Este estudio fue apoyado por Max McGee Centro Nacional de Investigación para Menores Diabetesat Colegio Médico de Wisconsin y el Instituto de Investigación de Niños de Wisconsin. Los financiadores no participó en el diseño del estudio, la recopilación de datos y análisis, o la preparación del manuscrito.

1. Antes de la creación de un ensayo de supresión, es necesario cuentas de abrigo tosylactivated con anti-CD3 humano (clon UCHT1, 1μg/ml concentración final) para la estimulación de células y después comprobar si las cuentas están recubiertas de manera eficiente mediante la creación de un ensayo in vitro de la proliferación de uso humano las células T <ol><li> Tomar 1 ml de M-450 cuentas de tosylactivated vial original, lugar en soporte magnético y espera hasta que todas las cuentas se han adherido a la pared del tubo. Retire el tubo de amortiguación, mientras que todavía está en el soporte magnético. Tome el tubo del soporte magnético y añadir 1 ml de buffer1, colocar el tubo en soporte magnético y retire el tubo de buffer1 mientras está en el soporte magnético, cuentas resuspender en 1 ml de buffer1 y añadir 40μl de anti-CD3 humano, agitando a 37 º C durante 15 minutos, añadir 0,1% w / v BSA y continuar agitando durante 16 horas siguientes. </li><li> Lavado de los granos en buffer2 dos veces durante 5 minutos a 2-8 ° C y una vez en buffer3 durante 5 minutos a 2-8 ° C con soporte magnético como se explicó anteriormente, quitar el tampón y volver a suspender las bolas en 1 ml de buffer2, las cuentas son 4x10 8 / ml concentración final y listo para usar. </li><li> Alícuota de 50.000 y 25.000 PBMC / y por triplicado en una placa de 96 pocillos y añadir un número variable de CD3 revestida de piedras (4x10 8 cuentas / ml, CD3 1μg/ml, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 gotas / celular ) con el fin de determinar el número óptimo de cuentas por celda. Después de 72 horas en cultivo, añadir 1μCi [3H]-timidina y continuar la incubación a 37 ° C durante las 16 horas siguientes. Las células de la cosecha en la placa de la cosecha multipantalla (Millipore), añadir líquido de centelleo y leer cuentas por minuto (cpm) / y con mejores NXT Count (Packard, CT). Use las gotas / proporción de células en CPM están por encima de 5000, pero 15.000 menos que para evitar la sobre-estimulación de células T reguladoras, que podrían perder la función supresora. Por lo general, la proporción de 3 bolas / celular estimula la respuesta y las células T reguladoras en todos los grupos sometidos a prueba hasta el momento 1-4. </li></ol> 2. PBMC aislamiento de toda la sangre de donantes sanos o de leukopacks humanos o de la capa leucocitaria (BC) por lo general tomado de voluntarios sanos y disponibles de forma gratuita desde los Centros de Transfusión de Sangre (Figura 1) <ol><li> Diluir la AC (~ 50 ml) 1:06 con PBS (añadir 250 ml). Ahora no es el volumen total de 300ml. Poco a poco la capa de 25ml de BC diluida en la parte superior de 15 ml de Ficoll-Paque PLUS añadido a 50 ml tubos Falcon, sin alterar las capas. Centrifugar a 800xg (1400 rpm en una centrífuga Sorvall con rotor basculante SH-3000) durante 30 minutos a 4 ° C, con frenos de apagado. </li><li> Recoger cuidadosamente la capa de PBMC (fase intermedia) y la transferencia a un nuevo máximo de 50 ml tubos Falcon. Lávese las PBMC mediante la cumplimentación de los tubos hasta 50 ml con DPBS. Recoger 2 gránulos de las células en un tubo. Centrifugar a 400xg durante 10 min a 4 ° C. Repita la etapa de lavado dos veces, cada vez que la combinación de 2 gránulos de las células en un solo tubo. Combine todos los gránulos de las células en un solo tubo de 50 ml. </li><li> Contar con PBMC usando Trypan exclusión de prueba azul. Hacer una dilución 1:10 en azul tripán añadiendo 20μl de PBMC a 180μl de azul de tripano mancha. Mezclar bien y tomar 20μl a contar en hemocitómetro de inmediato. Contar el número de todas las células teñidas de azul y sin mancha y está ubicado en dos manzanas cada uno con 16 plazas más pequeñas. Tomar la media de ambas y se multiplica por 10. Divida este número por 100 para obtener el número de PBMC / ml. Porcentaje de células viables calcular como [1 - (número de células de color azul / número de células totales) x 100]. Proceder en caso de viabilidad es ≥ 95%. </li></ol> 3. MACS pre-tipo de células T CD4 <ol><li> Antes de continuar, la transferencia de 1 ml de PBMC en un nuevo tubo, añadir 4 ml de los medios de comunicación para preparar a las células de la irradiación con 5000rad-estos serán células presentadoras de antígeno (APC). </li><li> Centrifugar el resto de las células en 250xg en PBS/2mM EDTA/0.5% de tampón BSA durante 10 min a 4 ° C. Retirar las células sobrenadante y resuspender en 4 ml de buffer PBS/2mM EDTA/0.5% BSA. </li><li> Agregar 200μl de MACS microbolas anti-CD4 e incubar a 4 ° C durante 20 minutos. </li><li> Lave mediante la adición de 40 ml de buffer PBS/2mM EDTA/0.5% BSA y centrifugar a 250xg durante 10 minutos a 4 ° C. Elimínese el líquido sobrenadante y resuspender en 8 ml de desgasificado, la temperatura ambiente PBS/2mM EDTA/0.5% de tampón BSA. </li><li> Filtro por separado la suspensión de células con separación de Pre-filtros antes de su carga en una columna de LS. </li><li> Dividir la suspensión celular y la capa de 4 ml cada columna LS más de calibrado (con 3 ml de deggassed PBS/2mM EDTA/0.5% de tampón BSA). LS columna se fija en el separador MidiMACS. Antes de la suspensión celular se agota, o bien volver a ejecutar el caudal contínuo o añadir 3 ml de la temperatura ambiente deggassed PBS/2mM EDTA/0.5% de tampón BSA y dejar que el buffer que se recorra. Agregar más buffer hasta que salga clara. </li><li> Pipeta de 5 ml de búfer deggassed en la columna LS, LS eliminar la columna del separador MidiMACS y el lugar en un nuevo tubo estéril de recogida 15ml dejar correr ~ 1.0 ml a través. Poner el pistón en la columna y empuje lentamente el resto de lavolumen fuera. </li><li> Haga lo mismo con las dos columnas LS y combinar las dos fracciones de células CD4 +. Agregue hasta 50 ml de PBS las células y el recuento. Rendimiento esperado es de hasta 5x10 8 células. Centrifugar a 400xg durante 10 minutos y suspender las células en 2 ml y PBS/2mM EDTA/0.5% de tampón BSA. </li></ol> 4. Fluorescentes clasificación de células activadas (FACS) de aislamiento (Figura 2) <ol><li> Hacer un cóctel de anticuerpos a los marcadores de CD a los siguientes marcadores de superficie celular (mantener protegido de la luz): 20 l de anti-humano CD8-FITC (clon del EPR-T8), 20 l de anti-CD14 humano-FITC (clon M5E2; receptor de LPS), 20 l de anti-CD32 humano-FITC (clon FLI8.26; FcγR de tipo II) y 6 l de anti-CD116 humana-FITC (clon M5D12, GM-CSFRα cadena) y, en su defecto, añadir 40μl contra -CD4 humano APCCy7 (clon RPA-T4). </li><li> Tome 5μl de la suspensión celular y se tiñen con 2 ml de cóctel 2μl mancha, lo que es un tubo para determinar el umbral (Fluorocromo Minus One FMO) 5. </li><li> Añadir 50 l de anti-CD25 humano-PE (clon M-A251, IL-2Rα) para el cóctel de la mancha, y añadir el cóctel de suspensión de células y se incuba a 4 ° C 30 minutos. Lavar las células en tampón PBS, centrifugar a 400xg durante 10 minutos y suspender las células a una concentración de 10 7 células / ml. </li><li> Prepare las células y las células no teñidas o cuentas teñidas con un solo fluorocromo para su uso como control de compensación de clasificación de células en FACS Aria (BD Biosciences, San José, NJ). </li><li> Adquirir las células en el tubo de FMO, que permitirá al usuario establecer el umbral para la clasificación de células CD25 + T (Figura 2a). Establecer una puerta alrededor de FITC células negativas para excluir FITC de células positivas que comprende los monocitos, los macrófagos y los linfocitos CD4 + otros-no de las células T (Figura 2b). </li><li> En un gráfico diferente, dibuja puertas para CD25, CD25low y CD25high células T Tregs (1% de las células que expresan el mayor número de CD25) (Figura 2c). Subconjuntos de células suelen mostrar alta pureza (Figura 2d, 2e y 2f). </li><li> Centrifugar los tubos de recogida de las células en 400xg durante 10 minutos y mantenerse en hielo hasta placas. </li></ol> 5. Establecer el cultivo de células en placa de 96 pocillos (esquema adjunto como Tabla 1) en 200μl/well <ol><li> 50μl alícuota de CD3 revestida de piedras (1 mg / ml), calculado a 3 perlas / células de respuesta en un pozo, se resuspendieron en medio completo con agregados de 10% de suero humano AB en el fondo en U 96 y placas. (Por ejemplo, para hacer que los medios de comunicación de 2 ml con CD3 recubierto, tomar 7.5μl de stock de CD3 revestida de piedras de final de la concentración de 4x10 8 / ml y se diluye en 2 ml de los medios de comunicación, cada 50μl contendrá 75.000 beads-3beads/cell). </li><li> Diluir APC irradiado a la concentración celular de 5x10 5 / ml y añadir 50μl (contendrá 2,5 x 10 4 células) en cada pocillo con el estímulo añadido previamente, incluidos los pozos etiquetados como &quot;células T reguladoras sólo&quot;, &quot;APC sólo&quot; y &quot;medios de comunicación sólo&quot; en la tabla 1. </li><li> Añadir 2,5 x 10 4 / así CD4CD25-o las células T CD4CD25low por triplicado siguiendo el diseño en la Tabla 1. </li><li> Añadir Tregs de co-cultivos (fila B, Tabla 1) en la proporción de 1:10 (2500 células Treg) y los pozos de la etiqueta &quot;sólo Tregs&quot; e incubar la placa a 37 ° C en la incubadora de CO 2 con un 5% de CO 2 , en la humedad saturada durante 72 horas. </li><li> Pulso de los pozos con 1μCi [3H]-timidina y continuar la incubación a 37 ° C durante 16 horas siguientes. </li></ol> 6. La recolección y conteo <ol><li> Las células de la cosecha en la placa de la cosecha multipantalla con Packard Filtermate cosechadora o un sistema alternativo. </li><li> Añadir líquido de centelleo (Microscint 20), cubrir la cosecha plato con cubierta de plástico transparente en la preparación para el paso final. </li><li> Lea cuentas por minuto (cpm) / y con mejores NXT Count (Packard, CT) o un sistema alternativo. </li></ol> 7. Informática porcentaje de supresión <ol><li> Como las células se cultivaron por triplicado, el promedio se calcula para cada condición. Si el coeficiente de variación es&gt; 30%, el valor atípico es eliminado y cpm sólo a partir de dos pozos se promedian. Porcentaje de la supresión se obtiene calculando [(sc) / s] x 100%, donde s = cpm en la cultura única y c = cpm en co-cultivo. </li><li> Como ingenuo (CD25) e in vivo activado (CD25low) las células T efectoras se colocan como células T de respuesta, la diferencia en la capacidad de células T reguladoras para suprimir cada uno de estos subconjuntos es capturado y utilizado como un indicador pronóstico potencial funcional basado en la premisa que las células activadas son más difíciles de suprimir. </li></ol> 8. Los resultados representativos: Una gran variabilidad en los métodos utilizados y los resultados derivados del análisis in vitro de la supresión humanos nos llevó a realizar un estudio exhaustivo de las condiciones que influyen en el ensayo 1. Hemos desarrollado un ensayo que prueba no sólo la función Treg, sino también su pureza, teniendo en cuenta la baja relación entre Tregs: Teffs (1:10), que determinó anteriormente 6. Además, se diferencian en células T reguladoras ªEIR capacidad de reprimir con éxito ingenuo e in vivo de células T activadas, incluso en sujetos sanos, como se muestra en la Figura 3 y en nuestros estudios anteriores 2,4, que se vuelve más importante si el balance inmunológico está comprometido, al igual que en los sujetos con riesgo de desarrollar DT1 . La prueba funcionó muy bien en el estudio donde se comparó la función supresora de los recursos naturales (nTregs), inducible (iTregs) e in vitro nTregs ampliado, lo que nos permite comparar su función entre los controles sanos, de reciente aparición (RO) DT1 y larga (LS ) sujetos DT1. Llegamos a la conclusión de que los sujetos RO DT1 mejor que la capacidad de generar tanto funcional iTregs nTregs y ampliado en comparación con sujetos de control LS T1D y sano 7. Por lo tanto, este ensayo puede ser utilizado como una herramienta excelente en el reconocimiento tanto de un estado temprano y tardío de un desequilibrio inmunológico. Esquema 1 Presentación esquemática de los pasos involucrados en la represión en el ensayo in vitro <img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Pasos del ensayo de supresión in vitro presentados con fotografías <img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Estrategia de apertura de puerta en el aislamiento de células FACS. a) CD25 umbral + se ajustó de acuerdo a Fluorocromo Minus One (FMO), b) las células fueron cerradas como FITC-negativos, c) FITC-negativos células fueron aún más cerrada y se recoge en CD + CD25, CD + CD25low y CD + CD25high ( Tregs) se muestra con porcentajes, d) FACS ordenados Tregs después de la clasificación, e) FACS ordenados CD + CD25low después de la clasificación, y f) FACS ordenados CD4 + CD25 de las células T después de la clasificación <img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Los resultados representativos de los sujetos sanos a) Los resultados representativos de cuentas por minuto (cpm) de los sujetos sanos presentan como un solo cultivo para todos los subconjuntos de células implicadas (ingenuo-CD25-en vivo-activa CD25low, células presentadoras de antígeno-APC y regulación de las células T-Treg), así como co-cultivos de células T de respuesta (CD25-o CD25low) y células T reguladoras. b) El porcentaje de supresión de cada uno de CD25-y CD25low respuesta por las células T autólogas Tregs se presenta para los controles sanos (n = 4). Supresión se calcula como [(sc) / s] x 100%, donde s = cpm en la cultura única y c = cpm en co-cultivo. Aunque ligera diferencia en la capacidad de las células T reguladoras para suprimir la respuesta de células T se dio cuenta, no fue significativa (prueba t pareada p = 0,08). C) Se presentan cpm en temas de riesgo de cada cultura individual, incluyendo CD25-y CD25low como respuesta las células T, así como APC y Tregs, y co-culturas donde se siembra cada subconjunto de respuesta de células T con células T reguladoras (CD25-/Tregs y CD25low/Tregs). d) Porcentaje de la supresión de cada uno de CD25-y las células T de respuesta CD25low autólogo Tregs se presenta en sujetos de riesgo (n = 4). La diferencia en la capacidad de las células T reguladoras para suprimir CD25-en comparación con las células T CD25low respuesta fue significativa (prueba t pareada p = 0,04). Tabla 1. Esquema de puesta en marcha de ensayo de supresión in vitro <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 1.3 </td><td> 6.4 </td><td> 9.7 </td><td> 10-12 </td></tr><tr><td> A </td><td> CD4CD25- </td><td> CD4CD25low </td><td> los medios de comunicación sólo </td><td> los medios de comunicación sólo </td></tr><tr><td> B </td><td> CD4CD25-/ Tregs </td><td> CD4CD25low / Tregs </td><td> Tregs sólo </td><td> APC sólo </td></tr><tr><td> C </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> D </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> E </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> F </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> G </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> H </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+characterization,+and+biological+evaluation+of+integrin+&#945;V&#946;3-targeted+PAMAM+dendrimers.">Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin &#945;V&#946;3-targeted PAMAM dendrimers.</a> Mol. Pharm. 5, 527-539 (2008).</li></ol>

Como la única característica única de células T reguladoras, la función de supresión debe ser probado de forma fiable y uniforme entre los sujetos en las diferentes fases de desarrollo de la enfermedad dentro de la misma y entre los diferentes estudios. Le ofrecemos los detalles de la prueba de supresión desarrollado en nuestro laboratorio como nuestra contribución a la normalización de este ensayo. En nuestro estudio de optimización extensa, hemos determinado que la estimulación de células T con anti-CD3 hu...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo o instrumento </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> Ficoll-Paque PLUS </td><td> Amersham Pharmacia Biotech </td><td> 17-1440-03 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS-1X </td><td> Gibco </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> Azul de tripano </td><td> Invitrogen </td><td> 15250-061 </td><td></td></tr><tr><td> anti-CD4 microbolas </td><td> Miltenyi </td><td> 130-045-101 </td><td></td></tr><tr><td> Separación de los pre-filtros </td><td> Miltenyi </td><td> 130-041-407 </td><td></td></tr><tr><td> LS columna </td><td> Miltenyi </td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 15575-020 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B4287 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD4 humano APCCy7 (clon RPA-T4) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 557852 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-humano CD25-PE (clon M-A251, IL-2Rα) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555432 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-humano CD8-FITC (clon RPA-T8) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555366 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-humano CD14-FITC (clon M5E2; receptor de LPS) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555397 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-humano CD32-FITC (clon FLI8.26; FcγR de tipo II) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555448 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-humano CD116-FITC (clon M5D12, GM-CSFRα cadena) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 554532 </td><td></td></tr><tr><td> Dynalbeads M-450 tosylactivated </td><td> Invitrogen </td><td> 140-13 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD3 humanos </td><td> Ancell </td><td> 144-024 </td><td></td></tr><tr><td> Buffer1 </td><td> Casero </td><td></td><td> 0,1 M Na 2 B 4 O 7 pH7.6 </td></tr><tr><td> Buffer2 </td><td> Casero </td><td></td><td> PBS/2mM EDTA / 0,1% BSA pH 7,4 </td></tr><tr><td> Buffer3 </td><td> Casero </td><td></td><td> 0,2% de BSA pH 8,5 Tris/0.1 </td></tr><tr><td> Completa los medios de comunicación RPMI </td><td> Casero </td><td></td><td> Medio RPMI 1640 glutamina 2 mM L-5 mM HEPES 100 U / mg / ml penicilina / strept 0,5 mM piruvato sódico </td></tr><tr><td> [3 H] timidina </td><td> Perkin Elmer </td><td> NET027Z005MC </td><td></td></tr><tr><td> humanos agrupados suero AB </td><td> Atlanta Productos Biológicos </td><td> S40110 </td><td></td></tr><tr><td> Placa de la cosecha multipantalla </td><td> Millipore </td><td> MAHFC1H60 </td><td></td></tr><tr><td> Microscint 20 </td><td> Perkin Elmer </td><td> 6013621 </td><td></td></tr></tbody></table>

human in vitro suppression as screening tool for the recognition of an early state of immune imbalance

Las células T reguladoras (Tregs) son mediadores críticos de la tolerancia inmunológica a antígenos propios. Además, son reguladores esenciales de la respuesta inmune después de una infección. A pesar de los esfuerzos para identificar marcadores de superficie única en Tregs, la única característica única es su capacidad para suprimir la proliferación y la función de las células T efectoras. Si bien es claro que sólo en los ensayos in vitro se pueden utilizar en la evaluación de la función Treg humanos, esto se vuelve problemático cuando se evalúen los resultados de los estudios transversales en las células sanas y células aisladas de pacientes con enfermedades autoinmunes (como la diabetes tipo 1-DT1) necesitan para ser comparados. Hay una gran variabilidad entre laboratorios en el número y tipo de células T de respuesta, la naturaleza y la fuerza de la estimulación, Treg: ratios de respuesta y el número y tipo de células presentadoras de antígeno (APC) que se utiliza en humanos en ensayos de supresión in vitro. Esta variabilidad hace que la comparación entre los estudios de medición de la función Treg difícil. El campo de las necesidades de Treg un ensayo de supresión estándar que funcione bien con los sujetos sanos y aquellos con enfermedades autoinmunes. Hemos desarrollado un ensayo de supresión in vitro que muestran muy poca variabilidad intra-ensayo en la estimulación de células T aisladas de voluntarios sanos en comparación con sujetos con base destrucción autoinmune de las células pancreáticas β-. El objetivo principal de esta obra es describir un ensayo in vitro supresión humanos que permita la comparación entre grupos de sujetos diferentes. Además, este ensayo tiene el potencial para delinear una pequeña pérdida en la función nTreg y anticiparse a una mayor pérdida en el futuro, por lo tanto la identificación de los sujetos que podrían beneficiarse de la terapia inmunomoduladora preventivas 1. A continuación, ofrecemos una descripción detallada de los pasos involucrados en este procedimiento. Esperamos contribuir a la estandarización de la prueba de supresión in vitro utilizado para medir la función Treg. Además, le ofrecemos este ensayo como una herramienta para reconocer un estado inicial de desequilibrio inmunológico y un biomarcador potencial funcional de DT1.

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Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs son supresores potentes del sistema inmune. Hay una falta de marcadores de superficie única para definir, por lo tanto, las definiciones de células T reguladoras son principalmente funcionales. A continuación se describe un optimizado<em&gt; In vitro</em&gt; Prueba capaz de identificar el desequilibrio inmunológico en personas en riesgo de desarrollar DT1.

Humano In Vitro Supresión como herramienta de cribado para el reconocimiento de un estado inicial de desequilibrio inmunológico

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

human-vitro-suppression-as-screening-tool-for-recognition-an-early

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

14.4K vistas.  Medical College of Wisconsin. Tregs son supresores potentes del sistema inmune. Hay una falta de marcadores de superficie única para definir, por lo tanto, las definiciones de células T reguladoras son principalmente funcionales. A continuación se describe un optimizado In vitro Prueba capaz de identificar el desequilibrio inmunológico en personas en riesgo de desarrollar DT1.

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Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

La introducción de la tensión de cizallamiento en el Estudio de la adhesión bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Investigación

Inmunología e Infección

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ROS are toxic and function to kill phagocytized microorganisms. In vivo quantification of phagocyte-derived ROS provides information regarding an organism's ability to mount a robust innate immune response. Here we describe a protocol to quantify and compare ROS in whole zebrafish embryos upon chemical induction of the phagocyte respiratory burst. This method makes use of a non-fluorescent compound that becomes fluorescent upon oxidation by ROS. Individual zebrafish embryos are pipetted into the wells of a microplate and incubated in this fluorogenic substrate with or without a chemical inducer of the respiratory burst. Fluorescence in each well is quantified at desired time points using a microplate reader. Fluorescence readings are adjusted to eliminate background fluorescence and then compared using an unpaired t-test. This method allows for comparison of the respiratory burst potential of zebrafish embryos at different developmental stages and in response to experimental manipulations such as protein knockdown, overexpression, or treatment with pharmacological agents. This method can also be used to monitor the respiratory burst response in whole dissected kidneys or cell preparations from kidneys of adult zebrafish and some other fish species. We believe that the relative simplicity and adaptability of this protocol will complement existing protocols and will be of interest to researchers who seek to better understand the innate immune response.

The innate immune response protects organisms against pathogen infection. A critical component of the innate immune response, the phagocyte respiratory burst, generates reactive oxygen species that kill invading microorganisms. We describe a respiratory burst assay that quantifies reactive oxygen species produced when the innate immune response is chemically induced.

Cuantificación de la respuesta estallido respiratorio como un indicador de la salud inmune innata en el pez cebra

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

La investigación de los efectos de los probióticos en antineumocócica Colonización El uso de un<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensayo de adherencia

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

El análisis in vitro de la respuesta inmune celular Myd88 mediada por el Virus del Nilo Occidental cepa mutante Infección

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para medir la respuesta inmune a la malaria en el contexto del VIH Co-infección

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Establecimiento de un programa de instalación de alto rendimiento para la detección de pequeñas moléculas que modulan la c-di-GMP Señalización en el<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Determining Immune System Suppression versus CNS Protection for Pharmacological Interventions in Autoimmune Demyelination

A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in myelin destruction, which not only slows conduction of nerve impulses, but causes axonal injury resulting in motor and cognitive decline. Current treatments for MS focus on attenuating immune cell infiltration into the central nervous system (CNS). These treatments decrease the number of relapses, improving quality of life, but do not completely eliminate relapses so long-term disability is not improved. Therefore, therapeutic agents that protect the CNS are warranted. In both animal models as well as human patients with MS, T cell entry into the CNS is generally considered the initiating inflammatory event. In order to assess if a drug protects the CNS, any potential effects on immune cell infiltration or proliferation in the periphery must be ruled out. This protocol describes how to determine whether CNS protection observed after drug intervention is a consequence of attenuating CNS-infiltrating immune cells or blocking death of CNS cells during inflammatory insults. The ability to examine MS treatments that are protective to the CNS during inflammatory insults is highly critical for the advancement of therapeutic strategies since current treatments reduce, but do not completely eliminate, relapses (i.e., immune cell infiltration), leaving the CNS vulnerable to degeneration.

This protocol describes how to determine whether pharmacological treatments for experimental autoimmune encephalomyelitis show CNS protection as a consequence of suppressing immune cell infiltration or are neuroprotective during the onslaught of immune cell infiltration.

La determinación de supresión del sistema inmunológico frente a la protección del SNC para Intervenciones farmacológicas en la desmielinización autoinmune

A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Análisis de linfocitos extravasación El uso de una<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de la barrera sangre-cerebro humano

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

Análisis de 18FDG PET/CT la proyección de imagen como una herramienta para estudiar la tuberculosis del Mycobacterium infección y tratamiento en Primates no humanos

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...