Este trabajo fue financiado parcialmente por el Poder Reproductiva del Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano (NICHD - R21 HD059015) y el Premio Charles H. Hood Foundation Niño Pequeño Investigador Investigación en Salud (Boston, MA).

1. Mutagénesis dirigida de secuencia altamente rica en GC gen KISS1R <ol><li> Plantilla: secuencia completa de ADNc de la KISS1R humanos con Myc-tag fusionada a su extremo N-terminal. Esta secuencia se clonó en el vector de expresión pCS2 +, que es compatible con las líneas de células de mamíferos utilizan posteriormente para la transfección. Este vector de expresión se hace referencia en este documento como pCS2 KISS1R + Myc. </li><li> Diseño de la cartilla: primers están diseñados para llevar a mutaciones deseadas, de acuerdo a las instrucciones del kit QuikChange mutagénesis dirigida (Stratagene). En resumen: <ul><li> Los dos primers (adelante y atrás) debe contener la mutación deseada y recocido a la misma secuencia en cadenas opuestas del plásmido (por ejemplo, hacia adelante y atrás primers son complementarias entre sí) <img src="/files/ftp_upload/2897/step1.jpg" alt="Paso 1" /></li><li> Cebadores debe ser de 25 a 45 bases de largo y al final en una o más C o bases G <img src="/files/ftp_upload/2897/step2.jpg" alt="Paso 2" /> <img src="files/ftp_upload/2897/step3.jpg" alt="Paso 3" /></li><li> Mutación introducida (s) deben estar en el medio de imprimación y flanqueado por ~ 10-15 bases de la secuencia correcta en ambos lados </li><li> Temperatura de fusión (Tm) de los cebadores debe ser igual o superior a 78 ° C. Utilice las siguientes fórmulas para calcular Tm: <ul><li> Cuando la introducción de mutaciones: Tm = 81.5 + 0.41 (% GC) - 675 / N - desajuste% (N es la longitud de imprimación en las bases) </li><li> En la introducción de inserciones o deleciones: Tm = 81.5 + 0.41 (% GC) - 675 / N (N no incluye las bases que se insertan o se eliminan) </li><li> Use cebos desalado (sin purificación adicional necesaria). <img src="/files/ftp_upload/2897/step4.jpg" alt="Paso 4" /></li></ul></li></ul></li><li> Las mejores condiciones de amplificación incluyen la adición de PCRx reforzador solución (Invitrogen) y DMSO. Por lo menos dos concentraciones de DMSO, tales como el 4% y 8%, debe ser probado. Las condiciones de PCR se muestran en la Tabla I y en la Figura 1, y los resultados de un representante de la amplificación por PCR de pCS2 + MycKISS1R se muestra en la Figura 2. </li><li> Eliminar el ADN de los padres en los productos de amplificación por la digestión de ADN metilado con DpnI de 1h 30min a 37 ° C: mezclar en un tubo de centrífuga 17.5μl de producto de PCR con 2μl de NEBuffer 10x 4 y 0.5μl de DpnI (10U, New England Biolabs). </li><li> Transformar DpnI tratados con productos PCR: 2μl mezcla de DpnI tratados con ADN con 45μl de XL10-Gold Ultracompetent E. coli (Stratagene) en pre-enfriado tubo de 15 ml de cultivo de células. Añadir 2μl de β-mercaptoetanol y seguir las instrucciones de Stratagene. Placa 100-400μl de bacterias transformadas en placas de agar LB que contienen ampicilina 100μg/ml e incubar a 37 ° C. </li><li> Miniprep 2-4 colonias individuales para aislar el ADN del plásmido. Confirmar la introducción exitosa de mutaciones deseadas mediante la secuenciación y el análisis de ADN aislado. </li></ol> 2. Transfección transitoria de MycKISS1R en células HEK-293 <ol><li> Los siguientes experimentos se llevan a cabo en células humanas de riñón embrionario (HEK-293) cultivadas en una incubadora de CO 2 (5% CO 2) a 37 ° C en DMEM complementado con un feto de 10% de suero bovino (SFB) y 1% de penicilina / estreptomicina. </li><li> Semillas de células HEK-293 a 2.5x10 5 células / ml en placas de 6 pocillos y dejar que crezcan durante la noche a 37 ° C antes de la transfección. NOTA: (i) el uso de pozos por triplicado para cada condición experimental, (ii) la confluencia celular ideal en el momento de la transfección es de 30% -50%. </li><li> Transfectar células HEK-293 usando el reactivo de transfección GenePorter (Genlantis), de acuerdo con las instrucciones del fabricante: la mitad de la mezcla de la DMEM libre de suero con 0.5μg pCS2 + MycKISS1R más control 0.5μg (vacío) vector para totalizar 1 g de ADN / pozo. Mezclar la otra mitad con el reactivo de transfección 10μl por ug de ADN transfectadas. NOTA: La concentración Ideal ADN plásmido puede variar. </li></ol> 3. Tratamiento de células y la lisis <ol><li> 24 horas después de la transfección, reemplace medio celular con 1 ml DMEM conteniendo FBS 2,5% (para disminuir el metabolismo de las células). NOTA: Esta disminución en el suero puede facilitar y / o ampliar la detección de los resultados. </li><li> Añadir inhibidor lisosoma (100 microgramos / pocillo de leupeptina) directamente en cada pozo de un total de 6 pocillos. Se incuba a 37 ° C durante 6 o 16 h (o en otras ocasiones se desea) </li><li> Añadir recién preparados inhibidores del proteasoma (10μM / pocillo de MG132) directamente en todos los pozos de dos entero placas de 6 pocillos. Se incuba a 37 ° C durante 2, 4, 6 o 16 horas (o momento que se desee). Añadir vehículos a todos los pocillos de la cuarta placa de 6 pocillos (0 punto del tiempo) y se incuba a 37 ° C durante 16 horas </li><li> Cuando la incubación es más, se mueven las placas de hielo y llevar a cabo este procedimiento de lisis completa en hielo para evitar la degradación de proteínas: <ul><li> Para aumentar la producción de proteínas, se combinan los triplicados en placas de 6 pocillos en un centr solaifuge tubo </li><li> Aspirar las células medianas y lavar una vez con 1 ml de helado de buffer fosfato salino (PBS) </li><li> Agregar 100μl de helado de buffer de lisis (20 mM HEPES, pH 7,4, 1% NP-40, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,25% de desoxicolato de sodio) que contienen inhibidores de la proteasa (1x cóctel que contiene 100 mM AEBSF-HCl, 80μM aprotinina, bestatin 5mM, 1,5 mM E-64, 0,5 M EDTA, 2 mM y 1 mM leupeptina pepstatina A, 2 mM PMSF más) a cada pocillo </li><li> Eliminar las células con un rascador de células y de transferencia de células lisados ​​a tubos de centrífuga </li><li> Pasar las células ~ 10 veces a través de una aguja de calibre 20. NOTA: No sonicar muestras para la detección de Western blot de proteínas de membrana. Sonicación conduce a la agregación de proteínas de membrana, que no se migran correctamente durante la electroforesis </li><li> Incubar lisados ​​celulares durante 1 hora a 4 ° C sobre una plataforma oscilante </li><li> Lisados ​​centrifugar células a 4 ° C durante 10 minutos a 10.000 rpm y el sobrenadante x transferencia a nuevos tubos. NOTA: No molestar pellets durante esta etapa </li><li> Determinar la concentración de proteínas en 10μl de sobrenadantes utilizando el método BCA (Pierce) </li><li> Diluir lisados ​​de 1mg/ml con tampón de lisis que contiene inhibidores de la proteasa. </li></ul></li></ol> 4. Inmunoprecipitación y la detección de Western blot de MycKISS1R <ol><li> Realice los pasos siguientes inmunoprecipitación en el hielo (o menos 4 ° C): <ul><li> Lave la cantidad adecuada de agarosa conjugada con anticuerpos anti-myc (2.5μg / muestra) dos veces con helado de PBS y añadir esto a 400μg de proteína lisado. </li><li> Inmunoprecipitar la MycKISS1R en lisados ​​de la noche a 4 ° C en una plataforma de balanceo con una suave agitación. </li><li> Decantar perlas de agarosa por centrifugación pulso a 4 ° C (hasta 10.000 rpm x) </li><li> Aspirar y desechar sobrenadantes (sin molestar a los pellets) </li><li> Lávese las cuentas de una vez con helado de buffer de lisis y dos veces con helado de PBS. Invertir suavemente los tubos antes de hacer girar </li><li> Cuentas Ressuspend contiene anticuerpo-limite MycKISS1R en tampón 2x ​​carga de la muestra que contiene 10% de β-mercaptoetanol. </li></ul></li><li> Western blot de inmunocomplejos MycKISS1R: <ul><li> Muestras de calor durante 30 minutos a 37 ° C. Nota: No hierva muestras para la detección de Western blot de proteínas de membrana. Como ultrasonidos, hirviendo también conduce a la agregación de estas proteínas </li><li> Mover los tubos de inmediato en hielo durante 5 min </li><li> Proteínas separadas por SDS-PAGE en un gel de gradiente de 4-15%. </li><li> Traslado al Immobilon-FL membrana de PVDF (por infrarrojos de detección) a 25V durante 30 minutos en tampón de transferencia (Tris base 48 mm, 39 mm de glicina, 1,2 SDS, 20% de metanol, pH 9,2) utilizando el Bio-Rad semi-seco de transferencia aparato </li><li> Lave las membranas durante 5 minutos a temperatura ambiente con Tris-Buffered Saline (TBS) y el bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente con Odyssey Licor de bloqueo en una plataforma oscilante (alternativamente, 5% de leche en TBS puede ser utilizada para bloquear la unión no específica). </li><li> Las membranas se incuban durante la noche a 4 ° C con conejo anti-myc anticuerpos (1:500) en solución de bloqueo conteniendo 0,1% Tween-20 </li><li> Eliminar el anticuerpo primario y lavar las membranas 3 veces de 5 minutos cada uno con TBS que contiene 0,1% de Tween-20 (TBST) </li><li> Incube las membranas durante 1 hora a temperatura ambiente con la cabra Infra-800CW RedDye ® marcado anti-IgG de conejo (1:10.000) en tampón de bloqueo que contiene 0,1% de Tween-20 y 0,01% de SDS </li><li> Eliminar el anticuerpo secundario, lavar las membranas 3 veces de 5 minutos cada uno con TBST y una última vez con TBS sólo (para eliminar el resto de Tween-20) </li></ul></li><li> Imágenes y la cuantificación de MycKISS1R con el LI-COR Odyssey Infra-Red Imager: <ul><li> El MycKISS1R en las membranas se creará una imagen utilizando el LI-COR Odyssey Infra-Red Imager. Para comenzar, coloque la membrana en la esquina inferior izquierda del escáner Odyssey, alineándola con la red. Cubrir con la alfombrilla de goma, suavizar las burbujas con el rodillo y cierre la tapa </li><li> Crear un nuevo archivo de proyecto en el equipo. El nombre del archivo, haga clic en &quot;hacer&quot;, y luego entrar en la sesión de escaneado en la &quot;exploración&quot;. El tamaño de la caja de la consola escáner para adaptarse a su membrana, y luego elegir una resolución de 169μm y calidad de imagen medio </li><li> Elija los valores de intensidad de 700 (rojo) y 800 (verde) de canales de acuerdo con la fuerza esperada de cada señal. Esto es para fines de visualización de la señal y no va a influir en la cuantificación. Haga clic en &quot;Start Scan&quot; </li><li> Nombre y guardar el escaneo, haga clic en &quot;OK&quot; para abrirlo en una nueva ventana para la cuantificación. Monómeros MycKISS1R deben ser visibles en aproximadamente 43kD </li><li> Usando la &quot;caja&quot; de la herramienta (en la barra lateral izquierda), dibuje un cuadro alrededor de la primera banda. Arrastre el cuadro de alrededor para asegurarse de que todas las bandas de encajar, entonces &quot;copiar&quot; y &quot;pegar&quot; la caja sobre todas las bandas </li><li> Seleccione todas las casillas con &quot;Ctrl + A&quot;, y luego seleccione la opción de restar el fondo mediana. Haga clic en &quot;informe&quot; en el menú superior y una hoja de cálculo con los valores de cuantificación aparecerá. Los resultados representativos se muestran aquí son represented como doble-aumento en las células no tratadas (tiempo cero) </li></ul></li></ol> 5. Los resultados representativos: <ol><li> Mutagénesis dirigida de secuencia altamente rica en GC gen KISS1R: Tabla 1. Muestra la combinación de reactivos para mejorar la eficiencia de la amplificación KISS1R. Esta combinación se ha utilizado con éxito para introducir varias mutaciones dirigidas en contra de las distintas regiones de la secuencia de cDNA KISS1R, así como para la amplificación de este gen altamente rica en GC. La figura 1 muestra las condiciones del ciclo y la amplificación de la mutagénesis del KISS1R. Estas condiciones se han modificado desde el QuikChange kit de mutagénesis dirigida (Stratagene). Figura 2. Muestra un resultado representativo de usar este protocolo optimizado. La adición de DMSO al 4% o el 8% combinado con el reforzador PCRx mejora significativamente el rendimiento de la amplificación de la GC-ricos KISS1R cDNA que contienen el plásmido. En este experimento representativo, el 4% DMSO siempre un poco mejor las condiciones de amplificación en comparación con el 8% de DMSO. Transformación de los productos de amplificación DpnI tratados con ultracompetent E. coli produce normalmente de 100 a más de 1.000 colonias, y la tasa de introducción con éxito de mutaciones deseadas es del 80-90% según lo determinado por la secuenciación del ADN. </li><li> El uso de las construcciones MycKISS1R para estudiar la fisiología de los receptores: En este experimento representativo, el tipo salvaje pCS2 + MycKISS1R amplificado de acuerdo con el protocolo optimizado se describe aquí se utiliza para estudiar la degradación in vivo del receptor de KISS1 en una línea celular correspondiente (HEK-293) que expresan transitoriamente MycKISS1R. Después de tratar el transfectaron células HEK-293 con el lisosoma (leupeptina) o del proteasoma (MG132) inhibidores de acuerdo con el protocolo descrito en los métodos, las células son lisadas y procesadas para Western blot. El panel superior de la Figura 3 se muestra la exploración de los monómeros MycKISS1R mientras que el panel de abajo muestra la cuantificación de las bandas se muestra en el panel superior. La cuantificación de las bandas indica que ninguno de 6h ni 16h de tratamiento leupeptina afectado los niveles de proteína MycKISS1R. Por el contrario, el tratamiento con MG132 como resultado un incremento en función del tiempo en proteínas MycKISS1R en estas células, que culmina con una acumulación de 45 veces del receptor después de 16 horas de incubación con MG132. Estas observaciones indican que, a diferencia de la mayoría de los G receptores acoplados a proteínas, KISS1R se degrada por el proteasoma (en lugar de los lisosomas). </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td> DMSO </td><td></td></tr><tr><td> Reactivos </td><td> 0 </td><td> 4% </td><td> 8% </td></tr><tr><td> De agua </td><td> 35 </td><td> 33 </td><td> 31 </td></tr><tr><td> 10x Pfu ultra buffer Taq </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Mezcla de dNTP (10 mM) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Primer sentido (25pmol/μl) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Primer antisentido (25pmol/μl) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 10x PCRx Reforzador Solución </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 0 </td><td> 2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ufp ultra Taq polimerasa (2.5U/μl) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ADN plásmido (20ng/μl) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Combinación de reactivos utilizado con éxito para mutar y amplificar la KISS1R rica en GC <img src="/files/ftp_upload/2897/2897fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Las condiciones del ciclo de mutagénesis éxito y la amplificación de GC-ricos KISS1R: Un arranque en caliente 2 minutos fue seguido por 18 ciclos de 30 segundos de fusión a 95 ° C, 1 min recocido a 55 ° C min de extensión y 6 a 68 ° C. Una extensión adicional de 10 min a 68 ° C se añadió al final del último ciclo. Estos valores se ajustaron al protocolo original de la mutagénesis QuikChange II kit XL-mutagénesis dirigida (Stratagene). <img src="/files/ftp_upload/2897/2897fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Visualización del GC-ricos pCS2 + Myc KISS1R amplificado en la presencia o ausencia de DMSO: cinco alícuotas de pCS2 + KISS1R Myc amplificado en la presencia de 0, 4 u 8% de DMSO fueron cargados en este representante de 1% en gel de agarosa teñido con etidio bromuro y se visualiza la luz UV usando. Las bandas de plásmido de 6Kb son visibles en ambos carriles cargados con productos de amplificación de PCR en presencia de un 4% y 8% de DMSO, pero no en la primera calle, que estaba cargado con una PCRproducto amplificado en la ausencia de DMSO. <img src="/files/ftp_upload/2897/2897fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Efecto de la leupeptina o MG132 en los niveles de proteína Myc KISS1R en células HEK-293: HEK-293 células que expresan Myc KISS1R fueron tratados con 100μg/ml leupeptina o 10μM MG132 a 37 ° C durante las horas designadas. Myc KISS1R de 400μg de lisado celular se immunoprecipitated con 2.5μg de agarosa conjugada con anticuerpos anti-myc y analizada por Western blot. (A) LI-COR Odyssey detección de KISS1R Myc después de la incubación de immunoblots con conejo anti-Myc-tag anticuerpos seguido de incubación con IRDye 800CW marcado anti-conejo (B) Cuantificación de las bandas KISS1R Myc se muestra en (A) mediante la LI-COR Odyssey software de cuantificación. Los resultados se representan como doble-aumento en las células no tratadas (tiempo 0).

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No hay conflictos de interés declarado.

Mutagénesis dirigida se ha utilizado para estudiar la función de proteínas mediante la introducción de cambios de nucleótidos en la secuencia de codificación de los genes blanco de más de tres décadas. La técnica original fue descrita en 1978 por el químico británico-canadiense y ganador del Premio Nobel Michael Smith 10. Michael Smith compartió el 1993 Premio Nobel de Química con Kary Mullis, el bioquímico estadounidense que inventó la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 11. ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> 10x PCRx Reforzador Solución </td><td> Invitrogen </td><td> 52391 </td></tr><tr><td> PfuUltra de alta fidelidad de la polimerasa de ADN Alternativa detergente </td><td> Stratagene </td><td> 600385 </td></tr><tr><td> DPN-I </td><td> New England Biolabs </td><td> R0176 </td></tr><tr><td> XL10-Gold Ultracompetent E. células de E. coli </td><td> Stratagene </td><td> 200314 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 10 a 013 CV </td></tr><tr><td> De suero fetal bovino </td><td> Atlanta Productos Biológicos </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> Geneporter Transfection Reagent </td><td> Genlantis </td><td> T201007 </td></tr><tr><td> Leupeptina </td><td> Calbiochem </td><td> 108975 </td></tr><tr><td> MG132 </td><td> Calbiochem </td><td> 47491 </td></tr><tr><td> 10xPBS </td><td> Ambion </td><td> AM9625 </td></tr><tr><td> Cóctel de inhibidores de la proteasa y PMSF </td><td> Santa Cruz de Biotecnología </td><td> Sc-24948 </td></tr><tr><td> Pierce BCA Protein Kit de ensayo </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23225 </td></tr><tr><td> anti-Myc etiqueta (clon 4A6) de agarosa conjugada </td><td> Millipore </td><td> 16-219 </td></tr><tr><td> 2x tampón de carga </td><td> BioRad </td><td> 161-0737 </td></tr><tr><td> Criterio de Tris-HCl prefabricados gel, 4.15% de gradiente </td><td> BioRad </td><td> 345-0028 </td></tr><tr><td> Immobilon-FL membrana de PVDF </td><td> Millipore </td><td> IPFL00010 </td></tr><tr><td> Odyssey tampón de bloqueo </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 927-40000 </td></tr><tr><td> 10xTBS </td><td> BioRad </td><td> 170-6435 </td></tr><tr><td> Conejo anti-myc anticuerpos </td><td> Señalización celular </td><td> 2272 </td></tr><tr><td> Cabra anti-conejo IRDye 800CW </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 926-32211 </td></tr><tr><td> Imagen infrarroja del sistema Odyssey </td><td> LI-COR Biosciences </td><td></td></tr><tr><td> Proteasa Inhibidor de detener Cocktail (100 veces) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 78430 </td></tr></tbody></table>

mutagenesis and analysis of genetic mutations in the gc-rich kiss1 receptor sequence identified in humans with reproductive disorders

El receptor de kisspeptina (KISS1R) es una proteína G-receptor acoplado reconocido como el desencadenante de la pubertad y un regulador de la competencia reproductiva en la edad adulta 1,2,3. Inactivación de las mutaciones en KISS1R identificados en los pacientes han sido asociados con el hipogonadismo hipogonadotrópico iodiopathic (IHH) 1,2 y la pubertad precoz 4. Estudios funcionales de estos mutantes son cruciales para nuestra comprensión de los mecanismos que subyacen a la regulación de la reproducción de este receptor, así como los que dan forma los resultados de la enfermedad, que resultan de la señalización KISS1R anormal y la función. Sin embargo, la secuencia altamente rica en GC del gen KISS1R hace que sea bastante difícil de introducir mutaciones o amplificar el gen que codifica este receptor por PCR. Aquí se describe un método para introducir mutaciones de interés en esta secuencia muy rica en GC que ha sido utilizado con éxito para generar más de una docena de mutantes KISS1R en nuestro laboratorio. Hemos optimizado las condiciones de PCR para facilitar la ampliación de una serie de mutantes KISS1R que incluyen sustituciones, eliminaciones o inserciones en la secuencia KISS1R. La adición de una solución de PCR potenciador, así como de un pequeño porcentaje de DMSO fueron especialmente útiles para mejorar la amplificación. Este procedimiento optimizado puede ser útil para otros GC-ricos y plantillas. El vector de expresión que codifica la KISS1R se ha utilizado para caracterizar la señalización y la función de este receptor con el fin de entender cómo las mutaciones pueden cambiar KISS1R función y llevar a los fenotipos asociados reproductiva. En consecuencia, las posibles aplicaciones de los mutantes KISS1R generado por mutagénesis dirigida se puede ilustrar con muchos estudios 1,4,5,6,7,8. A modo de ejemplo, la mutación de ganancia de función en el KISS1R (Arg386Pro), que está asociada con la pubertad precoz, se ha demostrado que prolonga la capacidad de respuesta del receptor a la estimulación ligando 4, así como para alterar la velocidad de degradación de KISS1R 9 . Curiosamente, nuestros estudios indican que KISS1R se degrada por el proteasoma, a diferencia de la degradación lisosomal clásicos descritos para la mayoría de G receptores acoplados a proteínas 9. En el ejemplo que aquí se presenta, la degradación de la KISS1R se investiga en células de riñón embrionario humano (HEK-293) que expresan transitoriamente Myc-etiquetados KISS1R (MycKISS1R) y tratados con inhibidores del proteasoma o lisosomas. Lisados ​​celulares se immunoprecipitated agarosa usando un conjugado de anticuerpos anti-myc seguido por análisis de Western blot. Detección y cuantificación de MycKISS1R en transferencias se realiza mediante el sistema Odyssey LI-COR infrarrojos. Este enfoque puede ser útil en el estudio de la degradación de otras proteínas de interés.

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Mutagenesis and Analysis of Genetic Mutations in the GC-rich KISS1 Receptor Sequence Identified in Humans with Reproductive Disorders

Las mutaciones en el receptor kisspeptina (KISS1R) se asocian con trastornos de la reproducción en los pacientes. A continuación se describe la forma de introducir las mutaciones de interés en la secuencia rica en GC de KISS1R, así como el uso de construcciones KISS1R para caracterizar la vía de degradación del receptor por inmunoprecipitación y Western Blot

Mutagénesis y análisis de mutaciones genéticas en la secuencia del receptor GC-ricos KISS1 identificado en el hombre con Trastornos del aparato reproductor

The kisspeptin receptor (KISS1R) is a G protein-coupled receptor recognized as the trigger of puberty and a regulator of reproductive competence in ...

mutagenesis-analysis-genetic-mutations-gc-rich-kiss1-receptor

Research

JoVE Journal

Biology

13.9K vistas.  University of Miami Miller School of Medicine. Las mutaciones en el receptor kisspeptina (KISS1R) se asocian con trastornos de la reproducción en los pacientes. A continuación se describe la forma de introducir las mutaciones de interés en la secuencia rica en GC de KISS1R, así como el uso de construcciones KISS1R para caracterizar la vía de degradación del receptor por inmunoprecipitación y Western Blot

Video: Mutagenesis and Analysis of Genetic Mutations in the GC-rich KISS1 Receptor Sequence Identified in Humans with Reproductive Disorders

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

Ensayo de inducción neural en el embrión de pollo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Investigación

Biología

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

Cultura primaria y electroporación plásmido del órgano de Corti murino.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagénesis y análisis funcional de los canales iónicos heteróloga se expresa en células de mamífero

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Usar secuencias de detención SecM como una herramienta para aislar Ribosome polipéptidos enlazados

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

El análisis genético rápido de epitelio-mesenquimal de señalización durante la regeneración del cabello

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

Culturas alternativas para Pluripotentes Stem Cell Production, mantenimiento y análisis genético

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

-Alta resolución de imagen de lapso de tiempo y análisis automatizado de los microtúbulos en la dinámica de estar umbilical humana Las células endoteliales de vena

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

Los enfoques genéticos y bioquímicos para<em&gt; En Vivo</em&gt; y<em&gt; In Vitro</em&gt; Evaluación de la oligomerización de proteínas el receptor de rianodina Estudio de caso

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Análisis de una sola partícula de código abierto para el Super-resolución Microscopía con VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust technologies that measure RNA biomarkers in situ in clinical specimens. While grind-and-bind assays like RNAseq and quantitative RT-PCR enable highly sensitive gene expression measurements, they also require RNA extraction and thus prevent valuable expression analysis within the morphological tissue context. The in situ hybridization (ISH) assay described here can detect RNA target sequences as short as 50 nucleotides at single-nucleotide resolution and at the single-cell level. This assay is complementary to the previously developed commercial assay and enables sensitive and specific in situ detection of splice variants, short targets, and point mutations within the tissue. In this protocol, probes were designed to target unique exon junctions for two clinically important splice variants, EGFRvIII and MET&#916;14. The detection of short target sequences was demonstrated by the specific detection of CDR3 sequences of T-cell receptors &#945; and &#946; in the Jurkat T-cell line. Also shown is the utility of this ISH assay for the distinction of RNA target sequences at single-nucleotide resolution (point mutations) through the visualization of EGFR L858R and KRAS G12A single-nucleotide variations in cell lines using automated staining platforms. In summary, the protocol shows a specialized RNA ISH assay that enables the detection of splice variants, short sequences, and mutations in situ for manual performance and on automated stainers.

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Here, we describe an in situ hybridization assay which enables sensitive and specific detection of sequences as short as 50 nucleotides with single-nucleotide resolution at the single-cell level. The assay, which can be performed manually or automatically, can enable visualization of splice variants, short sequences, and mutations within the tissue context.

Visualización de variantes genéticas, metas cortas y mutaciones puntuales en el contexto morfológico del tejido con un ensayo de ARN In Situ hibridación