30 ° C con agitazione orbitale (200 rpm) per 30 minuti. </li><li> Cellule pellet per centrifugazione a 2.000 xg per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Scartare il surnatante. </li><li> Lavare le cellule tre volte con acqua distillata sterile da risospensione seguita da centrifugazione per rimuovere residui di medie e superiori CMAC-Arg colorante. </li><li> Montare le cellule per l&#39;imaging come descritto di seguito. </li></ol> 5. Montaggio cellule di lievito vivo per la microscopia confocale a scansione laser (CLSM) <ol><li> Sciogliete 2 mg di agarosio a basso punto di fusione in separati 1 ml di mezzo di crescita e di azoto fame medio di incubazione a 70 ° C. Il fuso agarosio è mantenuta a 70 ° C. </li><li> Delicatamente il pellet di cellule in 1 ml di ciascuna coltura cellulare per centrifugazione a 2.000 xg per 2 minuti a temperatura ambiente e scartare il surnatante. </li><li> Lavare le cellule per tre volte con 1 ml di acqua distillata sterile da risospensione e centrifugazione, come al punto 5.2. </li><li> Risospendere le cellule lavate in 100 ml di acqua distillata sterile. </li><li> Per montare il posto celle 20 l di fuso agarosio su un vetrino da microscopio etichettati di vetro (76 x 26 mm). </li><li> Immediatamente posto 10 ml di sospensione cellulare lavato sul letto di agarosio. </li><li> Coprite il letto di agarosio con un coprioggetto (22 x 22 mm). Le cellule si diffonderà su tutta la superficie agarosio sotto il vetrino. </li><li> Per prevenire la disidratazione e il movimento del coprioggetto durante l&#39;imaging con attenzione sigillare i bordi del coprioggetto con un sottile strato di smalto. </li><li> Quando lo smalto è completamente asciutto (10 min) il vetrino è pronto a vista da Attenzione microscopia a fluorescenza: smalto per unghie può causare danni agli obiettivi microscopio. </li><li> Celle montate con questa tecnica si possono osservare fino a 1 ora dopo il montaggio. </li></ol> 6. Autofagia visualizzare utilizzando CLSM Il livello di autofagia in una popolazione di cellule è regolarmente valutato determinando il numero di cellule che mostrano fluorescenza rossa vacuolare prima e dopo l&#39;induzione di autofagia. Idealmente la progressione della autofagia è monitorato in momenti selezionati a seguito di induzione di autofagia (Fig. 3). Questo è il miglior eseguita da visualizzare attraverso il microscopio binoculare. E &#39;importante che i controlli corretti sono impiegati (ad esempio, Δ atg3 mutanti) e che le impostazioni microscopio rimangono invariate tra l&#39;osservazione di campioni diversi (ad esempio, l&#39;uso di filtri a densità neutra, selezione del filtro). Cellule di lievito sono relativamente piccole che richiedono un buon microscopio a fluorescenza di qualità (ad esempio, Olympus Fluoview FV500) dotato di eccitazione / emissione di appositi filtri per la visualizzazione separata di GFP e / o pHluorin (emissione di fluorescenza verde) (FITC filtro) e DsRed.T3 (rosso emissione di fluorescenza) (TRITC filtro). <ol><li> Utilizzando un obiettivo 60x vista l&#39;acqua non morire di fame le cellule wild-type utilizzando alternativamente i filtri FITC e TRITC. Cellule wild-type dovrebbe mostrare una distribuzione tipica dei mitocondri cellulari alla periferia delle cellule che mostrano sia la fluorescenza rossa e verde. Si noti che questa distribuzione dei mitocondri dipende dalla Pinhole regolazione del microscopio confocale. Noi di solito utilizzare un valore inferiore a foro stenopeico di 125 micron, che consente solo i mitocondri da osservare come una serie di punti localizzati alla periferia della cellula (Fig. 2C) in modo che il vacuolo non è oscurata 12. Se un valore alto di foro stenopeico (200 micron) viene usato questo permette la tipica rete filamentosa mitocondriale distribuiti in tutta la cella (e le modifiche che subisce), da osservare 11. Nessun altre strutture nella cella deve essere fluorescente. </li><li> Sequenzialmente vista cellule per ciascuno dei punti di tempo dopo il trasferimento a medio fame. Visualizzare alternativamente usando i filtri emissione verde e rosso. Alla fame 6 fluorescenza tempo h punto rosso, ma nessuna emissione corrispondenti verde dovrebbe essere distinguibili nel vacuolo. Localizzazione vacuolare possono essere separatamente confermata usando CMAC-Arg (Fig. 2C). Vista ~ 200 celle e contare il numero che mostrano solo fluorescenza rossa nel vacuolo (assorbimento cioè vacuolare dei mitocondri). </li><li> Conte accumulo vacuolare per tutti i punti tempo di osservazione&gt; 200 celle e poi trama percentuale di cellule che mostrano accumulo vacuolare. </li><li> Esaminare l&#39;autofagia-negativi cellule di controllo che esprimono mt-Rosella prima di morire di fame e di inedia dopo 6 ore. </li></ol> 7. Rappresentante dei risultati: Qui vi mostriamo i risultati tipici ottenuti con mt-Rosella, espresso in wild-type e Δatg3 cellule mutanti. In condizioni di crescita con l&#39;etanolo come fonte di carbonio, sia di tipo selvatico e Δatg3 cellule mutanti mostrano una distribuzione cellulare di fluorescenza (rosso e verde) tipico dei mitocondri nelle cellule di lievito. Rosso e verde emissione di fluorescenza non viene rilevata nel vacuolo (Fig. 2B e 2C). Quando sono sottoposti a fame di azoto per 6 ore e poi di là, oltre a fluorescenza rossa e verde corrispondente ai mitocondri, le cellule di tipo selvatico mostrano anche l&#39;accumulo di rosso, ma non fluorescenza verde nel lume vacuolare (Fig. 2B;. Fig. 3) . Tuttavia, in Δatg3 cellule mutanti fluorescenza né rosso né verde si accumula nel lume vacuolare (Fig. 2C;. Fig. 3). <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Top, schema di organelli e compartimenti in una cellula di lievito. In basso, un vacuolo-centric vista di una cellula di lievito è presentato indicando il degrado autofagici di organelli diversi scomparti. Alcune delle differenze tra i vari organelli specifici tipi di autofagia (ad esempio, mitophagy, nucleophagy) includono la specificità (selezione carico) dei contenuti inghiottito, varie esigenze intracellulari e segnali extracellulari (ad esempio, la fame, danni), segnali specifici, ATG geni e la dipendenza del tempo. <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2a.jpg" alt="Figura 2a" /> <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2b.jpg" alt="Figura 2b" /> <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2c.jpg" alt="Figura 2c" /> <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2d.jpg" alt="Figura 2d" /> Figura 2. (A) Rappresentazione schematica di mt-Rosella. La sequenza capo mitocondriale (in questo caso di citrato sintasi) è utilizzato per indirizzare il biosensore Rosella alla matrice mitocondriale. Eccitazione ed emissione massimi per entrambi proteina fluorescente rossa (DsRed.T3) e proteina fluorescente verde (pHluorin) sono indicati. A pH elevato (mitocondriale pH ~ 8.2) il biosensore fluorescente rosse e verdi, invece, a basso pH (pH vacuolare ~ 5,5) è solo rosso fluorescente. (B) Rappresentazione schematica dei risultati attesi nel wild-type e Δ atg3 cellule mutanti che esprimono mt-Rosella. (C) I risultati effettivi ottenuti CLSM per le cellule di tipo selvatico in crescita e le condizioni di fame di azoto. Da sinistra a destra:. DIC (differenza di contrasto), RFP (DsRed.T3) emissione di fluorescenza, GFP (pHluorin) emissione di fluorescenza, CMAC-Arg fluorescenza e immagine si fondono (D) I risultati effettivi ottenuti al microscopio a fluorescenza per Datg3 cellule mutanti sotto in crescita e le condizioni di fame di azoto. Da sinistra a destra: DIC (differenza di contrasto), RFP (DsRed.T3) emissione di fluorescenza, GFP (pHluorin) emissione di fluorescenza, CMAC-Arg fluorescenza e immagine si fondono. <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. La percentuale di wild-type e Δ atg3 cellule mutanti, esprimendo mt-Rosella e cresciuti sotto la fame di azoto, che mostra fluorescenza rossa nel vacuolo per un durata di 48 ore. La percentuale di cellule che mostrano accumulo di fluorescenza rossa nel vacuolo è stato registrato a 0, 6, 12, 24 e 48 ore dopo l&#39;inizio fame di azoto.

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	<li>Levine, B., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+the+pathogenesis+of+disease.">Autophagy in the pathogenesis of disease.</a> Cell. 132, 27-42 (2008).</li><li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion.">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li><li>He, C., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+mechanisms+and+signaling+pathways+of+autophagy.">Regulation mechanisms and signaling pathways of autophagy.</a> Annu. Rev. Genet. 43, 67-93 (2009).</li><li>Kroemer, G., Mari&#241;o, G., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+the+integrated+stress+response.">Autophagy and the integrated stress response.</a> Mol Cell. 40, 280-293 (2010).</li><li>Camougrand, N., Kissov&#225;, I., Salin, B., Devenish, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+mitophagy+in+yeast.">Monitoring mitophagy in yeast.</a> Methods Enzymol. 451, 89-107 (2008).</li><li>Yen, W. L., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+live+long+and+prosper:+autophagy,+mitochondria,+and+aging.">How to live long and prosper: autophagy, mitochondria, and aging.</a> Physiology (Bethesda). 23, 248-262 (2008).</li><li>Tolkovsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy.">Mitophagy.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1793, 1508-1515 (2009).</li><li>Bhatia-Kissov&#225;, I., Camougrand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy+in+yeast:+actors+and+physiological+roles.">Mitophagy in yeast: actors and physiological roles.</a> FEMS Yeast Res. 10, 1023-1034 (2010).</li><li>Kanki, T., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanism+of+mitochondria+autophagy+in+yeast.">The molecular mechanism of mitochondria autophagy in yeast.</a> Mol. Microbiol. 75, 795-800 (2010).</li><li>Nowikovsky, K., Reipert, S., Devenish, R. J., Schweyen, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mdm38+protein+depletion+causes+loss+of+mitochondrial+K+/H++exchange+activity,+osmotic+swelling+and+mitophagy.">Mdm38 protein depletion causes loss of mitochondrial K+/H+ exchange activity, osmotic swelling and mitophagy.</a> Cell Death Differ. 14, 1647-1656 (2007).</li><li>Devenish, R. J., Prescott, M., Turcic, K., Mijaljica, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+organelle+turnover+in+yeast+using+fluorescent+protein+tags.">Monitoring organelle turnover in yeast using fluorescent protein tags.</a> Methods Enzymol. 451, 109-131 (2008).</li><li>Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosella:+a+fluorescent+pH-biosensor+for+reporting+vacuolar+turnover+of+cytosol+and+organelles+in+yeast.">Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast.</a> Autophagy. 4, 205-213 (2008).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate/single-stranded+carrier+DNA/polyethylene+glycol+method.">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods Enzymol. 350, 87-96 (2002).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Nelle immagini rappresentative presentato in fig. 2B e 2C si può chiaramente vedere che l&#39;uso di reporter fluorescenti organelli specifici e microscopia a fluorescenza fornisce la prova di localizzazione mitocondriale / distribuzione sia in crescita e di azoto a corto di cellule, e permette mitophagy da visualizzare. E &#39;da sottolineare che questo metodo non si limita a mitophagy seguente. Autofagia di altri componenti cellulari o organelli (ad esempio, i ribosomi, gocce lipidiche, perossisomi, reticolo endoplasmatico e nucleo) possono essere monitorati con un&#39;adeguata etichettatura. Dettagli del costrutto biosensore Rosella, condizioni di coltura cellulare e risultati tipici per il fatturato del nucleo (nucleophagy) sono stati segnalati 11,12 illustrano la più ampia applicazione del metodo. L&#39;uso di giornalisti fluorescenti organello specifico per l&#39;autofagia monitoraggio richiede diverse considerazioni di design costruire da tenere in mente. Questi includono: (1) la selezione e la fusione al segnale appropriato targeting per raggiungere organello-specifici mirati, (2) selezione di una proteina fluorescente adatto (s), (3) forte emissione di fluorescenza, (4) corretta localizzazione degli organelli e / o distribuzione all&#39;interno della cellula. Una volta che l&#39;organello specifico giornalista è stata espressa con successo nel paese ospitante ceppo di lievito selezionato un secondo gruppo di considerazioni diventano: (1) le condizioni di crescita del lievito, (2) preparazione dei campioni di cellule, (3) i parametri di imaging, come è importante che i parametri selezionati per CLSM (ad esempio, l&#39;intensità del laser, frequenza e la modalità, il valore foro stenopeico, valore di zoom, obiettivi utilizzati o di esposizione per i CCD-camera) sono mantenuti per tutto un esperimento garantire che possano essere effettuati raffronti tra il controllo (cellule in crescita) e di campioni affamati; ( 3) induzione autofagia e di successo la consegna del giornalista nel vacuolo. In generale, questo metodo di microscopia a fluorescenza è facile, relativamente veloce, e ha potenziale applicazione per lo screening ad alto rendimento per i nuovi farmaci che migliorano o inibire l&#39;autofagia, e anche per i geni che regolano o modulano l&#39;autofagia.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente / attrezzature </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> Saccharomyces cerevisiae EasyComp Kit di trasformazione </td><td> Invitrogen </td><td> K5050-01 </td></tr><tr><td> Lievito di base di azoto, senza aminoacidi e solfato di ammonio </td><td> BD Difco </td><td> 200-0030 </td></tr><tr><td> Basso punto di fusione agarosio </td><td> Progen Biosciences </td><td> 200-0030 </td></tr><tr><td> Vetrini da microscopio (76 x 26 mm) </td><td> Menzel-Glaser </td><td></td></tr><tr><td> Coprioggetto microscopio (22 x 22 mm) </td><td> Menzel-Glaser </td><td> BB022022A1 </td></tr><tr><td> Microscopio confocale a scansione laser Fluoview FV500 </td><td> Olimpo </td><td></td></tr><tr><td> CMAC-Arg </td><td> Moleular Sonde-Invitrogen </td><td> Y-7531 </td></tr></tbody></table> Tutte le concentrazioni sono dato w / v, salvo diversa indicazione. Lievito terreno minimo (YMM): 0,67% di base di azoto, senza lievito aminoacidi, glucosio al 2%, 1,5% agar (aggiunto solo quando si effettua mezzi solidi) e eventuali supplementi richiesti auxotrophic (0,01%)]. Sali cerevisiae (SS): (NH 4) 2 S0 4, 0,12%; KH 2 PO 4, 0,10%; MgC1 2 .6 H2O, 0,07%; NaC1, 0,05%; CaCl2, 0,01%; FeC1 3, 0,0005%. Crescita media: SS e 2% di etanolo (v / v) e integratori auxotrophic appropriato. Azoto fame medio: 0,17% di base di azoto, senza lievito aminoacidi e solfato di ammonio (Difco), 2% di etanolo (v / v).

a fluorescence microscopy assay for monitoring mitophagy in the yeast saccharomyces cerevisiae

L&#39;autofagia è importante per un fatturato di componenti cellulari sotto una serie di condizioni diverse. Serve una funzione essenziale omeostatica, nonché un meccanismo di controllo di qualità che può avere come bersaglio e di degradare selettivamente materiale cellulare tra cui organelles1-4. Per esempio, danneggiati o ridondanti mitocondri (Fig. 1), non smaltiti mediante autofagia, può rappresentare una minaccia per l&#39;omeostasi cellulare e la sopravvivenza cellulare. Nel lievito, Saccharomyces cerevisiae, la privazione di nutrienti (ad esempio, la fame di azoto) o danni possono promuovere fatturato selettiva dei mitocondri da autofagia in un processo chiamato mitophagy 5-9. Descriviamo un approccio semplice microscopio a fluorescenza per valutare l&#39;autofagia. Per maggiore chiarezza limitiamo la nostra descrizione qui per mostrare come l&#39;approccio può essere utilizzato per monitorare mitophagy in cellule di lievito. Il saggio si avvale di un reporter fluorescente, Rosella, che è un dual-emissioni biosensore che comprende un pH relativamente stabile proteina fluorescente rossa legata ad una sensibile al pH proteina verde fluorescente. Il funzionamento di questo giornalista si basa sulle differenze di pH tra i (pH ~ 5,0-5,5) e vacuolo mitocondri (pH ~ 8.2) nelle cellule viventi. In condizioni di crescita, le cellule di tipo selvatico presentano sia fluorescenza rossa e verde, distribuito in una caratteristica forma dei mitocondri. Emissione di fluorescenza non è associato con il vacuolo. Quando sono sottoposti a fame di azoto, una condizione che induce mitophagy, oltre a fluorescenza rossa e verde etichettatura dei mitocondri, le cellule mostrano l&#39;accumulo di rosso, ma non fluorescenza verde, nel lume acido vacuolare che rappresenta la consegna dei mitocondri al vacuolo. Segnando le cellule con il rosso, ma vacuoli fluorescente verde non può essere utilizzata come una misura di attività mitophagic nelle cellule 5,10-12.

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A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Un valido approccio per monitorare la fornitura dei organelli al lume acida del vacuolo lievito per il degrado e il riciclaggio è descritto. Il metodo si basa sulla etichettatura specifica di organelli bersaglio geneticamente codificato con un dual-emissione di fluorescenza pH biosensore, e la visualizzazione delle singole cellule mediante microscopia a fluorescenza.

Un saggio microscopia a fluorescenza per Mitophagy monitoraggio nel lievito Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

25.4K Views.  Monash University. Un valido approccio per monitorare la fornitura dei organelli al lume acida del vacuolo lievito per il degrado e il riciclaggio è descritto. Il metodo si basa sulla etichettatura specifica di organelli bersaglio geneticamente codificato con un dual-emissione di fluorescenza pH biosensore, e la visualizzazione delle singole cellule mediante microscopia a fluorescenza.

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Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Dissezione di Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

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Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Fosfoproteomica quantitativa in acidi grassi Stimolati Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Time-lapse imaging di mitosi dopo la trasfezione di siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray analisi per Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitativa vivo cellulare-microscopio a fluorescenza Analisi di lievito Fission

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

A lungo termine del test di tossicità letale con il crostaceo Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Espressione e purificazione della proteina transmembrana cistica regolatore fibrosi conduttanza in Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualizzazione e l&#39;analisi di molecole di mRNA mediante fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Saggi accoppiati per il monitoraggio delle proteine ​​in ripiegamento<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.