Caracterizar de forma exhaustiva el microambiente tumoral es esencial en la investigación inmunooncológica. Este ensayo es el primero en utilizar modelos de expresión de salud basados en ARN para medir las células inmunitarias en el tejido tumoral sólido. Este ensayo permite a los investigadores obtener mediciones muy sensibles y específicas del contexto inmune en los tejidos tumorales sólidos FFB y combinar estos resultados en un biomarcador multidimensional.
Todos los tratamientos oncológicos, no sólo las inmunoterapias, provocan una respuesta inmune en el sitio del tumor sólido. La medición de esta respuesta inmunitaria es importante para comprender la progresión de la enfermedad y las respuestas terapéuticas. Este protocolo combina las técnicas tradicionales de preparación de la biblioteca de ARN con la captura dirigida.
Mientras que mucho tiempo, seguir los pasos de lavado y monitorear los puntos de control de calidad como se sugiere es muy importante para el éxito. Para el ARN altamente degradado de muestras incrustadas de parafina fijada en formalina, ensamble la primera reacción de síntesis de hebra sobre hielo de acuerdo con la tabla. Mezcle a fondo las reacciones pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces antes de girar brevemente hacia abajo las muestras en una microcentrífuga.
Al final de la centrifugación, coloque inmediatamente las muestras en un ciclor térmico precalentado siguiendo el programa número tres de la tabla. Para el ARN intacto de alta calidad, ensamble la primera reacción de síntesis de hebra sobre hielo en un tubo pcR libre de nucleasas como se describe en las tablas. Para comenzar este procedimiento, mezcle 200 nanogramos de la biblioteca de códigos de barras de interés con dos microgramos de ADN COT-1 y dos microlitros de oligos de bloqueo en un tubo PCR libre de nucleasas.
A continuación, utilice un concentrador de vacío establecido en 30 a 45 grados Celsius para secar el contenido del tubo. Después de la hibridación, retire las muestras del ciclor térmico y ajuste el ciclor térmico para incubar a 65 grados Celsius con la tapa calentada ajustada a 70 grados celsius. Utilice una pipeta multicanal para transferir 17 microlitros de perlas totalmente homogeneizadas a las muestras y pipetas completamente arriba y abajo 10 veces.
Para unir el ADN a las perlas, coloque los tubos en el ciclor térmico siguiendo el programa 10 retirando brevemente los tubos despojados cada 10 a 12 minutos durante tres segundos de vórtice suave para mantener las perlas resuspendidas. Inmediatamente después de la incubación de unión, retire una tira de tubos del ciclor térmico y agregue 100 microlitros de tampón de lavado precalentado uno a los tubos. Pipetear completamente hacia arriba y hacia abajo 10 veces y coloque los tubos en un bastidor magnético para permitir que las perlas se separen completamente de la solución de lavado antes de aspirar el ADN sin ataduras que contiene sobrenadante.
Retire los tubos del bastidor y agregue 150 microlitros de tampón de lavado estricto precalentado con una mezcla a fondo para resuspender completamente las perlas teniendo cuidado de evitar burbujas. Vuelva a colocar los tubos en el ciclor térmico a 65 grados Centígrados durante cinco minutos antes de volver a colocar los tubos en el bastidor magnético para permitir que las perlas se separen completamente de los sobrenadantes. Deseche el ADN sin ataduras que contiene sobrenadantes, lave las cuentas una vez más con tampón de lavado estricto precalentado como acaba de demostrar para un total de dos lavados estrictos.
Después del último lavado, retire el sobrenadante y agregue 150 microlitros de tampón de lavado a temperatura ambiente uno a los tubos. Pipetear el lavado de 10 a 20 veces para resuspender completamente las perlas e incubar las muestras con la tapa sellada durante dos minutos alternando entre el vórtice durante 30 segundos y descansando durante 30 segundos. Al final de la incubación, centrifugar brevemente y coloque los tubos en el bastidor magnético y retire el sobrenadante una vez que las perlas se hayan adherido completamente al imán.
Centrifugar brevemente los tubos con las tapas cerradas y devolver las muestras al bastidor magnético. Utilice una pipeta de 10 microlitros para eliminar cualquier tampón de lavado residual y añadir 150 microlitros de la tampón de lavado a temperatura ambiente dos. Pipetear el lavado de 10 a 20 veces para resuspender completamente las perlas e incubar las muestras con las tapas selladas durante dos minutos alternando entre vórtice durante 30 segundos y descansando durante 30 segundos.
Después de una breve centrifugación, transfiera todo el volumen de perlas de cada tubo a tubos PCR limpios sin nucleasas y coloque los tubos en el bastidor magnético. Después de desechar el ADN sin ataduras que contiene sobrenadantes, centrifuga brevemente las muestras de nuevo y use una pipeta de 10 microlitros para eliminar cualquier tampón de lavado residual de las perlas mientras están en el bastidor magnético. Agregue 150 microlitros de tampón de lavado tres a los tubos y pipetee hacia arriba y hacia abajo de 10 a 20 veces para resuspender completamente las perlas.
Incubar el tubo durante dos minutos alternando entre 30 segundos de vórtice suave y 30 segundos de descanso antes de centrifugar brevemente. Coloque los tubos en el bastidor magnético para aspirar los sobrenadantes y centrifugar brevemente las muestras de cordón de nuevo. Utilice una pipeta de 10 microlitros para eliminar cualquier tampón de lavado residual de las perlas mientras están en el bastidor magnético antes de retirar los tubos del bastidor y resuspender las perlas en 20 microlitros de agua libre de nucleasas por tubo.
A continuación, pipetear las cuentas 10 veces para asegurarse de que las perlas pegadas a un lado de los tubos se han resuspendido. La presencia de dimers de adaptador debe evaluarse para determinar si es necesaria una limpieza adicional. Por ejemplo, este electroferograma muestra un nivel aceptable de dimer adaptador que aparece como un pico agudo alrededor de 128 pares base, mientras que este electroferograma muestra un nivel inaceptable de dimer adaptador.
Los perfiles inmunológicos previos y posteriores al tratamiento se pueden utilizar para comprender los efectos de una terapia específica en el microambiente tumoral, como en este análisis representativo para el que los cambios en el porcentaje para cada célula inmune de interés y el contenido inmune total se muestran antes y después de la quimioterapia para un solo paciente. En este análisis, las muestras entre grupos de pacientes se compararon de acuerdo con su tiempo hasta la progresión de la enfermedad después del tratamiento. Un subconjunto de los pacientes mostró recurrencia de la enfermedad después de 18 meses, mientras que otro subconjunto progresó más rápido en 18 o menos meses.
El valor medio del delta podría compararse para cada muestra para identificar biomarcadores putativos de progresión de la enfermedad. Por ejemplo, aquí dos genes de escape inmune se identificaron como diferenciadores estadísticamente significativos de las agrupaciones de muestras. Debido a que los biomarcadores genéticos individuales eran robustos con una clara significación estadística, el biomarcador multidimensional no añadía un valor predictivo significativo.
Asegúrese de realizar los lavados calentados una tira a la vez para evitar el enfriamiento de la muestra y recuerde transferir las perlas a tubos frescos para evitar la contaminación fuera del objetivo. Este protocolo demuestra el uso de modelos de expresión génica para cuantificar las células inmunitarias y el tejido tumoral. Se están desarrollando nuevos modelos para medir estados celulares como el agotamiento o la activación.
