이 연구는 CCSRI 부여 # 700537 및 CIHR 부여 JDL 및 NIH / NCI 부여 # CA120711 - 01A1 및 AZ로 CA120711 - 01A1에 # 84535에 의해 지원되었다. 모든 실험은 규정 및 기관 애니멀 케어의 지침에 따라 수행하고 캘리포니아 샌디에고 애니멀 케어 대학에서위원회를 사용하고 웨스턴 온타리오 대학에서 사용되었다.

1. 조류 배아 CAM로 ​​종양의 접종 <ol><li> 8 설명된대로 쉘 - 덜 수정된 닭 배아를 준비합니다. </li><li> 배아 발달의 날 9 일, 1 ML 주사기에 연결된 18 게이지 바늘을 사용하여 마이크로 인젝터 조립. Tygon 튜빙 (1 / 32 &quot;내부 직경 32분의 3&quot;외경, 1 / 32 &quot;벽 두께)의 5-6인치 기사를 잘라 조심스럽게 튜브로 바늘의 베벨를 삽입합니다. 튜브의 약 4-5인치해야 바늘의 끝 (그림 1A)에서 연장. </li><li> 세포 현탁액과 주사기와 튜브를 입력합니다. 그런 다음 튜브의 끝에 microinjection 유리 바늘을 삽입하고 신중하게 모든 공기 방울을 제거하십시오. </li><li> CAM (그림 1C) 내에서 볼러스로 10,000-100,000 암세포와 조명기와 절개 범위에 따라 하루에 9 배아 (그림 1B)을 주사. 천천히 세포를 주입하고 조심스럽게 바늘이 CAM 내에서 볼 수 볼러스를 형성하는 세포에 대한 올바른 위치에 있는지 확인합니다. CAM 표면에 드립이 Kimwipe 또는 기타 작은 주걱을 사용하여 청소 수 있습니다 셀. </li><li> 60 % 습도에서 38 ° C에서 humidified 배양기로 배아를 반환하고 성장하고 vascularize (최대 7 일)에 종양 수 있습니다. </li></ol> 2. nanoparticles의 준비 <ol><li> 닭 배아에 주입에 대한 찬란 표시 CPMV의 nanoparticles을 준비한다. 바이러스 nanoparticles를 (물론 어떤을 제거 한 분만을 사용하고 원심 분리기 전에 100 μg / ML 소용돌이 혼합물의 농도로 PBS, pH를 7.4에서 8로 합성된 희석 합산. Sonication도 conjugates 및 집계의 정도에 따라 유용할 수 있습니다. 4 저장할 때 찬란 분류 CPMVs의 주식이 최소한 1 년 동안 안정 ° 어둠 속에서 C. 몇 넣어 주기적으로 주식을 체크 유리 슬라이드에 방울과 형광 검사. 전송 ​​전자 현미경 (TEM)이 또한 입자가 결합 후 그대로 남아 있는지 확인하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 간단히, 바이러스 nanoparticles 중 1 마이크로 그램은 (2 μl의 최종 볼륨)을 구리 코팅 격자에 추가할 수 있습니다. 다음 전자 현미경에서 일분 (필립스 EM 410)에 대한 2 % uranyl 아세테이트의 동일한 볼륨을 추가합니다. </li></ol> 3. 찬란 - 라벨 바이러스 nanoparticles의 정맥 주사 <ol><li> 주 16, 위에서 설명한 것처럼 마이크로 인젝터 조립. 주사기에 튜브 (&gt; 200 μL)를 통해 바이러스 nanoparticle의 원하는 볼륨을 그립니다. 조심스럽게 모든 기포를 제거합니다. 튜브의 끝에 microinjection 유리 바늘을 삽입합니다. 바늘과 같이 길고 (그림 2A) 가능한 테이퍼 있는지 확인하십시오. 바늘이 너무 무딘 경우, 그것은 ectoderm 통해 피어스 수 없게됩니다하고 선박에 침투 실패합니다. 바늘이 너무 선명 경우 조직을 관통하면 도움말이 붕괴됩니다. </li><li> 정맥 (그림 3D) 시각으로 원하는 사이트에서 말초 종양 베어링 배아로 1 MG / ML 플루오레신 dextran (MW 70,000 다, Invitrogen) 100 μl를 주입. CAM의 정맥의 성공 cannulation은 사출 흐름의 경로에있는 혈액의 비운 (그림 2B)에 의해 분명하다. 주사 후 혈관 누출 1 시간 평가합니다. </li><li> 정맥으로 원하는 사이트에서 말초 혈관 누출과 함께 종양을 포함하는 배아로 1 MG / CPMV - 알렉사 플루어 647 (CPMV - AF 647) 또는 PEGylated CPMV - 알렉사 플루어 647 (CPMV - PEG - AF 647)의 ML 솔루션의 50 μl를 주입 시각 수 있습니다. </li><li> 이미지 즉시 종양과 요코가 회전 디스크, 하마 마츠 ImagEM 9100-12 EM - CCD 카메라가 장착되어 자이스 혈구 심사관 Z1 똑바로 현미경을 사용하여 주사 후 매 시간마다. </li></ol> 4. 실시간 intravital 이미징 <ol><li> 배아 이미징 장치를 조립하려면 배아 이미징 장치의 뚜껑의 아래쪽에있는 이미징 포트의 둘레 주위에 진공 그리스의 얇은 레이어를 적용하고, 항구에 18mm 유리 coverslip을 맞습니다. </li><li> coverslip이 이미지에 원하는 영역을 다룰 것입니다 그러한 배아를 놓습니다. 천천히 coverslip 그냥 배아와 접촉하게 때까지 뚜껑을 낮게하고 (그림 2C) 제자리에 고정하는 장치로 뚜껑을 나사. </li><li> ° C 배아가 들어있는 요리 이외의 배아 이미징 장치에 37 가열 물을 추가하고 37 equilibrated 안쪽 환경 챔버 ° C.와 직립 공촛점 현미경의 무대에 전체 단위를 장소 </li><li> 스피닝 디스크 공촛점 형광 현미경 (그림 2E)에서 배아를 포함하는 위치 이미징 장치. 이미징 장치 캡처하는 입체 Z 스택 및 시간 경과 이미지 모두 수 있도록 장소에서 배아를 잡고 이미지를 캡처하는 동안 고정 볼 분야를 유지합니다. 우리는 취득 및 퍼어킨 엘머의 (이전 순발력) Volocity 소프트웨어 패키지 (그림 3A)를 사용하여 입체 시간 경과 이미지를 분석합니다. 종양의 세 차원 스택 높은 해상도와 detaile 시각화하는 주변 vasculature을 습득특정 시간 지점에서 D 구조 분석합니다. 종양 vasculature에 설명된 구조적 변화를지도하기 위해 정기적으로 시간이 지점에서 세 차원 스택을 습득. 주사 후 이미지 종양 시간마다. </li><li> 평균 알렉사 플루어 (AF) 종양이나 같은 Volocity 같은 기질 (비 종양 영역)를 사용하여 이미지 quantitation 소프트웨어 (퍼어킨 엘머)에서 선택한 지역 내에서 647 신호를 계산하여 바이러스 nanoparticles의 이해를 Quantitate. 기질 비율 종양은 기질의 의미 AF 647 신호를 통해 종양의 의미 AF 647 신호를 나누어 계산했습니다. 하나 이상의 종양 / 기질 비율은 nanoparticle이 종양에 의해 촬영되고있다는 것을 나타냅니다. </li></ol> 5. 대표 결과 : 예를 들어 여기에서 설명한, 우리는 일 9 닭 배아 (그림 1B)의 CAM 내에서 크기 볼러스 약 1mm를 형성 HT - 29 결장암 세포를 주입했다. 접종 후 태아는 충분한 종양의 성장과 vascularization (그림 1C)을 허용 humidified 배양기에서 7 일 동안 교양되었습니다. 배아는 종양 vascularization 확인을 낮은 분자량 dextran과 정맥 주입 있었고, 종양은 자이스 혈구 AxioExaminer Z1 직립 현미경 (그림 2D)에서 시각되었습니다. CPMV - AF 647 또는 CPMV - PEG - AF 647 nanoparticles의 정맥 주사 관리 후 (그림 3A와 B), 고해상도 실시간 공촛점 이미징 (그림 2E)은 CPMV 및 CPMV - PEG 모두 빠른 속도로 전체 vasculature 라벨 nanoparticles 것으로 밝혀지만, 종양에 의해 CPMV - PEG의 이해 12 시간 (그림 3A) 이후 CPMV보다 약 3 배 이상되었다. nanoparticles의 상대 종양의 이해는 이미지 분석 소프트웨어 (퍼어킨 엘머에서 Volocity)를 사용하여 결정되었다. 관심 지역은 종양 내외 선정 (stromal 구획) 및 각각의 의미 형광 강도가 결정되었습니다. 데이터는 종양 / 기질 비율로 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2808/2808fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. 조류 배아의 CAM에 종양의 Microinjection. 표시된으로 ​​(A) microinjection 장치는 구성 요소에서 조립합니다. (B) 일 9시 조류 배아는 CAM의 전체 표면을 커버하기 위해 확산되면 종양에 주사 준비하고 있습니다. (C) 16 일, 종양이 직경 1cm (점선)까지로 성장하고 nanoparticles와 함께 주입 준비가됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2808/2808fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. Nanoparticle 주입 및 intravital 영상. 보여주는 해부 현미경 아래에 주입 (A) 캠 정맥에 주입되어야하고 (B) microinjector 바늘은 혈액 흐름에 주입 nanoparticles 정맥에 삽입 (화살표로 표시)와 준비 microinjector 바늘의 끝 (취소하여 본 혈액). (C) 이미징 유닛은 CAM과 직접 인터페이스 coverslip와 조류 배아를 포함. (D) nanoparticle 주입하기 전에, 종양 vascularization는 플루오레신 dextran의 주입 후 intravital 이미징을 사용하여 평가됩니다. (E) 이미징 장치는 37 ° C.에 온도 조절 인클로저 세트 내에서 직립 공촛점 현미경의 무대에 위치 배아를 포함하는 <img src="/files/ftp_upload/2808/2808fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. 인간의 종양에서 nanoparticle의 이해의 Intravital 시각화. 종양 7 시간 (A) CPMV - AF647 및 (b) CPMV - PEG - AF647의 주사 후 시각입니다. 후속 분석을 위해 조류 배아에서 종양의 D) 절단.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

조류 배아의 chorioallantoic 막 (CAM)은 혈관 역학과 인간 종양의 pharmacokinetics을 평가하는 유용한 모델입니다. CAM의 구조와 위치는 고품질 이미지 수집을 허용 및 침입 수술 절차없이 암 xenografts 여러 가지 숙박이 가능합니다. 또한, 암 종양의 xenografts는 종양 조직의 nanoparticles의 축적을 평가하기 위해 신속, 저렴한과 준결승 높은 처리량 방법을 제공, 7 일 이내 vascularized 될 chorioallantoic 멤브레인에 심어. 쉘 적은 닭 배아의 CAM에 이식 암 xenografts는 종양 vasculature에 nanoparticle의 이해에 관한 직립 epifluorescence 또는 공촛점 현미경, 문맥과 시간적 정보의 고해상도 광학에 액세스할 수 있기 때문에 쉽게 구할 수 있습니다. 이 모델에서 암 xenografts은 깊이 미만 200m를 유지하면서 큰 종양의 결과로, CAM에 걸쳐 옆으로 성장하는 경향이있다. 표준 epifluorescence 현미경 효과적으로 전체 종양의 질량을 침투할 수 있기 때문에 이것은 그들이 특히 intravital 이미지에 적합합니다. 대조적으로, 마우스 내에서 표면 또는 orthotopic 사이트 중 하나에서 이식 종양은 어려운 정확하게 비침습 방법으로이 종양 내에 깊은 nanoparticles를 집중 수 있도록, 3 차원에 세포 분열 따위에 의해 번식. 우리는 nanoparticle 공법의 광범위한 범위의 생체내 분석에 적합이 모델에 대한 가능성을 강조, 양자 점, liposomes, 철 산화물은 인간 종양의 xenografts의 숫자 nanoparticles의 이해를 평가하기 위해이 모델을 활용합니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약 이름 / 장비 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> 수정된 레그혼 달걀 </td><td> 프라이`의 해처리, 세인트 제이콥스 </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Dremel 회전 공구 </td><td> Dremel </td><td></td><td> 어떤 모델을 사용할 수 </td></tr><tr><td> 더 Dremel 커토프 바퀴 없습니다. 36 </td><td> Dremel </td><td> 409 </td><td></td></tr><tr><td> 스포츠먼 해처 </td><td> 베리 힐 </td><td> 1550HA </td><td></td></tr><tr><td> 스포츠먼 인큐베이터 </td><td> 베리 힐 </td><td> 1502EA </td><td></td></tr><tr><td> 에탄올 </td><td></td><td></td><td> 70% (권 / 권) </td></tr><tr><td> 폴리스티렌은 보트를 달다 </td><td> VWR </td><td> 12577-01 </td><td></td></tr><tr><td> 광장 배양 접시 </td><td> Simport, VWR </td><td> 25378-115 </td><td></td></tr><tr><td> 뚜껑이있는 Rubbermaid 고무 용기 </td><td> Guillevin </td><td> RH3 - 228 - 00 - BLU </td><td> 구멍은 양쪽에 뚫고 </td></tr><tr><td> 수직 피펫 풀러 </td><td> 데이비드 Kopf 인 스트 루먼트 </td><td> 모델 720 </td><td> 설정 : 16.3 (히터) 및 2.3 (솔레노이드) </td></tr><tr><td> 나트륨 borosilicate 유리 모세관 튜브 </td><td> 서터 악기 </td><td> BF100 - 58-10 </td><td> (OD, 1.0 mm, 0.58 mm ID, 10 cm 길이) </td></tr><tr><td> 1X Dulbecco의 수정 이글 중간 (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 11995073 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco의 </td><td> Invitrogen </td><td> 14190250 </td><td> 산도 7.4 </td></tr><tr><td> 인산 버퍼 살린 (D - PBS) (1X), 액체 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 트립신, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 4Na와 0.05 % (1X), 액체 </td><td> Invitrogen </td><td> 25300054 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> Invitrogen </td><td> 12483-020 </td><td> inactivate 열 </td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> Hausser 과학, VWR </td><td> 15170-090 </td><td></td></tr><tr><td> 원심 분리기 </td><td> Eppendorf 모델 5810R </td><td> 5811 000.010 </td><td></td></tr><tr><td> 파인 포인트 포셉 </td><td> VWR </td><td> 25607-856 </td><td></td></tr><tr><td> Tygon R - 3603 튜브 </td><td> VWR </td><td> 63009-983 </td><td> 50피트 (1/32-inch 내경, 외경 3/32-inch, 1/32-inch 벽 두께 </td></tr><tr><td> 주사 18 게이지 바늘을 위해 피하 바늘 </td><td> BD </td><td> 305195 </td><td> 100 박스 </td></tr><tr><td> 주사 1 ML 주사기 </td><td> BD </td><td> 309602 </td><td> 100 박스 </td></tr><tr><td> 광섬유 현미경 조명기 </td><td> Amscope </td><td> HL250 - AY </td><td> 150W </td></tr><tr><td> kimwipes </td><td> VWR </td><td> 10805-905 </td><td></td></tr><tr><td> V. unguiculata 씨앗 (캘리포니아 검은 눈 안돼. 5) </td><td> 버피 </td><td> 51771A </td><td></td></tr><tr><td> 실내 성장 조명 </td><td> SunLite, 가드너의 공급 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 메틸 PEO4 - NHS 에스테르 </td><td> 찌르다 </td><td> PI22341 </td><td></td></tr><tr><td> MPEG - NHS, PEG succinimidyl 에스테르, MW 2000 </td><td> NANOCS </td><td> PEG1 - 0002 </td><td></td></tr><tr><td> 알렉사 플루어 647 카르복실산 (succinimidyl 에스테르) </td><td> Invitrogen </td><td> A20006 </td><td></td></tr><tr><td> 오레곤 그린 488 succinimidyl 에스테르 * 6 - 이성질체 * </td><td> Invitrogen </td><td> O - 6149 </td><td></td></tr><tr><td> 디메틸 sulfoxide (DMSO) </td><td> 시그마 </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td> 이염 기성 인산 monohydrogen </td><td> 시그마 </td><td> 379980 </td><td> K2HPO4 (phopshate 버퍼에 대한) </td></tr><tr><td> 일염기의 dihydrogen 인산염 </td><td></td><td> P5655 </td><td> KH2PO4 (phopshate 버퍼에 대한) </td></tr><tr><td> Superose 6 크기 배제 칼럼 </td><td> GE 헬스케어 생명 과학 </td><td> 17-0673-01 </td><td></td></tr><tr><td> 악타 익스플로러 100 크로마토 그래프 </td><td> GE 아머샴 Pharmacia </td><td> WS - AKTA100 </td><td></td></tr><tr><td> 악타 높은 흐름 키트 </td><td> GE 헬스케어 생명 과학 </td><td> 18-1154-85 </td><td></td></tr><tr><td> 자당 </td><td> 시그마 </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> 초원 심 분리기 </tD&gt; <td> 베크맨 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SW 28 티 로터 </td><td> 베크맨 </td><td> 342204 </td><td> 스윙 버켓 </td></tr><tr><td> 50.2 티 로터 </td><td> 베크맨 </td><td> 337901 </td><td> 고정 각도 </td></tr><tr><td> Amicon 울트라 - 15 원심 필터 유닛 </td><td> Millipore </td><td> UFC910008 </td><td> 100 KDA 컷 오프 </td></tr><tr><td> 그라데이션 전 </td><td> Biorad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> dextran, 플루오레신, 70,000 MW, 음이온 </td><td> Invitrogen </td><td> D1823 </td><td></td></tr><tr><td> 디스크 공촛점 형광 현미경 스피닝 </td><td> 쿼럼; 요코 CSU 10, 요코 </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Epifluorescence 넓은 분야 현미경 </td><td> 쿼럼; 자이스 혈구 Axio 심사관, 자이스 혈구 </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> 하마 마츠 ImagEM 9100-12 EM - CCD 카메라 </td><td> 쿼럼; 하마 마츠 </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> 현미경에 대한 온도 인클로저 단위 </td><td> 정밀 플라스틱 </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> 진공 그리스 </td><td> VWR </td><td> 59344-055 </td><td></td></tr><tr><td> 원형 유리는 coverslips 없습니다. 1 (18mm) </td><td> VWR </td><td> 16004-300 </td><td></td></tr><tr><td> Volocity 소프트웨어 </td><td> 퍼어킨 엘머 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 칙 배아 인클로저 </td><td></td><td> 사용자가 조작된 </td><td></td></tr><tr><td> 섬세한 가위 </td><td> VWR </td><td> 25608-203 </td><td></td></tr><tr><td> 포르말린 </td><td> Bioshop </td><td> FOR201.500 </td><td> fumehood에서 사용 </td></tr><tr><td> 최적의 절단 </td><td> 피셔; 조직 테크 </td><td> 1,437,365 </td><td></td></tr><tr><td> 온도 (-10 월) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 플라스틱 금형 </td><td> 어부 </td><td> 22-038217 </td><td></td></tr><tr><td> VWR VistaVision HistoBond 접착제 슬라이드 </td><td> VWR </td><td> 16004-406 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI로 금을 연장 </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td> 그라 이오 스탯을위한 일회용 블레이드 </td><td> 어부 </td><td> 12-634-2 </td><td></td></tr><tr><td> 그라 이오 스탯 </td><td> Leica CM 3050 S </td><td> 14047033518 </td><td></td></tr></table>

evaluation of nanoparticle uptake in tumors in real time using intravital imaging

이러한 초음파, MRI, PET 및 중부 표준시로 종양 이미징,에 대한 현재 기술은 적합한 이종 이식 모델의 유틸리티를 강조, 미세한 레벨 1,2,3에서 종양의 nanoparticle의 이해의 평가를위한 고해상도 이미지를 얻을 수 없습니다 자세한 이해 분석을 수행하는 인치 여기, 우리는 수정, 쉘 적은 닭고기 배아 모델에서 인간의 종양 xenografts에 nanoparticle의 이해를 평가하기 위해 고해상도 intravital 이미징을 사용합니다. 그것이 인간 종양의 성장을 지원하는 비교적 저렴하고 anesthetization 또는 수술 4,5 요구하지 않기 때문에 닭고기 배아 모델은 특히 생체내 분석에서 이러한에 적합합니다. chorioallantoic 멤브레인 (CAM) 6에 이식하면 종양 세포는 7 일 이내에 완벽하게 vascularized의 xenografts를 형성하고 있습니다. 그 결과 종양은 호스트 또는 종양 시스템 중 하나에 거의 영향을 최대 72시간까지 유지 수있는 비침습 실시간 고해상도 영상에 의해 시각입니다. 종양으로 말초 관리 크기와 공법의 다양한 Nanoparticles는 시각과 혈류를 통해 그들이 흐름으로 계량 수 있습니다 새는 종양의 vasculature에서 extravasate 및 종양 사이트에 축적. 우리는 여기서 가까운 적외선 형광 염료 및 / 또는 폴리에틸렌 글리콜 고분자 (PEG) 7, 8, 9,10,11으로 장식된 Cowpea 모자이크 바이러스 (CPMV)에서 파생 nanoparticles의 분석을 설명합니다. 정맥 주사 관리되면,이 바이러스 nanoparticles는 급속하게 외부 모두 vasculature의 글로벌 라벨과 종양 7,12 이내에 결과 내피 세포에 의해 internalized 있습니다. 바이러스 nanoparticles의 PEGylation들이 플라즈마 반감기를 증가, 순환에서 시간을 확장하고, 궁극적으로 향상된 투자율 및 유지 (EPR) 효과 7, 10,11를 통해 종양에서 축적을 향상시킵니다. 종양의 nanoparticles의 축적의 속도와 범위는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 시간이 지남에 따라 측정됩니다. 이 기술은 모두 시각화와 인간의 종양에서 nanoparticle의 역학을 계량하는 방법을 제공합니다.

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Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

우리는 조류 배아 모델 동적, 실시간 intravital 이미지를 사용하여 인간의 xenografted 종양의 vasculature에 nanoparticle의 국제화를 수치 소설 접근법을 제시한다.

Intravital 이미징을 사용하여 실시간으로 종양의 Nanoparticle의 이해 평가

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

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18.2K 조회수.  University of Western Ontario. 우리는 조류 배아 모델 동적, 실시간 intravital 이미지를 사용하여 인간의 xenografted 종양의 vasculature에 nanoparticle의 국제화를 수치 소설 접근법을 제시한다.

비디오: Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Multispectral Real-time Fluorescence Imaging for Intraoperative Detection of the Sentinel Lymph Node in Gynecologic Oncology

The prognosis in virtually all solid tumors depends on the presence or absence of lymph node metastases.1-3 Surgical treatment most often combines radical excision of the tumor with a full lymphadenectomy in the drainage area of the tumor. However, removal of lymph nodes is associated with increased morbidity due to infection, wound breakdown and lymphedema.4,5 As an alternative, the sentinel lymph node procedure (SLN) was developed several decades ago to detect the first draining lymph node from the tumor.6 In case of lymphogenic dissemination, the SLN is the first lymph node that is affected (Figure 1). Hence, if the SLN does not contain metastases, downstream lymph nodes will also be free from tumor metastases and need not to be removed. The SLN procedure is part of the treatment for many tumor types, like breast cancer and melanoma, but also for cancer of the vulva and cervix.7 The current standard methodology for SLN-detection is by peritumoral injection of radiocolloid one day prior to surgery, and a colored dye intraoperatively. Disadvantages of the procedure in cervical and vulvar cancer are multiple injections in the genital area, leading to increased psychological distress for the patient, and the use of radioactive colloid.
Multispectral fluorescence imaging is an emerging imaging modality that can be applied intraoperatively without the need for injection of radiocolloid. For intraoperative fluorescence imaging, two components are needed: a fluorescent agent and a quantitative optical system for intraoperative imaging. As a fluorophore we have used indocyanine green (ICG). ICG has been used for many decades to assess cardiac function, cerebral perfusion and liver perfusion.8 It is an inert drug with a safe pharmaco-biological profile. When excited at around 750 nm, it emits light in the near-infrared spectrum around 800 nm. A custom-made multispectral fluorescence imaging camera system was used.9.
The aim of this video article is to demonstrate the detection of the SLN using intraoperative fluorescence imaging in patients with cervical and vulvar cancer. Fluorescence imaging is used in conjunction with the standard procedure, consisting of radiocolloid and a blue dye. In the future, intraoperative fluorescence imaging might replace the current method and is also easily transferable to other indications like breast cancer and melanoma.

Fluorescence imaging is a promising innovative modality for image-guided surgery in surgical oncology. In this video we describe the technical procedure for detection of the sentinel lymph node using fluorescence imaging as showcased in gynecologic oncologicy. A multispectral fluorescence camera system, together with the fluorescent agent indocyanine green, is applied.

Gynecologic 종양학의 센티널 림프절의 Intraoperative 감지 Multispectral 실시간 형광 이미징

The prognosis in virtually all solid tumors depends on the presence or absence of lymph node metastases.1-3 Surgical treatment most often combines radical ...

연구

의학

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

정량 실시간 PCR (qPCR)에 의한 전립선 종양에 MicroRNA 감지

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury (IRI) of the Rat Cremaster Muscle

Ischemia-reperfusion injury (IRI) has been implicated in a large array of pathological conditions such as cerebral stroke, myocardial infarction, intestinal ischemia as well as following transplant and cardiovascular surgery.1 Reperfusion of previously ischemic tissue, while essential for the prevention of irreversible tissue injury, elicits excessive inflammation of the affected tissue. Adjacent to the production of reactive oxygen species, activation of the complement system and increased microvascular permeability, the activation of leukocytes is one of the principle actors in the pathological cascade of inflammatory tissue damage during reperfusion.2, 3 Leukocyte activation is a multistep process consisting of rolling, firm adhesion and transmigration and is mediated by a complex interaction between adhesion molecules in response to chemoattractants such as complement factors, chemokines, or platelet-activating factor.4
While leukocyte rolling in postcapillary venules is predominantly mediated by the interaction of selectins5 with their counter ligands, firm adhesion of leukocytes to the endothelium is selectin-controlled via binding to intercellular adhesion molecules (ICAM) and vascular cellular adhesion molecules (VCAM).6, 7 
Gold standard for the in vivo observation of leukocyte-endothelial interaction is the technique of intravital microscopy, first described in 1968.8
Though various models of IRI (ischemia-reperfusion injury) have been described for various organs, 9-12 only few are suitable for direct visualization of leukocyte recruitment in the microvascular bed on a high level of image quality.8 
We here promote the digital intravital epifluorescence microscopy of the postcapillary venule in the cremasteric microcirculation of the rat 13 as a convenient method to qualitatively and quantitatively analyze leukocyte recruitment for IRI-research in striated muscle tissue and provide a detailed manual for accomplishing the technique. We further illustrate common pitfalls and provide useful tips which should enable the reader to truly appreciate, and safely perform the method.
In a step by step protocol we depict how to get started with respiration controlled anesthesia under sufficient monitoring to keep the animal firmly anesthetized for longer periods of time. We then describe the cremasteric preparation as a thin flat sheet for outstanding optical resolution and provide a protocol for leukocyte imaging in IRI that has been well established in our laboratories.

Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury IRI of the Rat Cremaster Muscle

Digital intravital epifluorescence microscopy of postcapillary venules in the cremasteric microcirculation is a convenient method to gain insights into leukocyte-endothelial interaction in vivo in ischemia-reperfusion injury (IRI) of striated muscle tissue. We here provide a detailed protocol to safely perform the technique and discuss its applications and limitations.

쥐 Cremaster 근육의 국소 빈혈 reperfusion의 - 상해에서 백혈구 - 내피 상호 작용의 실시간 디지털 이미징 (IRI)

Ischemia-reperfusion injury (IRI) has been implicated in a large array of pathological conditions such as cerebral stroke, myocardial infarction, ...

Movement Retraining using Real-time Feedback of Performance

Any modification of movement - especially movement patterns that have been honed over a number of years - requires re-organization of the neuromuscular patterns responsible for governing the movement performance. This motor learning can be enhanced through a number of methods that are utilized in research and clinical settings alike. In general, verbal feedback of performance in real-time or knowledge of results following movement is commonly used clinically as a preliminary means of instilling motor learning. Depending on patient preference and learning style, visual feedback (e.g. through use of a mirror or different types of video) or proprioceptive guidance utilizing therapist touch, are used to supplement verbal instructions from the therapist. Indeed, a combination of these forms of feedback is commonplace in the clinical setting to facilitate motor learning and optimize outcomes.
Laboratory-based, quantitative motion analysis has been a mainstay in research settings to provide accurate and objective analysis of a variety of movements in healthy and injured populations. While the actual mechanisms of capturing the movements may differ, all current motion analysis systems rely on the ability to track the movement of body segments and joints and to use established equations of motion to quantify key movement patterns. Due to limitations in acquisition and processing speed, analysis and description of the movements has traditionally occurred offline after completion of a given testing session.
This paper will highlight a new supplement to standard motion analysis techniques that relies on the near instantaneous assessment and quantification of movement patterns and the display of specific movement characteristics to the patient during a movement analysis session. As a result, this novel technique can provide a new method of feedback delivery that has advantages over currently used feedback methods.

Retraining abnormal movement patterns following injury or disease is a key component of physical rehabilitation. Recent advances in technology have permitted accurate assessment of movement during a variety of tasks, with near instantaneous quantification of results. This provides new opportunities for modification of faulty movement patterns in real time.

운동은 성능의 실시간 피드백을 사용하여 재교육

Any modification of movement - especially movement patterns that have been honed over a number of years - requires re-organization of the neuromuscular ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

형광 SAPC-DOPS Nanovesicles을 사용하여 뇌 종양 및 관절염의 생체 광학 이미징

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an increased risk of vascular morbidity.&#160;Yet, albeit&#160;the mounting clinical evidence, there is a paucity of clear studies of vascular toxicity and therefore the etiology of a heterogeneous group of vascular/cardiovascular disorders remains to be elucidated. Moreover, the mechanism that may underlie vascular toxicity can completely differ from the principles of chemotherapy-induced cardiotoxicity, which is related to direct myocyte injury. We have established a real-time, in vivo molecular imaging platform&#160;to evaluate&#160;the potential&#160;acute&#160;vascular toxicity of anti-cancer therapies.
We have set up a platform of in vivo, high-resolution molecular imaging&#160;in mice,&#160;suitable for visualizing vasculature within confined organs and reference blood vessels within the same individuals whereas each individual serve as its own control. Blood vessel walls were impaired after doxorubicin administration, representing a unique mechanism of vascular toxicity that may be the early event in end-organ injury. Herein, the method of fibered confocal fluorescent microscopy (FCFM) based imaging is described, which provides an innovative mode to understand physiological phenomena at the cellular and sub-cellular levels in animal subjects.

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

We herein describe the method of fibered confocal fluorescent microscopy (FCFM) based imaging, which provides an innovative mode to understand physiological phenomena at the cellular and sub-cellular levels in animal subjects.

화학 요법에 의한 혈관 독성 - 실시간<em&gt; 생체 내</em&gt; 선박 손상의 영상

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an ...

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with high-throughput cell positioning technology. The targeted tumor cell populations are first preprogrammed to immobilization into an array format, and labeled with green fluorescent cytosolic dyes. Following the cell array formation, antibody drugs are added in combination with human whole blood. Propidium iodide (PI) is then added to assess cell death. The cell array is analyzed with an automatic imaging system. While cytosolic dye labels the targeted tumor cell populations, PI labels the dead tumor cell populations. Thus, the percentage of target cancer cell killing can be quantified by calculating the number of surviving targeted cells to the number of dead targeted cells. With this method, researchers are able to access time-dependent and dose-dependent cell cytotoxicity information. Remarkably, no hazardous radiochemicals are used. The WCA presented here has been tested with lymphoma, leukemia, and solid tumor cell lines. Therefore, WCA allows researchers to assess drug efficacy in a highly relevant ex&#160;vivo condition.

The whole blood cytotoxicity assay (WCA) is a cytotoxicity assay developed by incorporating high-throughput cell positioning technology with fluorescence microscopy and automated image processing. Here, we describe how lymphoma cells treated with an anti-CD20 antibody can be analyzed real-time in human whole blood to provide quantitative cellular cytotoxicity analysis.

인간 전혈에서 실시간 세포 독성 분석 실험

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...

Real-time X-ray Imaging of Lung Fluid Volumes in Neonatal Mouse Lung

At birth, the lung undergoes a profound phenotypic switch from secretion to absorption, which allows for adaptation to breathing independently. Promoting and sustaining this phenotype is critically important in normal alveolar growth and gas exchange throughout life. Several in vitro studies have characterized the role of key regulatory proteins, signaling molecules, and steroid hormones that can influence the rate of lung fluid clearance. However, in vivo examinations must be performed to evaluate whether these regulatory factors play important physiological roles in regulating perinatal lung liquid absorption. As such, the utilization of real time X-ray imaging to determine perinatal lung fluid clearance, or pulmonary edema, represents a technological advancement in the field. Herein, we explain and illustrate an approach to assess the rate of alveolar lung fluid clearance and alveolar flooding in C57BL/6 mice at post natal day 10 using X-ray imaging and analysis. Successful implementation of this protocol requires prior approval from institutional animal care and use committees (IACUC), an in vivo small animal X-ray imaging system, and compatible molecular imaging software.

We present a protocol to assess the rate of alveolar fluid clearance or pulmonary edema in neonatal mouse lung using X-ray imaging technology.

신생아 마우스 폐에서 폐 유체 볼륨의 실시간 X 선 영상

At birth, the lung undergoes a profound phenotypic switch from secretion to absorption, which allows for adaptation to breathing independently. Promoting ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

정량 실시간 PCR에 의해 마우스 유방 종양 모델에서 폐 전이의 평가

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform extended time-lapse imaging of multicellular interactions in real time, in vivo at single cell resolution.

종양 미세 환경에서 실시간 다세포 역학의 확장 시간 경과 생체 내에 영상

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...