Este protocolo es un enfoque útil para aislar virus asociados a mosquitos y puede ayudar en futuras investigaciones sobre la distribución de patógenos relacionados con los mosquitos y el control de enfermedades transmitidas por mosquitos. El uso de líneas delgadas para aislar virus en el laboratorio de nivel 2 de bioseguridad es más seguro y eficiente. A diferencia de otros procedimientos de aislamiento del virus, como la inoculación roja ciclista con fluidos variables, esta técnica no requiere experimentación animal o evaluación ética.
La contaminación de las muestras y la extracción de células durante la incubación puede llevar al fracaso del experimento. Por lo tanto, es necesario agregar 2% de penicilina-estreptomicina-anfotericina en el medio para evitar la contaminación. Comience con la adición de perlas de cerámica de tres milímetros, 1.5 mililitros de RPMI medio complementado con una solución de penicilina-estreptomicina-anfotericina B al 2% en un tubo estéril de dos mililitros colocado en hielo y luego transfiera 50 mosquitos en él.
A continuación, homogeneice los mosquitos con un homogeneizador de tejido a baja temperatura moliendo durante 30 segundos a 70 hercios y 4 grados centígrados durante 3 ciclos. Centrifugar el homogeneizado a 15, 000 G durante 30 minutos a 4 grados centígrados y transferir los sobrenadantes a los nuevos tubos. Para eliminar los restos de mosquitos por completo, centrifugar el sobrenadante nuevamente a 15, 000 G durante 10 minutos a 4 grados centígrados.
Alícuota los 200 microlitros de sobrenadante P0 en un tubo de almacenamiento de tapón de rosca de dos mililitros y guárdelo a menos 80 grados centígrados. Para la amplificación del virus, use la línea celular de mosquito deficiente en ARN C6/36 de Aedes albopictus y una línea celular de vertebrados, riñón de hámster bebé o BHK-21 de un matraz cuadrado de 75 centímetros y siembrarlos en placas de 24 pocillos por separado. Coloque la placa sembrada de 24 pozos durante la noche a 28 o 37 grados centígrados.
Al día siguiente, observe las células bajo el microscopio para confirmar una confluencia del 80 al 90% en cada pocillo. Preparar 500 mililitros del medio de mantenimiento del cultivo celular suplementado con antibióticos. Retire el medio de cultivo celular de las placas de 24 pocillos y agregue 100 microlitros del medio de mantenimiento de cultivo celular a cada pocillo.
Luego inocular las células con 100 microlitros del sobrenadante del mosquito homogeneizado o P0. Incubar las placas a 28 o 37 grados centígrados durante 60 minutos y agitar suavemente las placas después de cada 15 minutos para evitar el secado de las células. Una vez hecho esto, retire el sobrenadante y enjuague cada pozo con 600 microlitros de medio de mantenimiento de cultivo celular para eliminar los residuos por completo. A continuación, agregue 800 microlitros de medio de mantenimiento de cultivo celular a cada pocillo antes de colocar las placas en una incubadora humidificada con dióxido de carbono al 5% a 28 o 37 grados centígrados durante 7 días.
Monitoree diariamente el estado de las células de cada pocillo bajo el microscopio. En el séptimo día, recoja el sobrenadante de las células conocido como P1 y guárdelo a menos 80 grados centígrados. Repita el procedimiento para recolectar sobrenadantes virales P2 y P3.
Debido al efecto citopatogénico, o CPE, las células de algunos de los pozos mueren y se desprenden de la superficie. Para amplificar en gran medida los virus, recolecte de 300 a 400 microlitros del sobrenadante de los pozos que muestran el efecto CPE y transfiéralo a una nueva placa de seis pocillos que tenga una confluencia celular del 80 al 90% de células de cultivo. Finalmente, recoja y transfiera 500 microlitros del sobrenadante de los pocillos de la placa de seis pocillos a los tubos de almacenamiento de tapón de rosca de dos mililitros antes de almacenarlos a menos 80 grados centígrados.
La inoculación de células C6/36 con los homogeneizados de mosquitos P0 exhibió un amplio espacio intercelular en las células exfoliadas a las 120 horas después del período de infección en comparación con las células no inoculadas o control. La incubación de células BHK21 con los sobrenadantes virales P3 demostró un CPE visible a las 48 horas posteriores a la infección, mostrando la muerte de la célula y el desprendimiento de la superficie en contraste con las células de control. Se utilizaron cebadores universales disponibles comercialmente o Flavivirus, Alphaviruses y Bunyavirus para generar los productos de PCR para el sobrenadante viral.
Un producto de PCR para el Bunyavirus, el virus Ebinur Lake, se estableció como un control positivo. Las prohibiciones de amplificación por PCR en carriles pertenecientes a Bunyavirus y el control positivo destacaron la posibilidad de la presencia de Bunyavirus en los sobrenadantes. Para mejorar la tasa de éxito del aislamiento del virus, mantenga una temperatura baja durante el transporte, aislamiento y molienda de la muestra.
Agregue antibióticos al homogeneizar los mosquitos y el cultivo en sí. Y manejar el cultivo rápidamente durante la incubación y la eliminación del medio de cultivo. Además de este procedimiento, la solución de molienda se puede inyectar en un embrión de rata ciclista o pollo.
Sin embargo, el procedimiento de afirmación planteará preocupaciones éticas y aumentará el costo del experimento.
