Agradecemos a los Dres. Anthony Cornel y Laura Norris en la UC Davis y el Dr. Katharina Kreppel en la Universidad de Glasgow para proporcionar muestras de mosquitos de Tanzania. Damos las gracias a la Sra Smita Das y el Dr. Douglas Norris de la Escuela Johns Hopkins de Salud Pública para el intercambio de muestras de mosquitos de Zambia. También damos las gracias al Sr. Lee V. Millon en el Laboratorio de Genética Veterinaria para la formación en diseño de ensayo. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud de subvención R01AI 078.183 y R21AI062929.

1. Amplificación por PCR <ol><li> Mezclar todos los cebadores de PCR (Ver Tabla S1 complementario) en un microtubo de 1,5 ml. Cada SNP tiene dos primers (adelante y atrás). Asegúrese de que la concentración de reserva de cada cebador de PCR se mantiene a 100 mM. Hacer suficiente mezcla de cebadores de 500-1.000 reacciones para reducir el error y el tiempo de pipeteo en el banco (Ver Tabla S2 complementario). Si lo desea, preparar alícuotas de 100-200 reacciones por tubo y se almacena a -20 ° C. </li><li> Preparar cóctel de PCR como se describe en el protocolo del fabricante (Tabla 1). El volumen para 96 ​​reacciones incluye un voladizo de 20%. Vortex el tubo que contiene el cóctel de PCR ligeramente y centrifugar durante 30 segundos a 2.000 x g. </li><li> Dispensar 3 l de cóctel de PCR en cada pocillo de un no-bordeado placa de 96 pocillos. Una pipeta repetidor puede ahorrar tiempo para este proceso. </li><li> Añadir 2 l de ADN genómico adecuada de los mosquitos en cada pocillo. NOTA: Proceso de obtención de ADN genómico a partir de m<html> tejidos osquito (cabeza / tórax, abdomen o del cuerpo entero) se describe en otras literaturas 29-32. Elige un protocolo de extracción de ADN apropiada para diferenciar aquellos con Plasmodium en la sangre (abdomen) de los mosquitos infecciosos (Plasmodium en la cabeza / tórax). Utilizamos típicamente ADN extraído de las partes del cuerpo (cabeza / tórax o abdomen) de mosquitos, por lo que la concentración de ADN varía de 0.05-2ng / l. Aunque la entrada de ADN total es inferior a la recomendación del fabricante (5-10ng / reacción), típicamente obtenemos robusta SNP llama desde el 98% de las muestras de ADN sin amplificación de todo el genoma. </li><li> Sellar la placa, mezclar suavemente o vórtice, y centrifugar durante 1 min a 370 x g. </li><li> Utilice el siguiente protocolo termociclador para llevar a cabo la amplificación por PCR: (1) 94 ° C durante 2 min, (2) 94 ° C durante 30 seg, (3) 56 ° C durante 30 seg, (4) 72 ° C durante 1 min , (5) repetir la etapa (2) - (4) para 45 ciclos, (6) 72 ° C durante 1 min, y 4 ° C espera. </li></ol>_title &quot;&gt; 2. Tratamiento SAP <ol><li> Prepare la solución de enzima SAP en una placa de 96 pocillos (Ver Tabla 2). Procesar 96 muestras en una placa. El volumen para 96 ​​reacciones incluye un voladizo de 20%. </li><li> Vortex el tubo de solución de enzima SAP suavemente y centrifugar durante 30 segundos a 2000 x g. Dispensar 2 l de la solución de enzima SAP en cada pocillo. Una vez más, una pipeta repetidor puede ahorrar tiempo para este proceso. </li><li> Sellar la placa, mezclar suavemente o vórtice, y centrifugar durante 1 min a 370 x g. Incubar la placa de la siguiente manera: (1) 37 ° C durante 40 min, (2) 85 ° C durante 5 min para inactivar la enzima, (3) 4 ° C espera. Al finalizar este paso, la placa de almacenar a -20 ° C antes de continuar. Procese la plancha almacenado dentro de 2 semanas. </li></ol> 3. Extensión SNP <ol><li> Si la placa de muestra se congela después del tratamiento SAP, deje que se descongele a temperatura ambiente antes de proceder. </li><li> Preparar la mezcla de cebador de extensión (complementario el cuadro S2). Cada SNP tiene una exteimprimación nsion. Mantener la concentración de reserva de cada cebador de extensión a 500 mM. Opcionalmente, alícuota de 100 a 200 reacciones por tubo y almacenar a -20 ° C. </li><li> Preparar la mezcla de extensión como se describe en la Tabla 3. El volumen de reacción 96 incluye un saliente de 20%. </li><li> Vortex el tubo de cóctel de extensión a la ligera y se centrifuga durante 30 segundos a 2000 x g. Dispensar 2 l de cóctel de extensión en cada pocillo. Una vez más, una pipeta repetidor puede ahorrar tiempo para este proceso. </li><li> Sellar la placa, mezclar suavemente o vórtice, y centrifugar durante 1 min a 370 x g. Termociclo la placa como se muestra en la Figura 1. En este punto, proceda a espectrometría de masas o almacenar la placa a -20 ° C hasta 2 semanas. </li></ol> 4. Acondicionamiento de la extensión del producto SNP para optimizar el análisis de Espectrometría de Masas <ol><li> Si la placa de muestra se congela después de la extensión SNP, deje que se descongele a temperatura ambiente antes de proceder. </li><li> Transferir 15 mg de resina de su contaINER sobre la placa de depresión utilizando una cuchara alargada. Utilice el rascador para difundir la resina en los pocillos de la placa de depresión. Barra el raspador de lado a lado a través de la placa de depresión para difundir la resina. Asegúrese de que hay resina en cada pocillo. </li><li> Raspe el exceso de resina de la placa de depresión con la rasqueta. Deje que la resina de pie en la placa de hoyuelo durante al menos 20 min. Mientras que deja la resina de pie en la placa de hoyuelo, añadir 41 l de agua de grado HPLC a cada pocillo de la placa de muestra. </li><li> Con cuidado, coloque la placa de muestra al revés, sobre la placa de depresión. Asegúrese de que se restablezca el plato de muestras contra el pequeño puesto redondeado de la placa de depresión, que alinea los pozos de la placa de la muestra con los pozos de la placa de depresión. </li><li> La celebración de la placa de la muestra y la placa de depresión juntos, dar la vuelta suavemente sobre lo que la resina se cae de la placa de depresión en los pocillos de la placa de la muestra. Toque en la placa de depresión por lo que la resina se cae en la placa de muestra. Asegúrese de que toda la resina en la diplaca mple cae en los pocillos de la placa de la muestra. Centrifugar la placa a 3200 xg durante 30 seg. </li><li> Girar la placa de muestra en un aparato rotatorio durante 5 min a RT. Rotador debe girar la placa de muestra de 360 ​​° alrededor del eje largo. </li><li> Centrifugar la placa de muestras a 3.200 g durante 5 min. Después de este paso, almacenar la placa de muestra a -20 ° C hasta 2 semanas antes de proceder al siguiente paso. </li></ol> 5. MALDI-TOF espectrometría de masas <ol><li> Transferir el producto de extensión del SNP acondicionado en un BioArray tales como SpectroCHIP según las instrucciones del fabricante. Utilizamos MassArray Nanodispenser para este paso. </li><li> Una vez que se complete la transferencia, definir cómo los ensayos y las placas se van a establecer en la base de datos de ensayo. Nombre del ensayo y placas de tal manera que cada placa tiene identificador único que une al diseño específico de ensayo (Suplementario Tabla S3). </li><li> Después de ensayo y la placa se han definido, adquirir espectros utilizando un espectrómetro de masas. </li></ol><ol><li> Realizar análisis de datos utilizando un análisis en tiempo real PCR software de interpretación de datos, como Typer analizador o TyperViewer (Sequenom). Obtener datos en formato .xml que contiene el diseño de la muestra, espectrograma de masas para cada pozo, la información de marcadores incluyendo nombre, masa esperada para cada variante del SNP correspondiente, y cualquier error o mensajes de advertencia relacionados con cada reacción. Vea la Figura 2 para el espectrograma de masas resultante. </li><li> Llevar a cabo el análisis de agrupamiento SNP genotipo estableciendo el umbral de detección (magnitud o relación señal a ruido) y la tolerancia / varianza permitido para cada genotipo. La Figura 3 muestra un ejemplo de un 04707-KDR # 2 grupos de genotipo de SNP. </li><li> Exportar los resultantes llamadas SNP genotipo en un programa de hoja de cálculo. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

La MDA se compone de cinco pasos principales: la amplificación por PCR, la fosfatasa alcalina de gamba (SAP) de reacción, de extensión SNP, producto de extensión de acondicionamiento, y la matriz con ayuda de láser desorción / ionización - tiempo de vuelo (MALDI-TOF) 33-37. La primera etapa de amplificación PCR amplifica ADN que flanquea cada SNP de manera que la plantilla de ADN lo suficientemente estará disponible en la etapa de extensión de SNP. La reacción SAP neutraliza dNTPs no utilizados que...

Anopheles arabiensis, Anopheles coluzzii y Anopheles gambiae son los principales vectores responsables de la transmisión de la malaria en África 1. Estas tres especies son morfológicamente indistinguibles 2 y sólo se pueden distinguir por ensayos moleculares 3-9. Además, hay muchos ensayos posteriores realizados rutinariamente para ayudar a los estudios epidemiológicos y de genética de población. Estos incluyen (1) un ensayo de genotipado para las islas de especiación 10-12, (2) un ensayo de genotipado reconocimiento no es sinónimo SNPs en el 1014 ª posición del aminoácido codón del gen para (la resistencia knock-down, o kdr, SNP) 13 -18, (3) la detección de parásitos PCR 19-23, y (4) la detección de ADN-host específico en midguts de mosquitos 24,25. Hemos desarrollado un ensayo de detección múltiple (MDA) que combina todos estos ensayos en una reacción multiplex individual con el objetivo de unaalyzing características epidemiológicamente importantes de vectores de la malaria en África. El ensayo MDA incluye múltiples marcadores para la detección de (1) especies (A. arabiensis, A. gambiae, A. coluzzii, u otro (ninguno de los tres)), (2) resistencia a los insecticidas representado en kdr SNPs (tanto L1014F y L1014S) , (3) la presencia de dos importantes parásitos de la malaria, Plasmodium falciparum y P. vivax, y (4) fuente de sangre de uno aviar y seis huéspedes mamíferos. Tradicionalmente, estos ensayos se llevaron a cabo en reacciones en cadena de la polimerasa por separado. Cuando todos estos ensayos se realizaron utilizando una plataforma PCR convencional, se requiere la realización de 8-10 ensayos de reacción de PCR y acompañar los pasos de electroforesis en gel. Cada reacción individual PCR desde la preparación hasta que documentan los resultados toma 4-5 horas, mientras que el método de MDA se presenta aquí toma aproximadamente 5 horas en su totalidad. Esto es equivalente a un 90% de ahorro en costos de mano de obra solamente. La MDA presentó aquí cuesta $ 5por muestra para determinar el genotipo de los 33 SNPs. Esto es considerablemente menos costoso que los ensayos individuales basados ​​en gel de agarosa, que cuesta alrededor de $ 1.50 por muestra. Los ensayos que detectan todas las características cubiertas por la MDA requeriría un mínimo de 8-10 ensayos basados ​​en gel de agarosa separadas por un costo de $ 15.12 por cada muestra. Además, la MDA reduce enormemente la posibilidad de generar un falso positivo o negativo mediante la utilización de al menos tres marcadores para cada parásito o fuente de acogida de detección. La plataforma se utilizó no se limita a vectores de la malaria, pero se puede utilizar en una amplia variedad de aplicaciones tales como la medicina, medicina veterinaria, y la biología básica 26-28. Estudios en profundidad de asociación o de genética de poblaciones estudios con un gran número (con el fin de 100s) de muestras requieren ensayos de cribado rentables para varios marcadores simultáneamente. La mayoría de los estudios que utilizan dos o más ensayos de PCR separadas podrían implementar el MDA para resultados más rápidos a un costo menor. </p&gt;

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="588">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:87px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MassARRAY Analyzer Compact</td>
			<td style="width:87px;">Sequenom</td>
			<td style="width:119px;">MT9</td>
			<td>MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MassARRAY Nanodispenser</td>
			<td style="width:87px;">Sequenom</td>
			<td style="width:119px;">RS1000</td>
			<td>Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">iPLEX Gold Genotyping Reagent Set</td>
			<td style="width:87px;">Sequenom</td>
			<td style="width:119px;">10158</td>
			<td>Reagents used for iPLEX assay including SAP kit.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a multi-detection assay for malaria transmitting mosquitoes

El complejo de especies de Anopheles gambiae incluye el principal transmisores de la malaria mosquitos en África. Debido a que estas especies son de tal importancia médica, varios rasgos se caracterizan típicamente utilizando ensayos moleculares para ayudar en los estudios epidemiológicos. Estos rasgos incluyen la identificación de especies, resistencia a los insecticidas, el estado de infección del parásito, y la preferencia de acogida. Dado que las poblaciones del complejo Anopheles gambiae son morfológicamente indistinguibles, una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utiliza tradicionalmente para identificar las especies. Una vez que se conoce la especie, varios ensayos posteriores se realizan rutinariamente Para aclarar aún más características. Por ejemplo, mutaciones conocidas como KDR en un gen párrafo confieren resistencia contra el DDT y los insecticidas piretroides. Además, los ensayos de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) o ensayos de PCR de detección de ADN del parásito Plasmodium se utilizan para detectar parásitos presentes en los tejidos de mosquitos. Por último, una combinación de PCR y digestiones con enzimas de restricción se puede utilizar para dilucidar preferencia host (por ejemplo, humano frente a sangre animal) mediante el cribado de la harina de sangre de mosquitos para el ADN-host específico. Hemos desarrollado un ensayo de detección múltiple (MDA) que combina todos los ensayos mencionados anteriormente en un único 33SNPs de genotipado multiplex de reacción durante 96 o 384 muestras a la vez. Debido a que la MDA incluye múltiples marcadores para las especies, detección de Plasmodium, y la identificación de sangre anfitrión, la probabilidad de generar falsos positivos o negativos se reduce en gran medida a partir de ensayos anteriores que incluyen sólo un marcador por rasgo. Este ensayo robusto y simple puede detectar estos rasgos clave de mosquitos de manera rentable y en una fracción del tiempo de los ensayos existentes.

La identificación de especies: Los 5 SNPs siguientes juntos identifican tres especies (A. arabiensis, A. y A. gambiae coluzzii) (Tabla 4). Si una muestra no es una de las tres especies, los tres SNPs (01073-213, 04679-157 y 10313 -052) no amplifican. kdr genotipo para inferir resistencia a los insecticidas: El codón de 1014 º del canal de sodio gated-tensión ...

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Un ensayo de detección múltiple de mosquitos transmisores de malaria | Biología | Video

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

Un ensayo multi-detección para los mosquitos transmisores de la malaria

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

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13.0K vistas.  School of Veterinary Medicine, University of California - Davis. Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

Video: A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This video protocol demonstrates a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles stephensi embryos for the generation of transformed mosquitoes. Techniques for preparing microinjection needles, collecting and preparing embryos and performing the microinjection are illustrated.

Anopheles stephensi mosquitoes are vectors for malaria inhabiting India and throughout Asia. This video demonstrates the technique for performing microinjections of this species with transgenes that will confer resistance to the malaria to the mosquito. Much of the methodology demonstrated in this video is applicable to microinjection techniques of other mosquito species.

La inyección de una. Los embriones stephensi para generar la malaria resistente a los mosquitos

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

Investigación

Biología

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of the virus in the mosquito tissues. This protocol is routinely used for studying mosquito-virus interactions, especially for identification of novel host factors that are able to determine vector competence. The entire experiment must be conducted in a BSL2 laboratory. Similar to Plasmodium falciparum infections, proper attire including gloves and lab coat must be worn at all times. After the experiment, all the materials that came in contact with the virus need to be treated with 75% ethanol and bleached before proceeding with normal washing. All other materials need to be autoclaved before discarding them.

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for the dengue virus, it must be evaluated for it's role in preventing viral infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of dengue infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for growing up the virus in culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Protocolo para las infecciones de dengue en mosquitos (Aedes aegypti) y determinación de fenotipo infección

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night cycle. For this procedure, you'll need mosquito cages, 10% sterile sucrose solution, paper towels, beaker, whatman filter paper, glass feeders, human blood and serum, water bath, parafilm, distilled water, clean plastic trays, mosquito food (described below), mosquito net to cover the trays, vacuum, and a collection chamber to collect adults.

Protocol for Mosquito Rearing A. gambiae

This video illustrates the general techniques used to rear Anopheles gambiae in the laboratory. The methods for caring for laboratory mosquitoes are demonstrated through all stages of the organism's life cycle from larvae to pupae to blood-feeding adults.

Protocolo para la cría de los mosquitos (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night ...

Protocol for Plasmodium falciparum Infections in Mosquitoes and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the mosquito.    This protocol illustrates how the extent of plasmodium infections of mosquitoes can be assayed.  The techniques for preparing the gametocyte culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of plasmodium infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for preparing the gametocyte culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Protocolo de infecciones por Plasmodium falciparum en la determinación de fenotipo mosquitos y la infección

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the ...

Population Replacement Strategies for Controlling Vector Populations and the Use of Wolbachia pipientis for Genetic Drive

In this video, Jason Rasgon discusses population replacement strategies to control vector-borne diseases such as malaria and dengue. "Population replacement" is the replacement of wild vector populations (that are competent to transmit pathogens) with those that are not competent to transmit pathogens. There are several theoretical strategies to accomplish this. One is to exploit the maternally-inherited symbiotic bacteria Wolbachia pipientis. Wolbachia is a widespread reproductive parasite that spreads in a selfish manner at the extent of its host's fitness. Jason Rasgon discusses, in detail, the basic biology of this bacterial symbiont and various ways to use it for control of vector-borne diseases.

In this interview, Jason Rasgon explains the concept of genetic drive and the characteristics of an effective gene drive system. The use of the endosymbiotic bacterium, Wolbachia pipientis, as a means to spread genes through mosquito populations, is hypothesized.

Estrategias de población de repuesto para controlar las poblaciones de vectores y el uso de la Wolbachia pipientis para la unidad genética

In this video, Jason Rasgon discusses population replacement strategies to control vector-borne diseases such as malaria and dengue. "Population ...

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite.  The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite. The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocolo para ensayos de RNAi en mosquitos adultos (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Preventing the Spread of Malaria and Dengue Fever Using Genetically Modified Mosquitoes

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population replacement strategy, the idea that transgenic mosquitoes can be released into the wild to control disease transmission, is introduced, as well as the concept of genetic drive and the design criterion for an effective genetic drive system. The ethical considerations of releasing genetically-modified organisms into the wild are also discussed.

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission. Population replacement strategy, the idea that transgenic mosquitoes can be released into the wild to control disease transmission, is introduced as well as the concept of genetic drive and the design criterion for an effective genetic drive system. The ethical considerations of releasing genetically-modified organisms into the wild are also discussed.

Cómo prevenir la propagación de la malaria y el dengue Con mosquitos genéticamente modificados

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population ...

Building a Better Mosquito: Identifying the Genes Enabling Malaria and Dengue Fever Resistance in A. gambiae and A. aegypti Mosquitoes

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus infections.   Explanation is given for how key refractory genes, those genes conferring resistance to vector pathogens, are identified in the mosquito and how this knowledge can be used to generate transgenic mosquitoes that are unable to carry the malaria parasite or dengue virus.

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus infections. Explanation is given for how key refractory genes, those genes conferring resistance to vector pathogens, are identified in the mosquito and how this knowledge can be used to generate transgenic mosquitoes that are unable to carry the malaria parasite or dengue virus.

La construcción de un mosquito mejor: La identificación de los genes que permiten resistencia a la malaria y el dengue en A. gambiae y A. aegypti

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus ...

Transmitting Plant Viruses Using Whiteflies

Whiteflies, Hemiptera: Aleyrodidae, Bemisia tabaci, a complex of morphologically indistinquishable species5, are vectors of many plant viruses. Several genera of these whitefly-transmitted plant viruses (Begomovirus, Carlavirus, Crinivirus, Ipomovirus, Torradovirus) include several hundred species of emerging and economically significant pathogens of important food and fiber crops (reviewed by9,10,16). These viruses do not replicate in their vector but nevertheless are moved readily from plant to plant by the adult whitefly by various means (reviewed by2,6,7,9,10,11,17). For most of these viruses whitefly feeding is required for acquisition and inoculation, while for others only probing is required. Many of these viruses are unable or cannot be easily transmitted by other means. Therefore maintenance of virus cultures, biological and molecular characterization (identification of host range and symptoms)3,13, ecology2,12, require that the viruses be transmitted to experimental hosts using the whitefly vector. In addition the development of new approaches to management, such as evaluation of new chemicals14 or compounds15, new cultural approaches1,4,19, or the selection and development of resistant cultivars7,8,18, requires the use of whiteflies for virus transmission. The use of whitefly transmission of plant viruses for the selection and development of resistant cultivars in breeding programs is particularly challenging7. Effective selection and screening for resistance employs large numbers of plants and there is a need for 100% of the plants to be inoculated in order to find the few genotypes which possess resistance genes. These studies use very large numbers of viruliferous whiteflies, often several times per year.
Whitefly maintenance described here can generate hundreds or thousands of adult whiteflies on plants each week, year round, without the contamination of other plant viruses. Plants free of both whiteflies and virus must be produced to introduce into the whitefly colony each week. Whitefly cultures must be kept free of whitefly pathogens, parasites, and parasitoids that can reduce whitefly populations and/or reduce the transmission efficiency of the virus. Colonies produced in the manner described can be quickly scaled to increase or decrease population numbers as needed, and can be adjusted to accommodate the feeding preferences of the whitefly based on the plant host of the virus.
There are two basic types of whitefly colonies that can be maintained: a nonviruliferous and a viruliferous whitefly colony. The nonviruliferous colony is composed of whiteflies reared on virus-free plants and allows the weekly availability of whiteflies which can be used to transmit viruses from different cultures. The viruliferous whitefly colony, composed of whiteflies reared on virus-infected plants, allows weekly availability of whiteflies which have acquired the virus thus omitting one step in the virus transmission process.

Improving our understanding of and our ability to manage many of the insect-transmitted plant viruses requires the use of the vector. Insect transmission of plant viruses is a tritrophic interaction, and as such requires the manipulation of insects, virus, and plant. Vectors must be reared in large numbers and manipulated in such a way as to insure high rates of transmission to test plants. The basics of rearing and manipulating the whitefly, Bemisa tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), a vector of plant viruses belonging to several emerging plant virus genera, representing a large number of economically significant viruses is presented.

La transmisión de los virus de plantas usando moscas blancas

Whiteflies, Hemiptera: Aleyrodidae, Bemisia tabaci, a complex of morphologically indistinquishable species5, are vectors of many plant viruses. Several ...

Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making malaria control an omnipresent problem in tropical countries. The emergence of insecticide resistant populations warrants the exploration of novel drug target pathways and compounds for vector mosquito control. Epigenetic drugs are well established in cancer research, however not much is known about their effects on insects. This study provides a simple protocol for examining the toxicological effects of 3-Deazaneplanocin A (DZNep), an experimental epigenetic drug for cancer therapy, on the malaria vector, Anopheles gambiae. A concentration-dependent increase in mortality and decrease in size was observed in immature mosquitoes exposed to DZNep, whereas the compound reduced the fecundity of adult mosquitoes relative to control treatments. In addition, there was a drug-dependent decrease in S-adenosylhomocysteine (SAH) hydrolase activity in mosquitoes following exposure to DZNep relative to control treatments. These protocols provide the researcher with a simple, step-by-step procedure to assess multiple toxicological endpoints for an experimental drug and, in turn, demonstrate a unique multi-prong approach for exploring the toxicological effects of water-soluble epigenetic drugs or compounds of interest against vector mosquitoes and other insects.

A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition.

Los ensayos toxicológicos para efectos de prueba de un epigenética de Drogas sobre el Desarrollo, Fecundidad y Sobrevivencia de los mosquitos de malaria

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making ...