Diese Studie wurde von CCSRI Grant # 700537 und CIHR Grant # 84535 zu JDL und NIH / NCI gewähren # CA120711-01A1 und CA120711-01A1 auf AZ unterstützt. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Vorschriften und Richtlinien des Institutional Animal Care durchgeführt und Verwenden Ausschuss an der University of California San Diego, Animal Care und Nutzung an der University of Western Ontario.

1. Inokulation von Tumorzellen in Vogelembryo CAM <ol><li> Bereiten Sie Shell-less befruchteten Hühner-Embryonen, wie beschrieben 8. </li><li> Am Tag 9 der Embryonalentwicklung, montieren ein Mikro-Injektor mit einem 18-Gauge-Nadel auf 1 ml-Spritze verbunden. Schneiden Sie ein 5-6 cm Stück Tygon-Schlauch (1 / 32 &quot;Innendurchmesser, 3 / 32&quot; Außendurchmesser, 1 / 32 &quot;Wandstärke) und vorsichtig einführen Fase der Nadel in den Schlauch. Ca. 4-5 cm von Schläuchen sollte erstrecken sich von der Spitze der Nadel (Abbildung 1a). </li><li> Füllen Sie die Spritze und Schlauch mit Zellsuspension. Dann legen Sie eine Mikroinjektion Glasnadel am Ende des Schlauches und entfernen Sie vorsichtig die Luftblasen. </li><li> Inject Tag 9 Embryonen (Abb. 1b) im Rahmen einer Dissektion Umfang mit einer Beleuchtung mit 10.000-100.000 Krebszellen als Bolus innerhalb der CAM (Abbildung 1c). Langsam injizieren Zellen und sorgfältig sicherzustellen, dass die Nadel an der richtigen Stelle für die Zellen ist, um eine sichtbare Bolus innerhalb der CAM zu bilden. Zellen, die tropfen auf den CAM-Oberfläche gereinigt mit Kimwipe oder andere Applikator kann. </li><li> Zurück Embryonen befeuchteten Inkubator bei 38 ° C bei 60% Luftfeuchtigkeit und damit der Tumor nicht wachsen und vaskularisieren (bis zu 7 Tage). </li></ol> 2. Herstellung von Nanopartikeln <ol><li> Um fluoreszenzmarkierten CPMV Nanopartikel für die Injektion in den Hühnerembryo vorzubereiten; verdünnen das virale Nanopartikel (synthetisiert, wie in 8 in PBS, pH 7,4, zu einer Konzentration von 100 pg / ml Vortex Mischung vor Gebrauch gut und Zentrifuge für 1 Minute auf jeder zu entfernen. Aggregate. Ultraschallbehandlung kann auch nützlich sein in Abhängigkeit von Konjugaten und den Grad der Aggregation. Stocks von fluoreszenzmarkierten CPMVs sind für mindestens 1 Jahr stabil, wenn sie bei 4 ° C im Dunkeln. Überprüfen Sie in regelmäßigen Abständen Aktien, indem Sie ein paar Tropfen auf einen Objektträger aus Glas und Prüfung für die Fluoreszenz. Transmission Electron Microscopy (TEM) kann auch verwendet werden um festzustellen, ob die Teilchen intakt geblieben nach der Konjugation werden. </li><li> Kurz gesagt, kann ein Mikrogramm des viralen Nanopartikel (in einem Endvolumen von 2 ul) zu Kupfer beschichteten Gitter hinzugefügt werden. Als Nächstes fügen Sie dem gleichen Volumen von 2% Uranylacetat für 1 Minute bei Elektronenmikroskop (Philips EM 410). </li></ol> 3. Die intravenöse Injektion von fluoreszenzmarkierten virale Nanopartikel <ol><li> Am Tag 16, montieren Mikro-Injektor, wie oben beschrieben. Erstellen Sie gewünschte Lautstärke von viralen Nanopartikel durch den Schlauch in die Spritze (&gt; 200 mL). Entfernen Sie vorsichtig alle Luftblasen. Legen Sie Mikroinjektion Glasnadel am Ende des Schlauchs. Stellen Sie sicher, dass die Nadel so lange und konische wie möglich (Abbildung 2a) ist. Wenn die Nadel zu stumpf, wird er nicht in der Lage sein zu durchdringen Ektoderm und schlägt fehl, das Schiff eindringt. Wenn die Nadel ist zu scharf, wird die Spitze Zusammenbruch beim Eindringen Gewebe. </li><li> Intravenös injizieren 100 ul 1 mg / ml Fluorescein Dextran (MG 70.000 Da, Invitrogen) in tumortragenden Embryo distal von der gewünschten Stelle sichtbar gemacht werden (Abbildung 3d). Erfolgreiche Kanülierung CAM Vene ist offensichtlich durch die Rodung von Blut in den Pfad der Einspritzmenge (Abb. 2b). Beurteilen vaskuläre Leckage 1 Stunde nach der Injektion. </li><li> Intravenös injizieren 50 ul 1 mg / ml Lösung von CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-AF 647) oder PEGylierte CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-PEG-AF 647) zu Embryonen, die Tumore mit vaskulärer Leckage distal von der gewünschten Stelle zu visualisiert werden. </li><li> Bild Tumoren sofort und zu jeder Stunde nach der Injektion mit einem Zeiss-Examiner Z1 aufrechten Mikroskop mit einer Yokogawa drehende Scheibe, Hamamatsu Imagem 9100-12 EM-CCD-Kamera ausgestattet. </li></ol> 4. Echtzeit-Bildgebung intravital <ol><li> Zur Montage des Embryos Bildeinheit, eine dünne Schicht von Vakuumfett um den Umfang der Bildgebung Anschluss auf der Unterseite des Deckels des Embryos Bildeinheit und fit mit 18 mm Deckglas auf den Hafen. </li><li> Position des Embryos, so dass das Deckglas wird der gewünschte Bereich für die Bildgebung zu decken. Langsam senken Sie den Deckel, bis das Deckglas macht einfach Kontakt mit dem Embryo, und schrauben Sie den Deckel auf das Gerät, um es in Position zu halten (Abbildung 2c). </li><li> Fügen Sie Wasser erwärmt auf 37 ° C in den Embryo Bildeinheit außerhalb der Schale mit dem Embryo, und dann die gesamte Einheit auf die Bühne eines aufrechten konfokalen Mikroskop mit der Innenseite Klimakammer äquilibriert bis 37 ° C. </li><li> Positionieren Sie die Bildeinheit enthält der Embryo unter dem Spinning Disk konfokalen Fluoreszenzmikroskop (Abbildung 2e). Die bildgebende Einheit wird der Embryo in Position zu halten und halten das Blickfeld fixiert, während die Aufnahme von Bildern, so dass für beide dreidimensionalen Z-Stapel und Zeitreihen-Aufnahmen erfasst werden. Wir erfassen und analysieren dreidimensionale Zeitraffer-Bilder mit Perkin Elmer (ehemals Improvisation) Volocity Software-Paket (Abbildung 3a). Erwerben Sie eine hochauflösende dreidimensionale Stapel des Tumors und des umgebenden Gefäße zu visualisieren detailed Strukturanalysen an bestimmten Zeitpunkten. Erwerben Sie dreidimensionale Stapel in regelmäßigen Zeit-Punkte, um detaillierte strukturelle Veränderungen in der Gefäßversorgung des Tumors Karte. Bild Tumoren jede Stunde nach der Injektion. </li><li> Quantifizierung der Aufnahme von viralen Nanopartikel durch die Berechnung der mittleren Alexa Fluor (AF) 647-Signal in ausgewählten Regionen in den Tumor oder in das Stroma (Nicht-Tumor-Bereich) mit Bild Quantifizierung Software wie Volocity (Perkin Elmer). Der Tumor Stroma-Verhältnis wurde durch Division der mittleren AF 647-Signal in den Tumor über die mittlere AF 647-Signal in das Stroma berechnet. Ein Tumor / Stroma-Ratio von größer als 1 zeigt, dass die Nanopartikel wird durch den Tumor entnommen. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: In dem hier beschriebenen Beispiel, injizierten wir HT-29 Kolonkarzinomzellen zu einem Bolus etwa 1mm in der Größe innerhalb der CAM von Tag 9 Hühnerembryonen (Abb. 1b). Nach der Impfung wurden die Embryonen für 7 Tage in einem befeuchteten Inkubator kultiviert werden, um ausreichend Tumorwachstum und Gefäßneubildung (Abbildung 1c) zu ermöglichen. Die Embryonen wurden intravenös mit einem niedermolekularen Dextran injiziert, um der Gefäßversorgung von Tumoren zu bestätigen, und die Tumore wurden unter dem Zeiss AxioExaminer Z1 aufrechten Mikroskop (Abbildung 2d) visualisiert. Nach intravenöser Verabreichung von CPMV-AF 647 oder CPMV-PEG-AF 647-Nanopartikel (Abbildung 3a und b) mit hoher Auflösung in Echtzeit konfokale Bildgebung (Abbildung 2e) ergab, dass sowohl CPMV und CPMV-PEG-Nanopartikeln schnell beschriftet das gesamte Gefäßsystem, aber die Aufnahme von CPMV-PEG durch den Tumor war etwa 3 mal höher als CPMV nach 12 Stunden (Abbildung 3a). Die relative Tumor Aufnahme von Nanopartikeln wurde mit Bildanalyse-Software (Volocity von Perkin Elmer). Regionen von Interesse waren innerhalb und außerhalb der Tumor ausgewählt (im Stroma) und die mittlere Fluoreszenzintensität der einzelnen bestimmt. Die Daten werden als Tumor / Stroma-Verhältnis ausgedrückt. <img src="/files/ftp_upload/2808/2808fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Mikroinjektion von Tumoren in den CAM eines Vogelembryo. (A) Die Mikroinjektion Vorrichtung ist aus den Komponenten zusammengesetzt wie angegeben. (B) Vogelembryonen am Tag 9 sind bereit, mit Tumor geimpft werden, wenn die CAM ausgebreitet hat, die gesamte Oberfläche bedeckt. (C) Am Tag 16 wird der Tumor gewachsen sein, bis zu 1 cm im Durchmesser (gestrichelte Linie) und ist bereit für die Injektion mit Nanopartikeln. <img src="/files/ftp_upload/2808/2808fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Nanopartikel-Einspritzung und intravital Bildgebung. Injection unter einem Dissektionsmikroskop zeigt (a) die Spitze des Mikroinjektor Nadel bereit, in die CAM Vene injiziert werden und (b) die Mikroinjektor Nadel in die Vene eingeführt (durch Pfeil gekennzeichnet) und Nanopartikel injiziert in den Blutfluss (gesehen durch das Löschen des Blutes). (C) Imaging-Einheit mit Vogelembryo mit dem Deckglas eine Schnittstelle direkt mit dem CAM. (D) Vor der Nanopartikel-Injektion wird der Gefäßversorgung von Tumoren untersucht mit Hilfe der Intravitalmikroskopie Bildgebung nach der Injektion von Fluorescein Dextran. (E) Imaging-Einheit mit dem Embryo auf der Bühne eines aufrechten konfokalen Mikroskop in einem temperierten Gehäuse gesetzt positioniert, um 37 ° C. <img src="/files/ftp_upload/2808/2808fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Intravital Visualisierung von Nanopartikeln Aufnahme in menschlichen Tumoren. Tumoren sind 7 Stunden nach der Injektion von (a) CPMV-AF647 und (b) CPMV-PEG-AF647 visualisiert. d) Exzision des Tumors aus Vogelembryo für die spätere Analyse.

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Die Chorioallantoismembran (CAM) der Vogelembryo ist ein nützliches Modell für die vaskuläre Dynamik und Pharmakokinetik von humanen Tumoren zu bewerten. Die Struktur und die Position der CAM ermöglicht qualitativ hochwertige Bildaufnahme und bietet Platz für viele Arten von Krebs Xenotransplantate ohne invasive chirurgische Eingriffe. Darüber hinaus Krebs Tumorxenotransplantaten in der Chorioallantoismembran geworden vaskularisierten innerhalb von 7 Tagen implantiert und bietet eine schnelle, kostengünstige und semi-High-Throughput-Mittel, um die Akkumulation von Nanopartikeln in Tumorgewebe zu beurteilen. Da Krebs Xenotransplantate in der CAM des Shell-less Hühnerembryonen implantiert zugänglich hochauflösende Optik eines aufrechten Epifluoreszenz oder konfokalen Mikroskop, kontextuellen und zeitlichen Informationen über Nanopartikel-Aufnahme in der Gefäßversorgung des Tumors sind, können leicht erreicht werden. Cancer Xenotransplantate in diesem Modell eher zu wachsen seitlich über den CAM, was in Tumoren, die groß sind, während noch weniger als 200 m in die Tiefe. Das macht sie besonders für intravitale Bildgebung gut geeignet, da Standard-Epifluoreszenz Mikroskope effektiv durchdringen kann die gesamte Tumormasse. Im Gegensatz dazu vermehren Tumoren entweder oberflächlich oder orthotopen Stellen innerhalb der Maus implantiert in drei Dimensionen, so dass es schwierig, genau zu lokalisieren Nanopartikel tief in diesen Tumoren durch nicht-invasive Techniken. Wir haben dieses Modell benutzt, um die Aufnahme von Quantenpunkten, Liposomen und Eisenoxid-Nanopartikel in einer Reihe von menschlichen Tumorxenotransplantaten zu beurteilen, das auf das Potential für dieses Modell geeignet zu sein für die in vivo Analyse einer breiten Palette von Nanopartikel-Formulierungen.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagent Name / Ausstattung </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Befruchteten Eier leghorn </td><td> Frey `s Hatchery, St. Jacobs </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Dremel Dremel </td><td> Dremel </td><td></td><td> Kann verwendet werden, jedes Modell </td></tr><tr><td> Dremel Trennscheiben nicht. 36 </td><td> Dremel </td><td> 409 </td><td></td></tr><tr><td> Sportsman Hatcher </td><td> Berry Hill </td><td> 1550HA </td><td></td></tr><tr><td> Sportsman Inkubator </td><td> Berry Hill </td><td> 1502EA </td><td></td></tr><tr><td> Ethanol </td><td></td><td></td><td> 70% (vol / vol) </td></tr><tr><td> Polystyrol wiegen Boote </td><td> VWR </td><td> 12577-01 </td><td></td></tr><tr><td> Platz Petrischalen </td><td> Simport, VWR </td><td> 25378-115 </td><td></td></tr><tr><td> Rubbermaid Gummi Behälter mit Deckel </td><td> Guillevin </td><td> RH3-228-00-BLU </td><td> Löcher in Seiten gebohrt </td></tr><tr><td> Vertical Pipette puller </td><td> David Kopf Instruments </td><td> Modell 720 </td><td> Einstellungen: 16,3 (Heizung) und 2,3 (Magnet) </td></tr><tr><td> Sodium Borosilikatglas Kapillarrohre </td><td> Sutter Instrument </td><td> BF100-58 bis 10 </td><td> (OD, 1,0 mm; ID 0,58 mm, 10-cm Länge) </td></tr><tr><td> 1X Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 11995073 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbeccos </td><td> Invitrogen </td><td> 14190250 </td><td> pH-Wert 7,4 </td></tr><tr><td> Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (D-PBS) (1x), flüssig </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Trypsin, 0,05% (1X) mit EDTA 4NA, flüssig </td><td> Invitrogen </td><td> 25300054 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Invitrogen </td><td> 12483-020 </td><td> Hitze inaktiviert </td></tr><tr><td> Hämozytometer </td><td> Hausser Scientific, VWR </td><td> 15170-090 </td><td></td></tr><tr><td> Zentrifuge </td><td> Eppendorf Modell 5810R </td><td> 5811 000.010 </td><td></td></tr><tr><td> Fine-Punkt Zange </td><td> VWR </td><td> 25607-856 </td><td></td></tr><tr><td> Tygon R-3603-Schlauch </td><td> VWR </td><td> 63009-983 </td><td> 50 ft (1/32-inch Innendurchmesser, 3/32-inch Außendurchmesser, 1/32-inch Wandstärke </td></tr><tr><td> Injektionsnadeln für Injektionszwecke 18-Gauge-Nadel </td><td> BD </td><td> 305195 </td><td> Box von 100 </td></tr><tr><td> 1 ml-Spritzen für Injektionen </td><td> BD </td><td> 309602 </td><td> Box von 100 </td></tr><tr><td> LWL-Mikroskopbeleuchtung </td><td> Amscope </td><td> HL250-AY </td><td> 150W </td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> VWR </td><td> 10805-905 </td><td></td></tr><tr><td> V. unguiculata Samen (California black-eye-Nr. 5) </td><td> Burpee </td><td> 51771A </td><td></td></tr><tr><td> Indoor Wachstum Lichter </td><td> Sunlite, Gärtnerhaus Versorgung </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Methyl-PEO4-NHS-Ester </td><td> Durchstechen </td><td> PI22341 </td><td></td></tr><tr><td> mPEG-NHS, PEG Succinimidylester, MW 2000 </td><td> NANOCS </td><td> PEG1-0002 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 Carbonsäure (Succinimidylester) </td><td> Invitrogen </td><td> A20006 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon Green 488 Succinimidylester * 6-Isomer * </td><td> Invitrogen </td><td> O-6149 </td><td></td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxid (DMSO) </td><td> Sigma </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td> Dibasic Monohydrogenphosphat </td><td> Sigma </td><td> 379980 </td><td> K2HPO4 (für phopshate Puffer) </td></tr><tr><td> Einbasisches Dihydrogenphosphat </td><td></td><td> P5655 </td><td> KH2PO4 (für phopshate Puffer) </td></tr><tr><td> Superose 6 Ausschluss-Spalte </td><td> GE Healthcare Life Sciences </td><td> 17-0673-01 </td><td></td></tr><tr><td> ÄKTA Explorer 100 Chromatograph </td><td> GE Amersham Pharmacia </td><td> WS-AKTA100 </td><td></td></tr><tr><td> ÄKTA hohen Durchfluss-Kit </td><td> GE Healthcare Life Sciences </td><td> 18-1154-85 </td><td></td></tr><tr><td> Sucrose </td><td> Sigma </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> Ultrazentrifuge </td&gt; <td> Beckman </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SW 28 Ti Rotor </td><td> Beckman </td><td> 342204 </td><td> Schwenklöffel </td></tr><tr><td> 50,2 Ti-Rotor </td><td> Beckman </td><td> 337901 </td><td> Festen Winkel </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-15 Zentrifugalfilter Units </td><td> Millipore </td><td> UFC910008 </td><td> 100 kDa abgeschnitten </td></tr><tr><td> Gradient ehemaligen </td><td> Biorad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dextran, Fluorescein, 70.000 MW, anionische </td><td> Invitrogen </td><td> D1823 </td><td></td></tr><tr><td> Spinning Disk konfokalen Fluoreszenzmikroskop </td><td> Quorum; Yokogawa CSU 10, Yokogawa </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Epifluoreszenz wide-field-Mikroskop </td><td> Quorum; Zeiss Axio Examiner, Zeiss </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Hamamatsu Imagem 9100-12 EM-CCD-Kamera </td><td> Quorum; Hamamatsu </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Temperatur Schrankgerät für Mikroskop </td><td> Precision Plastics </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Vakuumfett </td><td> VWR </td><td> 59344-055 </td><td></td></tr><tr><td> Circular Deckgläschen nicht. 1 (18 mm) </td><td> VWR </td><td> 16004-300 </td><td></td></tr><tr><td> Volocity Software </td><td> Perkin Elmer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hühnerembryo Gehäuse </td><td></td><td> individuell gefertigter </td><td></td></tr><tr><td> Delicate Schere </td><td> VWR </td><td> 25608-203 </td><td></td></tr><tr><td> Formalin </td><td> BioShop </td><td> FOR201.500 </td><td> Verwenden Sie in Abzug durchzuführen </td></tr><tr><td> Optimale Schnittbedingungen </td><td> Fisher; Tissue Tek </td><td> 1437365 </td><td></td></tr><tr><td> Temperatur (OCT) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kunststoffformen </td><td> Fischer </td><td> 22-038217 </td><td></td></tr><tr><td> VWR VistaVision HistoBond Adhesive Slides </td><td> VWR </td><td> 16004-406 </td><td></td></tr><tr><td> Verlängern Sie Gold mit DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td> Einweg-Klingen für Kryostat </td><td> Fischer </td><td> 12-634-2 </td><td></td></tr><tr><td> Kryostat </td><td> Leica CM 3050 S </td><td> 14047033518 </td><td></td></tr></table>

evaluation of nanoparticle uptake in tumors in real time using intravital imaging

Aktuelle Technologien für die Tumor-Bildgebung, wie Ultraschall, MRT, PET und CT sind nicht in der Lage, hochauflösende Bilder für die Beurteilung der Nanopartikel-Aufnahme in Tumoren auf der mikroskopischen Ebene 1,2,3 ergeben, Hervorhebung der Nützlichkeit eines geeigneten Xenograftmodell in die detaillierte Aufnahme Analysen durchzuführen. Hier verwenden wir hochauflösende intravital Bildgebung Nanopartikel-Aufnahme in menschliche Tumorxenotransplantate in einer modifizierten, Shell-less Hühnerembryo-Modell zu bewerten. Der Hühnerembryo Modell ist besonders für diese in vivo-Analysen gut geeignet, da es das Wachstum von Tumoren beim Menschen unterstützt, ist relativ kostengünstig und erfordert keine Betäubung oder Operation 4,5. Tumorzellen Formular vollständig vaskularisiert Xenotransplantate innerhalb von 7 Tagen, wenn sie in der Chorioallantoismembran (CAM) 6 implantiert. Die daraus resultierenden Tumoren werden visualisiert durch nicht-invasive Echtzeit, hoch auflösende Bildgebung, hielten bis zu 72 Stunden mit wenig Einfluss sowohl auf dem Host-oder Tumor-Systemen werden kann. Nanopartikel mit einer breiten Palette von Größen und Formulierungen verabreicht distal des Tumors können visualisiert und quantifiziert werden, da sie fließen durch den Blutkreislauf, die von undichten der Gefäßversorgung des Tumors extravasieren und reichern sich am Ort des Tumors. Wir beschreiben hier die Analyse von Nanopartikeln aus Cowpea Mosaik-Virus (CPMV) mit Nah-Infrarot-Fluoreszenz-Farbstoffe und / oder Polyethylenglykol Polymere (PEG) 7, 8, 9,10,11 dekoriert abgeleitet. Bei intravenöser Verabreichung werden diese viralen Nanopartikel rasch von Endothelzellen internalisiert, was im globalen Kennzeichnung der Gefäße sowohl außerhalb als auch innerhalb des Tumors 7,12. PEGylierung des viralen Nanopartikel erhöht ihre Plasma-Halbwertszeit, erstreckt sich ihre Zeit in den Kreislauf, und schließlich steigert ihre Anhäufung in Tumoren durch die erhöhte Permeabilität und Retention (EPR) Effekt 7, 10,11. Die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Akkumulation von Nanopartikeln in einem Tumor ist über die Zeit gemessen anhand der Bildanalyse-Software. Diese Technik bietet eine Methode, um sowohl zu visualisieren und zu quantifizieren Nanopartikel Dynamik in menschlichen Tumoren.

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Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Wir präsentieren einen neuartigen Ansatz zur Nanopartikel-Lokalisierung in das Gefäßsystem des menschlichen xenotransplantiert Tumoren mittels dynamischer Echtzeit-Intravitalmikroskopie Bildgebung in einem Vogelembryo Modell zu quantifizieren.

Evaluation von Nanopartikel-Aufnahme in Tumoren in Echtzeit über Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

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18.2K Aufrufe.  University of Western Ontario. Wir präsentieren einen neuartigen Ansatz zur Nanopartikel-Lokalisierung in das Gefäßsystem des menschlichen xenotransplantiert Tumoren mittels dynamischer Echtzeit-Intravitalmikroskopie Bildgebung in einem Vogelembryo Modell zu quantifizieren.

Serie: Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Multispectral Real-time Fluorescence Imaging for Intraoperative Detection of the Sentinel Lymph Node in Gynecologic Oncology

The prognosis in virtually all solid tumors depends on the presence or absence of lymph node metastases.1-3 Surgical treatment most often combines radical excision of the tumor with a full lymphadenectomy in the drainage area of the tumor. However, removal of lymph nodes is associated with increased morbidity due to infection, wound breakdown and lymphedema.4,5 As an alternative, the sentinel lymph node procedure (SLN) was developed several decades ago to detect the first draining lymph node from the tumor.6 In case of lymphogenic dissemination, the SLN is the first lymph node that is affected (Figure 1). Hence, if the SLN does not contain metastases, downstream lymph nodes will also be free from tumor metastases and need not to be removed. The SLN procedure is part of the treatment for many tumor types, like breast cancer and melanoma, but also for cancer of the vulva and cervix.7 The current standard methodology for SLN-detection is by peritumoral injection of radiocolloid one day prior to surgery, and a colored dye intraoperatively. Disadvantages of the procedure in cervical and vulvar cancer are multiple injections in the genital area, leading to increased psychological distress for the patient, and the use of radioactive colloid.
Multispectral fluorescence imaging is an emerging imaging modality that can be applied intraoperatively without the need for injection of radiocolloid. For intraoperative fluorescence imaging, two components are needed: a fluorescent agent and a quantitative optical system for intraoperative imaging. As a fluorophore we have used indocyanine green (ICG). ICG has been used for many decades to assess cardiac function, cerebral perfusion and liver perfusion.8 It is an inert drug with a safe pharmaco-biological profile. When excited at around 750 nm, it emits light in the near-infrared spectrum around 800 nm. A custom-made multispectral fluorescence imaging camera system was used.9.
The aim of this video article is to demonstrate the detection of the SLN using intraoperative fluorescence imaging in patients with cervical and vulvar cancer. Fluorescence imaging is used in conjunction with the standard procedure, consisting of radiocolloid and a blue dye. In the future, intraoperative fluorescence imaging might replace the current method and is also easily transferable to other indications like breast cancer and melanoma.

Fluorescence imaging is a promising innovative modality for image-guided surgery in surgical oncology. In this video we describe the technical procedure for detection of the sentinel lymph node using fluorescence imaging as showcased in gynecologic oncologicy. A multispectral fluorescence camera system, together with the fluorescent agent indocyanine green, is applied.

Multispectral Real-time Fluoreszenz-Imaging für die intraoperative Detektion des Sentinel Lymph Node in Gynäkologische Onkologie

The prognosis in virtually all solid tumors depends on the presence or absence of lymph node metastases.1-3 Surgical treatment most often combines radical ...

Forschung

Medizin

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

MicroRNA-Detektion in Prostatatumoren durch quantitative real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury (IRI) of the Rat Cremaster Muscle

Ischemia-reperfusion injury (IRI) has been implicated in a large array of pathological conditions such as cerebral stroke, myocardial infarction, intestinal ischemia as well as following transplant and cardiovascular surgery.1 Reperfusion of previously ischemic tissue, while essential for the prevention of irreversible tissue injury, elicits excessive inflammation of the affected tissue. Adjacent to the production of reactive oxygen species, activation of the complement system and increased microvascular permeability, the activation of leukocytes is one of the principle actors in the pathological cascade of inflammatory tissue damage during reperfusion.2, 3 Leukocyte activation is a multistep process consisting of rolling, firm adhesion and transmigration and is mediated by a complex interaction between adhesion molecules in response to chemoattractants such as complement factors, chemokines, or platelet-activating factor.4
While leukocyte rolling in postcapillary venules is predominantly mediated by the interaction of selectins5 with their counter ligands, firm adhesion of leukocytes to the endothelium is selectin-controlled via binding to intercellular adhesion molecules (ICAM) and vascular cellular adhesion molecules (VCAM).6, 7 
Gold standard for the in vivo observation of leukocyte-endothelial interaction is the technique of intravital microscopy, first described in 1968.8
Though various models of IRI (ischemia-reperfusion injury) have been described for various organs, 9-12 only few are suitable for direct visualization of leukocyte recruitment in the microvascular bed on a high level of image quality.8 
We here promote the digital intravital epifluorescence microscopy of the postcapillary venule in the cremasteric microcirculation of the rat 13 as a convenient method to qualitatively and quantitatively analyze leukocyte recruitment for IRI-research in striated muscle tissue and provide a detailed manual for accomplishing the technique. We further illustrate common pitfalls and provide useful tips which should enable the reader to truly appreciate, and safely perform the method.
In a step by step protocol we depict how to get started with respiration controlled anesthesia under sufficient monitoring to keep the animal firmly anesthetized for longer periods of time. We then describe the cremasteric preparation as a thin flat sheet for outstanding optical resolution and provide a protocol for leukocyte imaging in IRI that has been well established in our laboratories.

Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury IRI of the Rat Cremaster Muscle

Digital intravital epifluorescence microscopy of postcapillary venules in the cremasteric microcirculation is a convenient method to gain insights into leukocyte-endothelial interaction in vivo in ischemia-reperfusion injury (IRI) of striated muscle tissue. We here provide a detailed protocol to safely perform the technique and discuss its applications and limitations.

Real-time Digital Imaging von Leukozyten-Endothel-Interaktion in der Ischämie-Reperfusionsschaden (IRI) der Ratte Cremastermuskel

Ischemia-reperfusion injury (IRI) has been implicated in a large array of pathological conditions such as cerebral stroke, myocardial infarction, ...

Movement Retraining using Real-time Feedback of Performance

Any modification of movement - especially movement patterns that have been honed over a number of years - requires re-organization of the neuromuscular patterns responsible for governing the movement performance. This motor learning can be enhanced through a number of methods that are utilized in research and clinical settings alike. In general, verbal feedback of performance in real-time or knowledge of results following movement is commonly used clinically as a preliminary means of instilling motor learning. Depending on patient preference and learning style, visual feedback (e.g. through use of a mirror or different types of video) or proprioceptive guidance utilizing therapist touch, are used to supplement verbal instructions from the therapist. Indeed, a combination of these forms of feedback is commonplace in the clinical setting to facilitate motor learning and optimize outcomes.
Laboratory-based, quantitative motion analysis has been a mainstay in research settings to provide accurate and objective analysis of a variety of movements in healthy and injured populations. While the actual mechanisms of capturing the movements may differ, all current motion analysis systems rely on the ability to track the movement of body segments and joints and to use established equations of motion to quantify key movement patterns. Due to limitations in acquisition and processing speed, analysis and description of the movements has traditionally occurred offline after completion of a given testing session.
This paper will highlight a new supplement to standard motion analysis techniques that relies on the near instantaneous assessment and quantification of movement patterns and the display of specific movement characteristics to the patient during a movement analysis session. As a result, this novel technique can provide a new method of feedback delivery that has advantages over currently used feedback methods.

Retraining abnormal movement patterns following injury or disease is a key component of physical rehabilitation. Recent advances in technology have permitted accurate assessment of movement during a variety of tasks, with near instantaneous quantification of results. This provides new opportunities for modification of faulty movement patterns in real time.

Movement Umschulung mit Echtzeit-Feedback von Performance

Any modification of movement - especially movement patterns that have been honed over a number of years - requires re-organization of the neuromuscular ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

In Vivo Optical Imaging von Hirntumoren und Arthritis mit fluoreszierenden SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an increased risk of vascular morbidity.&#160;Yet, albeit&#160;the mounting clinical evidence, there is a paucity of clear studies of vascular toxicity and therefore the etiology of a heterogeneous group of vascular/cardiovascular disorders remains to be elucidated. Moreover, the mechanism that may underlie vascular toxicity can completely differ from the principles of chemotherapy-induced cardiotoxicity, which is related to direct myocyte injury. We have established a real-time, in vivo molecular imaging platform&#160;to evaluate&#160;the potential&#160;acute&#160;vascular toxicity of anti-cancer therapies.
We have set up a platform of in vivo, high-resolution molecular imaging&#160;in mice,&#160;suitable for visualizing vasculature within confined organs and reference blood vessels within the same individuals whereas each individual serve as its own control. Blood vessel walls were impaired after doxorubicin administration, representing a unique mechanism of vascular toxicity that may be the early event in end-organ injury. Herein, the method of fibered confocal fluorescent microscopy (FCFM) based imaging is described, which provides an innovative mode to understand physiological phenomena at the cellular and sub-cellular levels in animal subjects.

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

We herein describe the method of fibered confocal fluorescent microscopy (FCFM) based imaging, which provides an innovative mode to understand physiological phenomena at the cellular and sub-cellular levels in animal subjects.

Chemotherapie-induzierte vaskuläre Toxizität - Echtzeit-<em&gt; In-vivo-</em&gt; Imaging von Vessel Impairment

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an ...

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with high-throughput cell positioning technology. The targeted tumor cell populations are first preprogrammed to immobilization into an array format, and labeled with green fluorescent cytosolic dyes. Following the cell array formation, antibody drugs are added in combination with human whole blood. Propidium iodide (PI) is then added to assess cell death. The cell array is analyzed with an automatic imaging system. While cytosolic dye labels the targeted tumor cell populations, PI labels the dead tumor cell populations. Thus, the percentage of target cancer cell killing can be quantified by calculating the number of surviving targeted cells to the number of dead targeted cells. With this method, researchers are able to access time-dependent and dose-dependent cell cytotoxicity information. Remarkably, no hazardous radiochemicals are used. The WCA presented here has been tested with lymphoma, leukemia, and solid tumor cell lines. Therefore, WCA allows researchers to assess drug efficacy in a highly relevant ex&#160;vivo condition.

The whole blood cytotoxicity assay (WCA) is a cytotoxicity assay developed by incorporating high-throughput cell positioning technology with fluorescence microscopy and automated image processing. Here, we describe how lymphoma cells treated with an anti-CD20 antibody can be analyzed real-time in human whole blood to provide quantitative cellular cytotoxicity analysis.

Echtzeit-Zytotoxizitätsassays in menschlichem Vollblut

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...

Real-time X-ray Imaging of Lung Fluid Volumes in Neonatal Mouse Lung

At birth, the lung undergoes a profound phenotypic switch from secretion to absorption, which allows for adaptation to breathing independently. Promoting and sustaining this phenotype is critically important in normal alveolar growth and gas exchange throughout life. Several in vitro studies have characterized the role of key regulatory proteins, signaling molecules, and steroid hormones that can influence the rate of lung fluid clearance. However, in vivo examinations must be performed to evaluate whether these regulatory factors play important physiological roles in regulating perinatal lung liquid absorption. As such, the utilization of real time X-ray imaging to determine perinatal lung fluid clearance, or pulmonary edema, represents a technological advancement in the field. Herein, we explain and illustrate an approach to assess the rate of alveolar lung fluid clearance and alveolar flooding in C57BL/6 mice at post natal day 10 using X-ray imaging and analysis. Successful implementation of this protocol requires prior approval from institutional animal care and use committees (IACUC), an in vivo small animal X-ray imaging system, and compatible molecular imaging software.

We present a protocol to assess the rate of alveolar fluid clearance or pulmonary edema in neonatal mouse lung using X-ray imaging technology.

Echtzeit-Röntgenbildgebung von Lungenflüssigkeitsvolumen in Neonatal Mauslunge

At birth, the lung undergoes a profound phenotypic switch from secretion to absorption, which allows for adaptation to breathing independently. Promoting ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Beurteilung von Lungenmetastasen in Maus-Mammatumormodelle durch quantitative Echtzeit-PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform extended time-lapse imaging of multicellular interactions in real time, in vivo at single cell resolution.

Erweiterte Zeitraffer-Intravital Imaging von Echtzeit-Vielzellige Dynamics im Tumormikromilieu

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...