Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Británica del Corazón a SZ (FS / 08/063 y FS / 15/30/31494).

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Los autores no tienen nada que declarar.

La formación de proteínas homo-oligómeros es un proceso biológico fundamental que regula la actividad de factores de transcripción, enzimas, canales iónicos y los receptores 25,26. Es importante destacar que, oligomerización proteína tiene también implicaciones patológicas incluyendo la neurodegeneración y la enfermedad cardiaca arritmogénica 4,27. Las metodologías descritas en este artículo se utilizan para identificar dominio de dominio interacciones proteína que median la auto-asociación y oligomerización. A continuación, señalamos en las etapas decisivas dentro de cada protocolo, y se discute consideraciones importantes, limitaciones y solución de problemas. El sistema Y2H puede ser empleado por primera vez para la detección de potenciales socios de interacción de proteínas, debido a su relativamente cribado de alto rendimiento, facilidad de uso y resultados altamente reproducibles. Y2H procedimientos se llevan a cabo en un laboratorio de microbiología con incubadoras estándar (placa o agitador) y las instalaciones de contención habitación. El uso de frLas células competentes preparadas eshly (paso 1.1.8) es fundamental para la transformación de levadura de alta eficiencia, mientras que para obtener los mejores resultados en los ensayos de β-Gal, colonias de levadura recién crecido (hasta 5 días de edad) se debe utilizar (paso 1.2.3). Los sistemas basados ​​en factores de transcripción distintos de GAL4 y / o genes indicadores adicionales / alternativas están disponibles, y por lo tanto plásmidos cebo y presa deben corresponderse con la cepa Y2H apropiado. Algunas cepas deben ser cultivadas en presencia de 3-amino-1,2,4-triazol, un inhibidor competitivo de la proteína HIS3, con el fin de apagar cualquier expresión constitutiva del gen indicador HIS3 7,8. La expresión de proteínas de fusión de cebo y de destino debe ser verificada mediante inmunotransferencia 17. En caso de cebo / proteínas de fusión de presa son tóxicos para la levadura, los niveles de proteína inferior tolerables podrían alcanzarse mediante la clonación de vectores en diferentes donde cebo / presa expresión es conducida por un promotor diferente. Además, es esencial para asegurar tLas proteínas de fusión de cebo / presa sombrero no muestran la actividad del gen reportero autónomo. la activación del gen indicador autónoma puede ser rescatado mediante la modificación de la construcción para eliminar la región responsable, o mediante el canje de la GAL4 DNA-BD y AD fusiones de las dos proteínas de la prueba. Por otra parte, los dominios transmembrana están mejor omiten de construcciones cebo / presa, ya que pueden inducir o mal plegamiento de proteínas de fusión mislocalization en compartimentos intracelulares de membrana. De hecho, la principal desventaja del sistema de Y2H es que las proteínas de cebo y de destino se localizan en el núcleo de levadura lejos de su localización subcelular fisiológica y, potencialmente, que carecen de modificaciones post-traduccionales específicas, lo que resulta en las interacciones falsos positivos o falsos negativos 6-9 . De mamíferos Los sistemas de expresión heterólogos son más adecuados para el estudio de proteínas integrales de membrana de mamíferos en los términos de conformación, modificaciones post-traduccionales y la localización subcelular.Uno de los métodos de transfección celular más ampliamente utilizada es la precipitación con fosfato cálcico, principalmente debido a los equipos mínimos y reactivos requeridos 11,15. Los métodos alternativos, a saber, la electroporación, liposomas, lípidos catiónicos y polímeros, pueden ofrecer una mayor eficiencia de la transfección dependiendo de la línea celular y construcción utilizada. En general, los factores principales que afectan la eficiencia de transfección son la calidad del ADN de plásmido y células de la salud / viabilidad. Los mejores resultados se obtienen cuando se utilizan ADN de plásmido de la más alta pureza (relación de absorbancia 260 nm / 280 nm de ~ 1,8) y las células que se dividen activamente. Por lo tanto, las células deben ser transfectadas a no más de 60-70% de confluencia (etapa 2.1.2), debido a que la capacidad de absorción de ADN extraño se relaciona con el área de superficie de la célula expuesta al medio 11. Además, la inclusión de antibióticos en el medio de cultivo durante la transfección (etapa 2.1.3) no se recomienda debido al aumento de la muerte celular 15. Fo precipitación de fosfato de calcio, en particular, una cuidadosa preparación y ajuste del pH (a 7,05 precisamente) de la solución de 2x HBS (etapa 2.1.1) y la formación adecuada de plásmido de ADN / calcio / complejos de fosfato por mezcla vigorosa (etapa 2.1.5) son pasos críticos para la transfección de alta eficiencia. Por lo general, la expresión de proteínas por picos de transfección transitoria dentro de 24 - 72 h. Una vez que se recogieron las células, los procedimientos subsiguientes deben llevarse a cabo a 4 ° C para minimizar la actividad de proteasa, y se recomienda la adición de inhibidores de la proteasa. la homogeneización de la célula debe ser seguido por una etapa de centrifugación para eliminar los núcleos porque el ADN cromosómico puede aumentar la viscosidad de solución y mejorar la unión no específica. Por lo tanto, se prefiere la homogeneización por medios mecánicos en un tampón iso-osmótica, por lo general en sacarosa (0,3 M) o (150 mM) NaCl. En general, se conocen tampones a base de sacarosa para mejorar la estabilidad de proteínas y reducir el potencial de agregación de proteínas no nativas, pero debido a phidratación de referencia en la superficie de la proteína, interacciones proteína-proteína electrostáticos son favorecidos. Por el contrario, los tampones a base de sal influyen en la carga neta de los grupos laterales de aminoácidos cargados en la superficie de la proteína, por lo tanto tener un sesgo hacia las interacciones más basado en hidrófobas 28. Co-IP es el ensayo bioquímico más comúnmente empleado para evaluar las interacciones proteína-proteína especialmente de tejido nativo. Su principal inconveniente es la necesidad de anticuerpos altamente específicos validados para su uso en IP e inmunotransferencia 10,16,18. Así, las proteínas recombinantes a menudo son etiquetados con un epítopo de péptido, por ejemplo., Hemaglutinina de la gripe (YPYDVPDYA) o cMyc humana (EQKLISEEDL), para los que de alta afinidad anticuerpos específicos están disponibles comercialmente. Si se desea, el anticuerpo inmunoprecipitación puede conjugarse químicamente a la Proteína-A de resina para evitar su elución y la detección durante la etapa de inmunotransferencia que pueden oscurecer el co-precipitado prOtein 16; Para lograr esto, hemos utilizado con éxito el reticulador químico 3,3&#39;-ditiobis (sulfosuccinimidilpropionato) 24. Es imperativo que un detergente apropiado se incluye en el tampón de IP y el material insoluble de las células homogeneizadas se retira por centrifugación para minimizar la unión no específica (etapa 3.1.3). La elección y la concentración de detergente son consideraciones importantes: los detergentes fuertes y / o concentraciones más altas reducirán sustancialmente la unión no específica, pero también pueden abolir X: la interacción proteína Y, mientras que las concentraciones más bajas o detergentes más suaves puede permitir una interacción débil para ser observado, pero puede resultar en exceso de la unión no específica. Se prefieren los detergentes de fuerza intermedios, por ejemplo, Triton X-100 al 0,5 -. Concentración 1%. Para reducir aún más la unión no específica, una proteína neutro (por ejemplo, albúmina de suero bovino en 100 g / ml) puede ser incluido en el tampón de IP, y / o el lisado celular se puede-cleare pred con la incubación previa con resina de Proteína-A sola. El número de lavados se debe optimizar para la X: Y ensayó par, por lo general tres lavados de 10 min con tampón IP (paso 3.1.9). En cualquier caso, una muestra co-IP con IgG no inmune como el anticuerpo de inmunoprecipitación siempre debe ser procesado en paralelo para servir como control negativo (etapa 3.1.6). La principal ventaja de la reticulación química es que informa sobre la composición estequiométrica de la proteína homo-oligómero. El glutaraldehído es un reticulante de uso común, ya que no requiere equipo especializado y que genera térmica y químicamente estables enlaces cruzados entre las proteínas que interactúan 19,20. Los compuestos con grupos amino libres pueden faltar en tampones de ensayo (paso 3.2.1) porque van a enfriar la reacción química. concentración de glutaraldehído y el tiempo de reacción (paso 3.2.4) deben ser optimizados para el complejo de la proteína oligomérica de interés. El principal inconveniente de esta técnica, especialiado cuando se realiza en preparaciones de células enteras, es la no especificidad de la reacción química que podría producir agregados de proteínas artificiales que carecen de importancia biológica. Alternativa en vivo (por ejemplo., Transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, fluorescencia bi-molecular o complementación de luminiscencia) y las técnicas in vitro (por ejemplo., Cromatografía de exclusión por tamaño, ultracentrifugación analítica, titulación isotérmica calorimetría) están disponibles para la caracterización de la proteína libre asociación y la evaluación estequiometría de oligomerización 29,30. Cada método tiene sus propias ventajas y desventajas, y puede ser más adecuado para el estudio de una proteína específica en función de la proteína de purificación / estabilidad y disponibilidad de los equipos / reactivo. Los tres métodos complementarios que se describen aquí en detalle, a saber Y2H, co-IP y la reticulación, se han utilizado en combinación para proporcionar evidencia convincente de RyR2 homo-oligomeformación de r en el aislamiento y dentro de una célula viva.

La contracción del músculo esquelético y cardíaco se activa por retículo sarcoplásmico Ca 2 + liberación mediada por RyR. Hay tres isoformas RyR de mamífero con el canal de función compuesta de cuatro subunidades idénticas. Cada subunidad RyR consiste en una porción de regulación citoplásmica gran N-terminal y una pequeña parte C-terminal que contiene los dominios transmembrana que forman una alta conductancia Ca 2 + poro. Intra anormal y entre la subunidad interacciones subyacen a la disfunción de canales RyR y dan lugar a trastornos neuromusculares y cardíacos 1. La identificación y caracterización de los dominios específicos implicados en la estructura de RyR: función de relación es por lo tanto crucial para la comprensión de la fisiopatología RyR. técnicas de interacción proteína-proteína bioquímicos tradicionales requieren cantidades sustanciales de proteína purificada, a menudo se producen en bacterias. Esto no es factible en el caso de la RyR, una membrana muy grande protein compone de ~ 5000 aminoácidos, mientras que sus fragmentos recombinantes no son fácilmente susceptibles a la expresión bacteriana y purificación. Por lo tanto, se requieren sistemas de expresión alternativos que implican células huésped eucariotas para las proteínas integrales de membrana de mamíferos. Hemos empleado previamente Y2H, co-IP y los ensayos de reticulación para demostrar colectivamente que tetramerización N-terminal es una característica estructural que se conserva en todos los tres mamíferos RyR isoformas 2,3. Es importante destacar que se ha encontrado que un único punto de mutación asociada con la enfermedad cardíaca arritmogénica interrumpe N-terminal de auto-asociación y los resultados en un canal de RyR disfuncional 4. También hemos aplicado estas técnicas para estudios de oligomerización de la RyR citoplásmica cola C-terminal 5, así como el N-terminal de la Ca canal de liberación homóloga intracelular 2 +, el inositol 1,4,5 trifosfato receptor 2. En el ensayo de Y2H, la interactien entre dos proteínas (X e Y) se mide por la reconstitución de un factor de transcripción funcional (GAL4) y la activación subsiguiente de los genes indicadores de 6-9. Dos vectores de clonación diferentes se utilizan para generar fusiones de las dos proteínas probadas con los dos dominios físicamente separables, independientes de GAL4: DNA-Binding Domain (DNA-BD) / proteína de fusión X (cebo) y activación de dominio (AD) / proteína Y fusión (objetivo). El Y2H puede ser utilizado para probar si una proteína interactúa con sí mismo mediante la generación de GAL4 DNA-BD y fusiones AD de la misma proteína. Modificados genéticamente cepas Y2H se GAL4 y GAL80 deficiente (la proteína GAL80 es un represor de GAL4), así como TRP1 y LEU2 deficiente (para proporcionar la selección nutricional para el cebo y presa plásmidos, respectivamente). En el núcleo de levadura, los péptidos DNA-BD y AD recombinantes se ponen en estrecha proximidad física para producir un factor híbrido de transcripción GAL4 sólo a través de X sus fusiones &#39;: int Yeraction. Este enfoque permite la detección genética rápida para detectar interacciones proteína-proteína a través de la activación de la transcripción en paralelo de prototrophic (codificación HIS3 para una enzima necesaria para la biosíntesis de histidina) y cromógeno (codificación LacZ de β-galactosidasa (β-Gal)) genes informadores. La ventaja principal de la Y2H es que es un ensayo in vivo que detecta interacciones proteína-proteína, incluso débiles o transitorios. Además, la detección implica el uso sencillo de selección de crecimiento (en medios que carecen de histidina) o de una colorimétrico de ensayo (β-Gal) sin necesidad de purificación de las proteínas de cebo y de destino o la generación de anticuerpos específicos. Además, el Y2H se puede utilizar para escrutar una colección de clones desconocidos aleatorios (clones biblioteca de ADNc fusionado a GAL4 AD) para nuevas parejas de unión de una proteína cebo, también dan acceso directo al ADNc de la proteína de la biblioteca. Para extender las observaciones Y2H, indeent técnicas bioquímicas se pueden emplear. Ensayos de reticulación en combinación con inmunotransferencia Co-IP y son métodos utilizados para detectar asociaciones de proteínas en mezclas de muestras complejas, por ejemplo., Lisados ​​de células enteras 10. Su principal ventaja es que se informan en las interacciones proteína-proteína a partir de tejido nativo, a diferencia de otros métodos que requieren el uso de proteínas recombinantes. Las proteínas recombinantes también se pueden utilizar, por lo general se expresa en una línea celular de mamífero, en el que es probable que tengan sus correcta conformación y modificaciones post-traduccionales, así como la localización subcelular. Sin embargo, desde co-IP y reticulación están en ensayos in vitro haciendo uso de células homogeneizadas, es necesario confirmar si los dos socios de proteína se co-localizan en la célula intacta 11. Utilizamos rutinariamente transfección de células HEK293 de mamífero para expresar transitoriamente integral de membrana de mamíferos y proteínas citosólicas usando el método de precipitación de fosfato de calcio 2-4,12-14, Descrito aquí en detalle. Esta es una manera económica de entregar eficientemente el plásmido de ADN dentro de las células, pero depende de la línea particular de células usada y la confluencia celular, así como la pureza del ADN plasmídico 11,15. El ensayo de co-IP implica el aislamiento de la proteína nativa o recombinante de interés a partir de lisados ​​de células en condiciones no desnaturalizantes que permiten la co-purificación de parejas de interacción putativo 10,16. Se requiere el uso de dos anticuerpos independientes, el anticuerpo inmunoprecipitación para el aislamiento de la proteína X, y el anticuerpo inmunotransferencia para la detección de Y. acompañante de la proteína Se puede utilizar para probar si una proteína interactúa con sí mismo mediante la generación de dos fusiones diferentes con dos epítopo diferente etiquetas (por ejemplo., HA y cMyc). El anticuerpo inmunoprecipitación se une a través de su región Fc de la proteína-A (o proteína-G, en función de la especie animal en la que se planteen la de anticuerpos), queestá conjugado a agarosa (o sefarosa) de resina. Protein X es precipitado por el anticuerpo: Proteína-A de resina después de la incubación con el lisado de células, a saber, la fracción soluble en detergente de células homogeneizadas. Proteínas inmuno-complejos se eluyen con tampón que contiene SDS y posteriormente se analizaron por SDS-PAGE e inmunotransferencia usando un anticuerpo para detectar la presencia de la proteína Y 17. Co-IP debe llevarse a cabo con proteínas detergente soluble para evitar excesiva unión no específica. La elección del detergente y su concentración, así como el número de lavados, deben optimizarse para cada X: Y par 10,16,18. se emplea reticulación para determinar la estequiometría del complejo de proteína oligomérica. Se basa en una reacción química para crear enlaces covalentes entre protómeros que interactúan adyacentes, y por lo tanto, permite la conservación del estado oligomérico de la proteína durante la separación SDS-PAGE. Hay numerosos reage entrecruzamientonts de diferentes longitudes y química dirigidos a diferentes grupos reactivos en las proteínas, aminas primarias, típicamente carboxílico o grupos tiol. A continuación, describimos el uso de glutaraldehído (OHC (CH 2) 3 CHO), un agente de reticulación homo-bi-funcional con dos grupos aldehído en ambos extremos que reaccionan con los grupos amino libres presentes en los residuos de lisina 19,20. La reticulación es seguido de una manera de la concentración o dependiente del tiempo que resulta en la formación de aductos. Reacción glutaraldehído se detiene con hidrazina (H 2 NNH 2) y muestras de proteínas son luego analizados por SDS-PAGE e inmunotransferencia 17 para evaluar su estado de oligomerización. Debemos tener en cuenta que la reticulación no induce oligomerización, sino que simplemente crea puentes estables entre complejos de proteínas preexistentes. Consideraciones importantes cuando se llevan a cabo experimentos de entrecruzamiento incluyen la elección del agente de reticulación, su concentración y tiempo de reacción 19,20.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1190">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:387px;">1.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; PART 1 yeast two-hybrid</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:472px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate incubator</td>
			<td>Hereaus</td>
			<td>B6120</td>
			<td>Used at 30&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Orbital shaker incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>INNOVA 4300</td>
			<td>Used at 30&#176;C with shaking at 230-250 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrophotometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Lambda Bio+</td>
			<td>To measure OD600 of yeast culture; to measure Absorbance at 420 nm in liquid b-Gal assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matchmaker Two-Hybrid System 2 Kit</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>K1604-1</td>
			<td>Contains bait vector pGBKT7, prey vector pACT2&#160; and yeast strain Y190&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Nitrogen Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0626</td>
			<td>To prepare minimal SD growh medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dropout supplement lacking leucine and tryptophan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0750</td>
			<td>To prepare minimal SD growh medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dropout supplement lacking leucine, tryptophan, histidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y2001</td>
			<td>To prepare minimal SD growh medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Herring testes carrier DNA&#160;</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>630440</td>
			<td>For yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Whatman filter paper Grade 5&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WHA1005070</td>
			<td>for use in colony-lift filter paper b-Gal assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-galactopyranoside)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4252</td>
			<td>for use in colony-lift filter paper b-Gal assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ONPG (o-nitrophenyl-&#946;-D-galactopyranoside)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N1127</td>
			<td>for use in liquid b-Gal assay</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;">PART 2. Protein expression in a mammalian cell line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK293 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC&#174;&#160;CRL-1573&#8482;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Humidified incubator (5% CO2, 37 &#176;C)</td>
			<td>SANYO</td>
			<td>MCO-18AIC</td>
			<td>To culture mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s medium)</td>
			<td>Invitrogen (ThermoFisher)</td>
			<td>41966</td>
			<td>To prepare growth medium for mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen (ThermoFisher)</td>
			<td>10500</td>
			<td>To prepare growth medium for mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td>To homogenise cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle 23G (0.6 x 30mm)</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>300700</td>
			<td>To homogenise cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease inhibitor cocktail (Complete)&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873508001</td>
			<td>To prevent proteolysis</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">PART 3. In vitro biochemical methods&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Mini-PROTEAN Tetra Cell (SDS-PAGE system)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658000EDU&#160;</td>
			<td>For polyacrylamide gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trans-Blot SD (Semi-dry transfer system)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703940</td>
			<td>For electrophoretic transfer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Compact X-ray film processor</td>
			<td>Xograph</td>
			<td>X4</td>
			<td>For use in immunoblotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882</td>
			<td>For use in chemical cross-linking</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein-A sepharose beads&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-5280-01&#160;</td>
			<td>For use in co-IP assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-HA (Y-11 rabbit polyclonal IgG)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-805</td>
			<td>For use in co-IP assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-immune rabbit IgG</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology&#160;</td>
			<td>sc-2027</td>
			<td>For use in co-IP assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-cMyc (9E10 mouse monoclonal IgG)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology&#160;</td>
			<td>sc-40</td>
			<td>For use in immunoblotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-HA (16B12 mouse monoclonal IgG)</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-101P</td>
			<td>For use in immunoblotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-mouse IgG-HRP</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td>For use in immunoblotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyperfilm ECL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28906836</td>
			<td>For use in immunoblotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>Pierce (ThermoFisher)</td>
			<td>32106</td>
			<td>For use in immunoblotting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic and biochemical approaches for in vivo and in vitro assessment of protein oligomerization: the ryanodine receptor case study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

En el sistema de Y2H, el cebo: presa interacción se prueba inicialmente por la selección de levadura que carece de crecimiento en medio (triptófano, leucina e) histidina y posteriormente evaluada por β-Gal ensayos de actividad enzimática (Figura 1). La levadura se cultivaron en medio que carece de histidina tiene tasa de crecimiento lento, que depende de la fuerza del cebo: la interacción de proteínas presa. El ensayo de β-Gal se lleva a cabo en la levadura (cultivaron en medio que carece de triptófano y leucina solamente) o bien crece en soporte sólido (placas de agar) o en cultivo líquido, con los últimos resultados cuantitativos rendimiento. Hemos utilizado con éxito la Y2H para identificar las interacciones de dominio de dominio dentro del RyR2, así como nuevos socios de proteínas 2-4,12,21,22. Por ejemplo, hemos examinado una serie de construcciones que abarcan toda la longitud de la secuencia del péptido RyR2 para la interacción con un fragmento N-terminal de solapamiento (AD4L: residuos RyR2 1-906 fusionada con GAL4 AD). 3 ensayos de filtros de colonias de elevación del papel β-Gal producen colonias vivas de color azul levadura única para el BT4L: par AD4L (Figura 2), lo que demuestra que AD4L interactúa consigo misma, a saber, la BT4L construir (residuos RyR2 1-906 fusionado con GAL4 DNA-BD). Se detectaron colonias de color azul claro para el BT8: par AD4L lo que sugiere una asociación más débil secundaria con el dominio C-terminal extrema (BT8), mientras que la levadura co-transformada con cualquier otro constructo permanecieron blancas y por lo tanto negativo como cebo: la interacción de proteínas presa. Los resultados cuantitativos, obtenidos mediante ensayos de β-Gal líquidos (Figura 2B), indicaron BT4L robusto: equivalente interacción AD4L en fuerza a la conocida asociación entre la proteína p53 (pVA3) y grande de SV40 T antígeno (pTD1), mientras que el BT8: interacción AD4L fue considerablemente más débil (&lt;10% en comparación con el control). Rutinariamente realizamos experimentos de co-IP (Figura 3) fespués de expresión transitoria en una línea de células de mamífero (HEK293), como un ensayo bioquímico independiente para reforzar los hallazgos Y2H 2-4,12-14,21-24. Para verificar RyR2 N-terminal libre interacción, dos plásmidos separados que codifican para los residuos de RyR2 1-906 etiquetados, ya sea con el péptido cMyc o epítopo HA (BT4L y AD4L, respectivamente), se co-transfectaron en células HEK293 utilizando el método de precipitación con fosfato cálcico 3. La fracción post-nuclear de las células homogeneizadas se solubilizó con los CHAPS detergente, y el material insoluble se separó por centrifugación para producir el lisado celular. El lisado celular, tratados con el agente reductor ditiotreitol, se incubó con Ab HA y cuentas de Proteína-A Sepharose para inmunoprecipitar AD4L marcada con HA. Muestras de Co-IP, eluidas con tampón que contenía SDS, se cargaron en dos geles de SDS-PAGE separados (1/10 y 9/10 TH divididas) y se analizaron por inmunotransferencia con Ab HA y Ab cMyc, respectively. El éxito directo IP de AD4L (~ 100 kDa) por Ab HA fue verificada mediante inmunotransferencia, pero no en el control negativo utilizando IgG de conejo no inmune (Figura 4A). Es importante destacar que, de etiquetado cMyc BT4L (~ 100 kDa) se recuperó sólo en el HA IP Ab, y no en el control negativo en ausencia de AD4L inmunoprecipitada (Figura 4B). Y2H ensayos y co-IP proporcionan evidencia consistente para RyR2 N-terminal libre interacción, pero no informan sobre el estado de oligomerización del dominio N-terminal, es decir si se forma solamente dímeros o complejos mayores. Cabe señalar que los complejos se disocian y solamente las subunidades que comprenden será detectada por SDS-PAGE a causa de SDS y desnaturalización de la proteína inducida por calor se suprime las interacciones proteína-proteína. Para superar esto, utilizamos el entrecruzamiento (Figura 5) que se conjuga químicamente y de manera estable preexistente protein oligómeros, cuya masa molecular puede entonces ser examinado por SDS-PAGE separación por tamaños 2-5. Por ejemplo, HEK293 homogenado celular que expresa cMyc-BT4L, se trata con el agente reductor ditiotreitol, se hizo reaccionar con glutaraldehído y se analizó mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia usando Ab cMyc (Figura 6). Además del monómero (~ 100 kDa), una banda de proteína de alta masa molecular de ~ 400 kDa se detectó en una manera dependiente del tiempo, lo que indica RyR2 N-terminal formación tetrámero 3. En particular, tetrámero fue la especie predominante oligómeros, con dímero mínima y bandas trimer observados. Para determinar su masa molecular aparente, el oligómero BT4L se separó al 4 - 15% de geles de gradiente de SDS-PAGE 3. Hemos producido la curva estándar retraso masa / gel molecular usando patrones de proteína con un rango de 30 - 460 kDa, y se calculó el oligómero ser 358 kDa 15 (n = 4). Esta masa molecular aparente es consistente con un tetrámero BT4L dispuestos en unade forma circular cerrada en lugar de en forma lineal, como se espera de la disposición de las cuatro subunidades dentro del canal RyR2 nativo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama de flujo Y2H. La levadura, co-transformada con cebo y de destino plásmidos, se selecciona para el crecimiento en un medio que carece de histidina y / o ensayó la actividad enzimática β-Gal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig2.jpg" /> Figura 2. Y2H Sugiere RyR2 N-terminal de dominio de la libre interacción. (A) Esquema que representa la serie (cebo) de RyR2 fragmentos de proteínas superposición humanos probados en el sistema de Y2H<html> interacción con el constructo AD4L RyR2 N-terminal (presa). Los resultados cualitativos obtenidos mediante ensayos de papel β-Gal filtros de lavado de colonia se indican en múltiplos &quot;+&quot; o &quot;-&quot; para la interacción negativa ensayos (B) de líquido cuantitativa β-Gal se normalizaron con el control positivo (pVA3 codifica para GAL4 DNA-BD. fusión con la proteína p53; pTD1 codifica para la fusión GAL4 AD con el antígeno T grande de SV40). Modificado de 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig3.jpg" /> Figura 3. Co-IP Diagrama de flujo. Las células de mamífero, co-transfectadas con plásmidos que X e Y, se homogeneizan y detergente solubilizadas para producir el lisado celular utilizada en el ensayo de co-IP, seguido de SDS-PAGE e inmunotransferencia.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig4.jpg" /> Figura 4. Co-IP indica RyR2 N-terminal de dominio libre interacción en células de mamífero. HEK293 células se co-transfectaron durante transitoria co-expresión de cMyc-tagged (BT4L) y HA-tagged dominio (AD4L) RyR2 N-terminal ( los residuos 1 a 906). AD4L se inmunoprecipitó con Ab HA de solubilizadas en CHAPS y lisado HEK293 ditiotreitol tratados, mientras que los ensayos de control, co-IP como negativos se realizaron con IgG de conejo no inmune. Las proteínas inmunoprecipitadas se calentaron a 85 ° C durante 5 min y se resolvieron en 20 mA durante 3 horas a través de 6% en geles de SDS-PAGE separados cargados de 1/10 o 9/10 de las muestras de IP. Después de la transferencia de proteínas a 80 V durante 2 horas a polyvinylidene membrana de difluoruro, análisis de inmunotransferencia se llevó a cabo usando (1: 1000 dilución) Ab HA (A) o Ab cMyc (B), respectivamente, seguido de peroxidasa de rábano conjugada anti-IgG de ratón (dilución 1: 10.000) y el aumento de la detección de quimioluminiscencia (1 min de exposición). Una alícuota del lisado celular, 1/50 del volumen procesado en muestras de IP, también se incluyó para servir como patrón de masa molecular. Modificado de 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig5.jpg" /> Figura 5. Diagrama de flujo de reticulación. Las células de mamífero transfectadas con el plásmido X, se homogeneizan y se somete a reacción con glutaraldehído en el ensayo de reticulación, seguido de SDS-PAGE e inmunotransferencia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig6.jpg" /> Figura 6. La reticulación Indica RyR2 N-terminal de dominio de tetrámeros Formación Se transfectaron células HEK293 para la expresión transitoria de dominio (BT4L) RyR2 N-terminal marcada con cMyc (residuos 1 - 906).. homogeneizado celular, se trata con el agente reductor ditiotreitol, se incubó con glutaraldehído para los puntos de tiempo indicados. Las muestras se calentaron a 85 ° C durante 5 min y se resolvieron por SDS-PAGE (6% de gel) a 20 mA durante 3 horas. Después de la transferencia de proteínas a 80 V durante 2 horas a una membrana de difluoruro de polivinilideno, el análisis de inmunotransferencia se llevó a cabo usando (1: 1000 dilución) Ab cMyc, seguido de peroxidasa de rábano picante conjugada con IgG anti-ratón (1:10.000 dilución) y la detección de quimioluminiscencia (1 min de exposición). Monomérico (M: ~ 100 kDa) y las formas tetrámera (T) se indican por las flechas. Modificado de 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

Los enfoques genéticos y bioquímicos para<em&gt; En Vivo</em&gt; y<em&gt; In Vitro</em&gt; Evaluación de la oligomerización de proteínas el receptor de rianodina Estudio de caso

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

11.3K vistas.  Cardiff University School of Medicine, College of Biomedical and Life Sciences. Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

Video: Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

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The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

Ensayo de inducción neural en el embrión de pollo

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

La purificación de la M. magneticum Tensión AMB-1 magnetosomas proteína asociada MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, including transcription factors (e.g. nuclear receptors, p53) and protein kinases (e.g. Src, Raf, Akt kinase) involved in cell cycling, tumorigenesis, apoptosis, and multiple eukaryotic signaling pathways 1,2. Of these many 'client' proteins for hsp90, the assembly of steroid receptor&bull;hsp90 complexes is the best defined (Figure 1). We present here an adaptable glucocorticoid receptor (GR) immunoprecipitation assay and in vitro GR&bull;hsp90 reconstitution method that may be readily used to probe eukaryotic hsp90 functional activity, hsp90-mediated steroid receptor ligand binding, and molecular chaperone cofactor requirements. For example, this assay can be used to test hsp90 cofactor requirements and the effects of adding exogenous compounds to the reconstitution process. 
The GR has been a particularly useful system for studying hsp90 because the receptor must be bound to hsp90 to have an open ligand binding cleft that is accessible to steroid 3. Endogenous, unliganded GR is present in the cytoplasm of mammalian cells noncovalently bound to hsp90. As found in the endogenous GR&bull;hsp90 heterocomplex, the GR ligand binding cleft is open and capable of binding steroid. If hsp90 dissociates from the GR or if its function is inhibited, the receptor is unable to bind steroid and requires reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex before steroid binding activity is restored 4 . GR can be immunoprecipitated from cell cytosol using a monoclonal antibody, and proteins such as hsp90 complexed to the GR can be assayed by western blot. Steroid binding activity of the immunoprecipitated GR can be determined by incubating the immunopellet with [3H]steroid. 
Previous experiments have shown hsp90-mediated opening of the GR ligand binding cleft requires hsp70, a second molecular chaperone also essential for eukaryotic cell viability. Biochemical activity of hsp90 and hsp70 are catalyzed by co-chaperone proteins Hop, hsp40, and p23 5. A multiprotein chaperone machinery containing hsp90, hsp70, Hop, and hsp40 are endogenously present in eukaryotic cell cytoplasm, and reticulocyte lysate provides a chaperone-rich protein source 6. 
In the method presented, GR is immunoadsorbed from cell cytosol and stripped of the endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery using mild salt conditions. The salt-stripped GR is then incubated with reticulocyte lysate, ATP, and K+, which results in the reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex and reactivation of steroid binding activity 7. This method can be utilized to test the effects of various chaperone cofactors, novel proteins, and experimental hsp90 or GR inhibitors in order to determine their functional significance on hsp90-mediated steroid binding 8-11.

An in vitro method for preparing functional glucocorticoid receptor (GR)&#x2022;hsp90 protein complexes from purified proteins and cellular lysates is described. The method utilizes immunoadsorption of recombinant GR followed by salt-stripping and protein complex reconstitution. The importance of cofactors and buffer conditions are discussed, as are potential method applications.

La reconstitución bioquímicos de receptor de esteroides • Hsp90 complejos de proteínas y reactivación de la unión del ligando

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

Do-It-Yourself de dispositivos para la recuperación de las muestras criopreservadas de caída accidental en los tanques de almacenamiento criogénicos

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

Bioquímica y de Evaluación de Rendimiento microscópica de masa grasa en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular metabolism. Many methods to detect glycogen already exist but only a few are quantitative. We describe here a method using the Abcam Glycogen assay kit, which is based on specific degradation of glycogen to glucose by glucoamylase. Glucose is then specifically oxidized to a product that reacts with the OxiRed probe to produce fluorescence. Titration is accurate, sensitive and can be achieved on cell extracts or tissue sections. However, in contrast to other techniques, it does not give information about the distribution of glycogen in the cell. As an example of this technique, we describe here the titration of glycogen in two cell lines, Chinese hamster lung fibroblast CCL39 and human colon carcinoma LS174, incubated in normoxia (21% O2) versus hypoxia (1% O2). We hypothesized that hypoxia is a signal that prepares cells to synthesize and store glycogen in order to survive1.

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

We describe here an accurate, reproducible and convenient biochemical method for titration of glycogen in vitro. This technique uses the Abcam Glycogen assay kit and is based on successive hydrolysis of glycogen to glucose and glucose titration by fluorescence.

Titulación bioquímica de glucógeno<em&gt; In vitro</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

In vitro metilación de ensayo para estudiar la proteína arginina metilación

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...