Damos las gracias a Tran Huynh, Andrés San Antonio, Jerry Lin por su asistencia técnica. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones DA023700 y DA023700 04S1-a XX

1. Cerebro rebanada preparación <ol><li> Los ratones transgénicos son profundamente anestesiados con pentobarbital sódico (&gt; 100 mg / kg, ip) y decapitado con rapidez, y sus cerebros extraídos en una solución de corte congelado y oxigenada. </li><li> Gafas de GFP se utilizan para detectar visualmente si el cerebro del ratón de hecho expresa GFP. </li><li> Primaria secciones somatosensorial cortical de 400 micras de grosor se cortan con un vibratome de sacarosa que contienen líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF). Las láminas se incuban primero en sacarosa que contienen ACSF durante 30 minutos a 1 hora a 32 ° C, y después del período inicial de incubación, se transfirió a ACSF grabación a temperatura ambiente. A lo largo de la incubación y el registro, las rebanadas son continuamente burbujas con un 95% de O 2 -5% de CO 2. </li></ol> 2. Equipo de inicio La implementación del sistema en general se ilustra en la Figura 1. <ol><li> El sistema de enfriamiento por láser y el proveedor se conecta la alimentación, para obtener el láser listo. </li><li> Todo el hardware relacionados con el control de la fotoestimulación (incluido el sistema de escaneado con espejo, un modulador óptico, un obturador electrónico y un amplificador de fotodiodo de entrada) está activada. </li><li> El equipo de electrofisiología (incluyendo un amplificador MultiClamp 700B y micromanipulador) está activada. Registros electrofisiológicos, fotoestimulación, y las imágenes de los preparativos de corte se realizan en una cámara de perfusión corte montado en la platina del microscopio. </li><li> La cámara de imágenes (Retiga 2000, Q-imagen, Austin, TX) está activada. Los sectores se visualizaron con el microscopio en posición vertical (BW51X, Olympus) con contraste diferencial de interferencia infrarroja (DIC) y epi-fluorescencia óptica a través del sistema de imágenes. </li><li> El software basado en Matlab EPHUS Q y software de captura de la cámara se puso en marcha. Una versión modificada de la medida Ephus software (Ephus, disponible en <a href="https://openwiki.janelia.org/">https://openwiki.janelia.org/</a> ) se utiliza para controlar los protocolos de fotoestimulación y adquirir datos de la fotoestimulación. </li><li> Después de que el sistema está encendido, se debe comprobar para ver si el sistema de fotoestimulación con láser se encuentra en un estado de trabajo. Como el objetivo del microscopio 4x se utiliza para la entrega de los destellos de rayos UV para uncaging glutamato, un pedazo de papel blanco puede ser sometido a observar el patrón de escaneo láser, mientras que el sistema funciona. </li></ol> 3. La creación de la perfusión rebanada <ol><li> Un sistema de perfusión a presión se activa para alimentar a los ACSF grabación en la cámara de corte. Hay que tener cuidado para asegurar un nivel de fluido constante de 2,0 mm por encima de la rebanada en la cámara. </li><li> Una parte alícuota de la solución madre de MNI-enjaulado-glutamato se añade a 25 ml de circulación ACSF para una concentración de 0.2 mM de glutamato enjaulado. Tenga en cuenta que después de 5-6 h de la experimentación, la solución del baño y el MNI-glutamato se actualizará. </li><li> Una porción del cerebro se mueve dentro de la cámara de grabación. Se puede ejecutar el sistema de imagen para comprobar la calidad de corte y anatómicamente localizar el área somatosensorial primaria. A continuación, la división se sujeta con un anillo de platino por encargo de cuerda. Tenga cuidado de no poner el ancla en la región del cerebro destinadas a las grabaciones. </li></ol> 4. Patch-clamp de células enteras de grabación <ol><li> Los electrodos de vidrio (4.6 mW resistencia) se tira y se llena con una solución interna que contiene 0,1% biocitina para el etiquetado de las células y la identificación morfológica. </li><li> Para realizar la grabación de parches, las células se visualizan en el objetivo de 60x. Tipos de células inhibidoras se identificó por primera vez y seleccionados en base a la visualización de la expresión de GFP en un microscopio Olympus DIC / fluorescentes, las grabaciones se realizaron posteriormente bajo control visual ayuda de la monitorización de vídeo infrarrojo DIC. Tenga en cuenta que un par de veces para cambiar entre los modos de DIC y fluorescencia es necesario para confirmar la localización de células GFP mientras se aproximaba el electrodo de la célula diana. </li><li> Las técnicas convencionales de sujeción de parches se aplican. El electrodo se llena con presión positiva, se acercó a la superficie celular para establecer un hoyuelo percibir en el momento de la membrana de la célula objetivo, y entonces la presión negativa es aplicada rápidamente para formar un gigaseal y ruptura de monitoreo de las respuestas, mientras que la inyección de corriente en el monitor de vídeo. </li><li> Al romper en las imágenes de la celda en 60 veces en los modos de DIC y fluorescencia se toman para la verificación en línea. Antes de la recolección de los datos de la fotoestimulación, hiperpolarización y despolarización pulsos de corriente se inyecta a examinar cada célula de las propiedades electrofisiológicas básicas. </li><li> Grabaciones de todo, una vez estable de células se obtienen con la resistencia a un buen acceso (por lo general &lt;20 MW), el objetivo del microscopio se cambia de 60x a 4x para fotoestimulación de escaneo láser. La imagen de corte a 4x se adquiere y se usa para guiar y registrar los sitios de fotoestimulación. </li></ol> 5. Laser scanning fotoestimulación <ol><li> Los parámetros de adquisición de la fotoestimulación y los datos se establece mediante la activación del módulo de conmutador de configuración de Ephus. Normalmente, de 1 ms con láser (20 mW) con un intervalo de estímulo de 1 segundo se utiliza para la asignación de fotoestimulación. Trazas de datos de un segundo muestreo a 10 kHz se adquieren. </li><li> La imagen de rebanada de 4x se carga en el módulo de mapeo de Ephus. La ubicación del soma celular se define, y los sitios de fotoestimulación de un patrón de 16x16 (80 m x 80 m distancia) se establecen en torno a la ubicación de la celda, que abarca todas las capas corticales. </li><li> El perfil de excitación de la neurona registrada se asigna mediante el examen de los lugares de remate en respuesta a la fotoestimulación en el modo de pinza de corriente. Nuestro software de fácil manejo con las características de visualización en línea facilita la asignación de los experimentos. </li><li> Local conexiones del circuito de excitación se asignan mediante la detección de corrientes de excitación post-sináptica (EPSC) de la célula grabado mientras escaneo láser en diferentes lugares. La célula se mantiene a -70 mV en el modo de fijación de voltaje para detectar las corrientes hacia el interior de excitación. Los mapas EPSC se repiten 2-3 veces con la gira de la fotoestimulación patrón o volteado. </li><li> Opcional: conexiones de los circuitos inhibitorios locales también pueden asignar mediante la detección de inhibidores postsinápticos corrientes (IPSC) de la célula registró a cabo en cerca de 0 mV en el modo de fijación de voltaje para detectar las corrientes hacia el exterior inhibitorio. Tenga en cuenta que lo mejor es utilizar la solución de electrodo interno con el potasio sustituido por el cesio para la asignación de IPSC. </li><li> Después de todas las pruebas fisiológicas se han completado, el electrodo se retira suavemente desde la celda registrado. Los cortes de cerebro se saca y se fijaron en paraformaldehído al 4% durante la noche. Las células teñidas se registra contra biocitina. La morfología celular se examina con microscopio confocal o epi-fluorescencia, lo que confirma también que cada célula registrado es de hecho el interneuronas que expresan GFP previstos inicialmente. </li></ol> 6. Fotoestimulación de análisis de datos Nuestra metodología de reciente desarrollo e implementación de software 11 se aplica a la detección y medida de fotoestimulación evocado acontecimientos sináptica en los mapas de los datos en bruto. Como se ejemplifica en la figura 2, un código de colores los mapas se construyen para ilustrar el patrón de entrada sináptica de las neuronas registradas. 7. Los resultados representativos: Ejemplo de resultados de registro electrofisiológico y la cartografía de la fotoestimulación se muestran en la Figura 2. Grabaciones objetivo de tipos específicos de células inhibitorias son posibles mediante el uso de ratones transgénicos que expresan GFP en conocidos tipos de células inhibitorias. Dada la diversidad de las interneuronas inhibitorias, análisis de expresión de las buenas prácticas agrarias, la electrofisiología intrínseco y características morfológicas (Figura 2) se combinan para llegar a la clasificación de las células de tipo final. Figura 2B-C muestran que la fotoestimulación de escaneo láser permite la asignación de locales amplios conexiones del circuito cortical en un solo neuronas inhibidoras. El mapa de los datos en bruto se muestra en la Figura 2C. Las respuestas uncaging directos están excluidas de análisis de datos (Fig. 2C). Los mapas de entrada cuantitativos están codificados por colores, que se muestra en la Figura 2D-F. El ejemplo de rápido remate interneuronas inhibitorias recibió un fuerte entrada de excitación sináptica (EPSCs) de la capa 4 y las capas más profundas. Al relacionar la organización de la célula de la entrada sináptica a definir las vías corticales, que son capaces de inferir su posible papel (por ejemplo, la retroalimentación y la inhibición de feedforward) en el procesamiento de información cortical. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3109/3109fig1.jpg" /> Figura 1. Instrumentación de sistema general de fotoestimulación de escaneo láser. Nuestro sistema general consiste en el control de la fotoestimulación, imágenes de video y sistemas de grabación electrofisiológica. Hemos aprobado el diseño del sistema de LSP se describió anteriormente 7,17. Una unidad de láser se utiliza para generar 355 nm láser ultravioleta para uncaging glutamato. El rayo láser se dirige a través de la trayectoria óptica de nuestro sistema. Corta duración de destellos láser (por ejemplo, 1 - 3 ms) son controlados por medio de un modulador electro-óptico (es decir, células Pockels) y un obturador mecánico. La potencia del láser de haz es modulada por una rueda de gradiente de densidad neutral y supervisado por la desviación de una pequeña fracción del haz de láser con un cubreobjetos de un fotodiodo. El sistema de escaneo láser incluye un par XY de los espejos de escaneo, la lente de escaneado, el lente del tubo, y la lente del objetivo. Los espejos de entregar el rayo láser a través de una lente de exploración, a continuación, el haz entra en el microscopio a través de un espejo dicroico y se centra por una lente de tubo a medida UV-transmisión. El haz bajo rellenos de la abertura posterior del objetivo del microscopio para proporcionar una más columnas (en lugar de cónicos), haz de iluminación, mantenimiento de la cartografía como de dos dimensiones como sea posible al reducir la resolución axial. Con arreglo al objetivo de 4x, el rayo láser forma manchas uncaging, cada approximating un perfil gaussiano con un ancho de 153 m lateralmente en el plano focal (ver recuadro). Varios puestos de la estimulación con láser se puede lograr a través de galvanómetros impulsada por los espejos de escaneo XY, como los espejos y la apertura posterior del objetivo están en planos conjugados, la traducción de las posiciones espejo en diferentes localizaciones de exploración en el plano focal de la lente objetivo. Durante uncaging, un número variable de páginas con dibujos que abarca todo el campo son estimulados de forma secuencial en un nonraster, secuencia aleatoria para evitar volver a visitar los alrededores de los sitios recientemente estimulada. Por favor refiérase a Xu et al. (2010) para obtener información más detallada. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3109/3109fig2.jpg" /> Figura 2. Asignación de conexiones del circuito local de excitación a un expresan GFP rápido clavar las interneuronas de la capa 4 de la corteza sensorial primaria del ratón. A1 y ​​A2 muestran la DIC y fluorescente GFP imágenes de la célula se prevé en el objetivo de 60x en la porción del cerebro que viven, mientras que muestra A3 la morfología de las células reveló mediante tinción biocitina en el post-registro, el tramo fijo. A4 muestra los patrones de descarga de la célula de las buenas prácticas agrarias registradas, característica de un interneuronas inhibitorias rápido remate, en respuesta a las inyecciones de intrasomatic actual de diferentes potencias. B mostrar la imagen de corte superpuestas con los 16 sitios de fotoestimulación x16 (*). La ubicación de la celda se indica por el pequeño círculo rojo. C muestra una serie de fotoestimulación evocado por los rastros de respuesta de las ubicaciones de la estimulación se muestra en la B, mientras que la célula se llevó a cabo a -70 mV para detectar las corrientes hacia el interior de excitación. Las diferentes formas de respuestas fotoestimulación se ilustran por las huellas en los lugares de 1 y 2, que se expanden y se muestran por separado en el inserto. La huella 1 es un ejemplo de las respuestas directas (indicado por las flechas rojas) para glutamato uncaging en el cuerpo celular y las dendritas promximal. Otras huellas en 2 son ejemplos típicos de las respuestas de excitación sináptica de entrada (azul). Respuestas directas y entradas sinápticas pueden ser distinguidos por sus amplitudes y las latencias de respuesta. D, E y F son los mapas codificados por color (16x16 sitios) de la media de EPSC amplitud, el número de EPSC, y la primera latencia detectado EPSC por sitio, respectivamente, para los datos en bruto mapa que se muestra en C. La amplitud media de entrada de cada lugar de estimulación es la amplitud media de EPSCs en la ventana de análisis, con la respuesta espontánea de referencia resta de la respuesta de la fotoestimulación del mismo sitio. El número de EPSCs y la hora de llegada o la latencia de la EPSC detectó por primera vez por el sitio también se miden y se representan. Por favor, consulte (Shi et al., 2010) para más detalles.

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	<li>Ascoli, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Petilla+terminology:+nomenclature+of+features+of+GABAergic+interneurons+of+the+cerebral+cortex.">Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex.</a> Nature. 9, 557-568 (2008).</li><li>Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneurons+of+the+neocortical+inhibitory+system.">Interneurons of the neocortical inhibitory system.</a> Nature. 5, 793-807 (2004).</li><li>Xu, X., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+specificity+of+functional+input+to+distinct+types+of+inhibitory+cortical+neurons.">Laminar specificity of functional input to distinct types of inhibitory cortical neurons.</a> J Neurosci. 29, 70-85 (2009).</li><li>Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunochemical+characterization+of+inhibitory+mouse+cortical+neurons:+three+chemically+distinct+classes+of+inhibitory+cells.">Immunochemical characterization of inhibitory mouse cortical neurons: three chemically distinct classes of inhibitory cells.</a> J Comp Neurol. 518, 389-404 (2010).</li><li>Dantzker, J. L., Callaway, E. 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A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuit+analysis+of+experience-dependent+plasticity+in+the+developing+rat+barrel+cortex.">Circuit analysis of experience-dependent plasticity in the developing rat barrel cortex.</a> Neuron. 38, 277-289 (2003).</li><li>Weiler, N., Wood, L., Yu, J., Solla, S. A., Shepherd, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+laminar+organization+of+the+excitatory+network+in+motor+cortex.">Top-down laminar organization of the excitatory network in motor cortex.</a> Nat Neurosci. 11, 360-366 (2008).</li><li>Xu, X., Olivas, N. D., Levi, R., Ikrar, T., Nenadic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+precision+and+fast+functional+mapping+of+cortical+circuitry+through+a+combination+of+voltage+sensitive+dye+imaging+and+laser+scanning+photostimulation.">High precision and fast functional mapping of cortical circuitry through a combination of voltage sensitive dye imaging and laser scanning photostimulation.</a> J Neurophysiol. 103, 2301-2312 (2010).</li><li>Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+cortical+inhibitory+neuron+type+that+coexpresses+somatostatin+and+calretinin.">Mouse cortical inhibitory neuron type that coexpresses somatostatin and calretinin.</a> J Comp Neurol. 499, 144-160 (2006).</li><li>Shi, Y., Nenadic, Z., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+use+of+matched+filtering+for+synaptic+event+detection+and+extraction.">Novel use of matched filtering for synaptic event detection and extraction.</a> PLoS ONE. 5, e15517-e15517 (2010).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+labeling+and+functional+manipulation+of+specific+neuron+types+in+mouse+brain+by+Cre-activated+viral+gene+expression.">High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression.</a> PLoS ONE. 3, e2005-e2005 (2008).</li><li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections.">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).</li><li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections.">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457, 1142-1145 (2009).</li><li>Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Driving+fast-spiking+cells+induces+gamma+rhythm+and+controls+sensory+responses.">Driving fast-spiking cells induces gamma rhythm and controls sensory responses.</a> Nature. 459, 663-667 (2009).</li><li>Shepherd, G. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+and+columnar+organization+of+ascending+excitatory+projections+to+layer+2/3+pyramidal+neurons+in+rat+barrel+cortex.">Laminar and columnar organization of ascending excitatory projections to layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex.</a> J Neurosci. 25, 5670-5679 (2005).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Fotoestimulación técnicas basadas en la cartografía han sido efectivamente aplicadas para el análisis de los circuitos corticales. Fotoestimulación de escaneo láser combinado con la grabación de células completas permite el mapeo de alta resolución de la distribución laminar de las fuentes de entrada presináptica de neuronas individuales, ya que el registro simultáneo de una neurona postsináptica con fotoestimulación de grupos de neuronas presinápticas en muchos lugares diferentes proporciona medidas cuan...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> líneas transgénicas de ratón </td><td> Jackson de laboratorio o de otras fuentes </td><td></td><td> Por favor refiérase a Xu y Callaway (2009) </td></tr><tr><td> GFP gafas </td><td> BLS Ltd., Hungría </td><td></td><td></td></tr><tr><td> vibratome </td><td> Leica </td><td> VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> MNI enjaulados glutamato (4-metoxi-7-nitroindolinyl-jaula L-glutamato) </td><td> Bioscience Tocris, Ellisville, MO </td><td> No. Cat. 1490 </td><td></td></tr><tr><td> biocitina </td><td></td><td> B4261 </td><td></td></tr><tr><td> electrodo extractor </td><td> Sutter Instrument, Novato, CA </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> tubos de vidrio para la fabricación de electrodos </td><td></td><td> BF150-86-10 </td><td></td></tr><tr><td> MultiClamp amplificador 700B </td><td> Molecular Devices, Sunnyvale, CA </td><td> MultiClamp 700B </td><td></td></tr><tr><td> digital de la cámara CCD </td><td> Q-imagen, Austin, TX </td><td> Retiga 2000 </td><td></td></tr><tr><td> Investigación microscopio </td><td> Olympus, Tokio, Japón </td><td> BW51X </td><td></td></tr><tr><td> Unidad láser UV </td><td> DPSS láser, Santa Clara, CA </td><td> modelo 3501 </td><td></td></tr><tr><td> Otros equipos para escaneo láser phostimulation </td><td></td><td></td><td> Por favor refiérase a Xu et al (2010). </td></tr></tbody></table> Soluciones: <ul><li> Sacarosa que contienen líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) para el corte de corte (en mM: NaCl 85, 75 sacarosa, 2,5 KCl, 25 de glucosa, 1,25 NaH 2 PO 4, 4 MgCl 2, 0,5 CaCl 2, y 24 de NaHCO 3). </li><li> Grabación ACSF (en mM: 126 NaCl, 2,5 KCl, 26 NaHCO 3, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, y la glucosa 10) </li><li> Electrodo interno solución (en mM: 126 K-gluconato, 4 KCl, 10 HEPES, 4 ATP-Mg, 0,3 GTP-Na, y fosfocreatina 10, pH 7,2, 300 mOsm). </li></ul>

mapping inhibitory neuronal circuits by laser scanning photostimulation

Neuronas inhibidoras son cruciales para la función cortical. Que comprenden un 20% de toda la población de neuronas corticales y puede subdividirse en diversos subtipos sobre la base de sus propiedades inmunoquímicas, morfológicas, fisiológicas y 1-4. Aunque investigaciones previas han revelado mucho sobre las propiedades intrínsecas de los distintos tipos de neuronas inhibitorias, el conocimiento acerca de sus conexiones en el circuito local sigue siendo relativamente limitada 3,5,6. Teniendo en cuenta que la función de cada neurona individual está marcada por su entrada de excitación e inhibición sináptica dentro de los circuitos corticales, que hemos estado usando escaneo láser fotoestimulación (LSP) a las conexiones mapa del circuito local para tipos específicos de células inhibitorias. En comparación con la estimulación eléctrica convencional o la estimulación de hojaldre glutamato, LSP tiene ventajas únicas permitiendo para el mapeo de amplia y el análisis cuantitativo de los insumos locales funcionales registrados individualmente neuronas 3,7-9. Fotoestimulación con láser a través de uncaging glutamato activa selectivamente las neuronas perisomatically, sin necesidad de activar los axones de paso o dendritas distal, lo que garantiza una resolución de asignación de sub-laminar. La sensibilidad y la eficiencia de los proveedores de servicios lingüísticos para las entradas de mapeo de los sitios de estimulación muchos sobre una gran región son muy adecuadas para el análisis de circuitos corticales. Aquí se introduce la técnica de la LSP en combinación con células enteras patch clamp para la asignación de locales del circuito inhibitorio. Grabaciones objetivo de tipos específicos de células inhibidoras se ven facilitadas por el uso de ratones transgénicos que expresan proteínas verde fluorescente (GFP) en poblaciones de neuronas inhibidoras limitan la corteza 3,10, lo que permite el muestreo constante de los tipos de células específicas y la identificación inequívoca de los tipos celulares registrados . En cuanto a la asignación de LSP, se describe la instrumentación del sistema, se describe el procedimiento experimental y de adquisición de datos, y se presentan ejemplos de los mapas del circuito en el ratón corteza somatosensorial primaria. Como se ilustra en nuestros experimentos, el glutamato enjaulados se activa en una región espacialmente restringida de los cortes de cerebro por fotólisis láser UV; simultánea fijación de voltaje, las grabaciones permiten la detección de fotoestimulación-evocó las respuestas sinápticas. Mapas de cualquiera de las entradas sinápticas excitadoras o inhibidoras de la neurona objetivo se generan mediante el escaneo del rayo láser para estimular a cientos de posibles sitios presináptica. Por lo tanto, LSP permite la construcción de mapas detallados de las entradas sinápticas que inciden en los tipos específicos de neuronas inhibitorias a través de repetidos experimentos. En conjunto, la técnica basada en la fotoestimulación ofrece neurocientíficos una herramienta poderosa para la determinación de la organización funcional de los circuitos corticales locales.

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Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

Este documento presenta un enfoque combinado de fotoestimulación láser con las grabaciones de células enteras en ratones transgénicos que expresan GFP en poblaciones de neuronas inhibidoras limitan. La técnica permite la cartografía y de análisis cuantitativo de los locales de los circuitos sinápticos de las neuronas corticales específicas inhibitorias.

Mapeo de los circuitos neuronales inhibitorios por Laser Scanning fotoestimulación

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into ...

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Neuroscience

17.2K vistas.  University of California, Irvine. Este documento presenta un enfoque combinado de fotoestimulación láser con las grabaciones de células enteras en ratones transgénicos que expresan GFP en poblaciones de neuronas inhibidoras limitan. La técnica permite la cartografía y de análisis cuantitativo de los locales de los circuitos sinápticos de las neuronas corticales específicas inhibitorias.

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Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the interactions of these forebrain circuits has been aided recently by the development of optogenetic methods for light-mediated modulation of neuronal activity. Here, we describe a protocol for examining the functional organization of forebrain circuits&#160;in vitro using laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin, expressed optogenetically via viral-mediated transfection. This approach also exploits the utility of cre-lox recombination in transgenic mice to target expression in specific neuronal cell types. Following transfection, neurons are physiologically recorded in slice preparations using whole-cell patch clamp to measure their evoked responses to laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin expressing fibers. This approach enables an assessment of functional topography and synaptic properties. Morphological correlates can be obtained by imaging the neuroanatomical expression of channelrhodopsin expressing fibers using confocal microscopy of the live slice or post-fixed tissue. These methods enable functional investigations of forebrain circuits that expand upon more conventional approaches.

We describe a method for characterizing the functional topography and synaptic properties of forebrain circuits using an optogenetic approach to photostimulate neuronal populations&#160;in vitro.

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

Investigación

Neurociencias

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

La inducción de la plasticidad de astrocítico Receptores por manipulación de Neuronales cocción Precios

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Design, Surface Treatment, Cellular Plating, and Culturing of Modular Neuronal Networks Composed of Functionally Inter-connected Circuits

The brain operates through the coordinated activation and the dynamic communication of neuronal assemblies. A major open question is how a vast repertoire of dynamical motifs, which underlie most diverse brain functions, can emerge out of a fixed topological and modular organization of brain circuits. Compared to in vivo studies of neuronal circuits which present intrinsic experimental difficulties, in vitro preparations offer a much larger possibility to manipulate and probe the structural, dynamical and chemical properties of experimental neuronal systems. This work describes an in vitro experimental methodology which allows growing of modular networks composed by spatially distinct, functionally interconnected neuronal assemblies. The protocol allows controlling the two-dimensional (2D) architecture of the neuronal network at different levels of topological complexity.
A desired network patterning can be achieved both on regular cover slips and substrate embedded micro electrode arrays. Micromachined structures are embossed on a silicon wafer and used to create biocompatible polymeric stencils, which incorporate the negative features of the desired network architecture. The stencils are placed on the culturing substrates during the surface coating procedure with a molecular layer for promoting cellular adhesion. After removal of the stencils, neurons are plated and they spontaneously redirected to the coated areas. By decreasing the inter-compartment distance, it is possible to obtain either isolated or interconnected neuronal circuits. To promote cell survival, cells are co-cultured with a supporting neuronal network which is located at the periphery of the culture dish. Electrophysiological and optical recordings of the activity of modular networks obtained respectively by using substrate embedded micro electrode arrays and calcium imaging are presented. While each module shows spontaneous global synchronizations, the occurrence of inter-module synchronization is regulated by the density of connection among the circuits.

This manuscript describes a protocol to grow in vitro modular networks consisting of spatially confined, functionally inter-connected neuronal circuits. A polymeric mask is used to pattern a protein layer to promote cellular adhesion over the culturing substrate. Plated neurons grow on coated areas establishing spontaneous connections and exhibiting electrophysiological activity.

Diseño, tratamiento de superficies, Celular Forrado, y cultivo de Modular Redes Neuronales Compuesto de circuitos conectados-Inter Funcionalmente

The brain operates through the coordinated activation and the dynamic communication of neuronal assemblies. A major open question is how a vast repertoire ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake through electroporation in brain explants with targeted laser illumination and matching filter goggles during the procedure. The described technique of in vitro electroporation by itself yields relatively good visual control for targetting certain areas of the brain. By combining it with laser excitation of fluorescent genetic markers and their read-out through band-passing filter goggles, which can pick up the emissions of the genetically labeled cells/nuclei and the fluorescent tracing dye, a researcher can substantially increase the accuracy of injections by finding the area of interest and controlling for the dye-spread/uptake in the injection area much more efficiently. In addition, the laser illumination technique allows to study the functionality of a given neurocircuit by providing information about the type of neurons projecting to a certain area in cases where the GFP expression is linked to the type of transmitter expressed by a subpopulation of neurons.

We describe a technique to label neurons and their processes via anterograde or retrograde tracer injections into brain nuclei using an in vitro preparation. We modified an existing method of in vitro tracer electroporation by taking advantage of fluorescently labeled mouse mutants and basic optical equipment in order to increase labeling accuracy.

Neuronal Tracing en explantes cerebrales guiadas por láser

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and accurately reconnect them with an appropriate target. Here a procedure is described to rapidly initiate, elongate, and precisely connect new functional neuronal circuits over long distances. The extension rates achieved reach over 1.2 mm/h, 30-60 times faster than the in vivo rates of the fastest growing axons from the peripheral nervous system (0.02 to 0.04 mm/h)28 and 10 times faster than previously reported for the same neuronal type at an earlier stage of development4. First, isolated populations of rat hippocampal neurons are grown for 2-3 weeks in microfluidic devices to precisely position the cells, enabling easy micromanipulation and experimental reproducibility. Next, beads coated with poly-D-lysine (PDL) are placed on neurites to form adhesive contacts and pipette micromanipulation is used to move the resulting bead-neurite complex. As the bead is moved, it pulls out a new neurite that can be extended over hundreds of micrometers and functionally connected to a target cell in less than 1 h. This process enables experimental reproducibility and ease of manipulation while bypassing slower chemical strategies to induce neurite growth. Preliminary measurements presented here demonstrate a neuronal growth rate far exceeding physiological ones. Combining these innovations allows for the precise establishment of neuronal networks in culture with an unprecedented degree of control. It is a novel method that opens the door to a plethora of information and insights into signal transmission and communication within the neuronal network as well as being a playground in which to explore the limits of neuronal growth. The potential applications and experiments are widespread with direct implications for therapies that aim to reconnect neuronal circuits after trauma or in neurodegenerative diseases.

This procedure describes how to rapidly initiate, extend and connect neurites organized in microfluidic chambers using poly-D-lysine-coated beads fixed to micropipettes that guide neurite elongation.

Rewiring Neuronal Circuits: Un Nuevo Método Para La Extensión Neurítica Rápida Y La Conexión Neuronal Funcional

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a closed-loop event-triggered manner. Although many studies are focusing on the possible benefits and side-effects of TES in healthy and pathologic brains, there are still many fundamental open questions regarding the mechanism of action of the stimulation. Therefore, there is a clear need for a robust and reproducible method to test the acute and the chronic effects of TES in rodents. TES can be combined with regular behavioral, electrophysiological, and imaging techniques to investigate neuronal networks in vivo. The implantation of transcranial stimulation electrodes does not impose extra constraints on the experimental design while it offers a versatile, flexible tool to manipulate brain activity. Here we provide a detailed, step-by-step protocol to fabricate and implant transcranial stimulation electrodes to influence brain activity in a temporally constrained manner for months.

This detailed protocol describes transcranial stimulation electrode placement on the temporal bone in order to investigate the short- and long-term effects of transcranial electrical stimulation in freely moving rats.

Estimulación eléctrica transcraneal crónica y grabación Intracortical en ratas

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

Combinando Optogenetics con microRNAs artificiales para caracterizar los efectos de Gene caída en la función presináptica en circuitos neuronales intactas

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

Optogenetic de arrastre de las oscilaciones Theta Hippocampal en comportarse ratones

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively thin to properly visualize and access neurons for patch-clamping or imaging, and in vitro examination of brain circuitry is limited to only what is physically present in the acute slice. To maintain the benefits of in vitro slice experimentation while preserving a larger portion of presynaptic nuclei, we developed a novel slice preparation. This &#8220;wedge slice&#8221; was designed for patch-clamp electrophysiology recordings to characterize the diverse monaural, sound-driven inputs to medial olivocochlear (MOC) neurons in the brainstem. These neurons receive their primary afferent excitatory and inhibitory inputs from neurons activated by stimuli in the contralateral ear and corresponding cochlear nucleus (CN). An asymmetrical brain slice was designed which is thickest in the rostro-caudal domain at the lateral edge of one hemisphere and then thins towards the lateral edge of the opposite hemisphere. This slice contains, on the thick side, the auditory nerve root conveying information about auditory stimuli to the brain, the intrinsic CN circuitry, and both the disynaptic excitatory and trisynaptic inhibitory afferent pathways that converge on contralateral MOC neurons. Recording is performed from MOC neurons on the thin side of the slice, where they are visualized using DIC optics for typical patch-clamp experiments. Direct stimulation of the auditory nerve is performed as it enters the auditory brainstem, allowing for intrinsic CN circuit activity and synaptic plasticity to occur at synapses upstream of MOC neurons. With this technique, one can mimic in vivo circuit activation as closely as possible within the slice. This wedge slice preparation is applicable to other brain circuits where circuit analyses would benefit from preservation of upstream connectivity and long-range inputs, in combination with the technical advantages of in vitro slice physiology.

Integration of diverse synaptic inputs to neurons is best measured in a preparation that preserves all pre-synaptic nuclei for natural timing and circuit plasticity, but brain slices typically sever many connections. We developed a modified brain slice to mimic in vivo circuit activity while maintaining in vitro experimentation capability.

In Vitro Wedge Slice Preparación para imitar la conectividad del circuito neuronal In Vivo

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.