Apoyado por el NIH / NIDCD R01 DC experimentos 011582. Imaging se realizaron en la Universidad de Colorado Anschutz Medical Campus Advanced Light Microscopy Core apoyado en parte por el NIH / CNRR Colorado CTSI subvención Número de UL1 RR025780 y los Trastornos de las Montañas Rocosas Neurlogical Core Center Subvención NIH P30NS048154. El Dr. Sascha du Lac, del Instituto Salk nos proporcionó los ratones GlyT2-GFP.

1. Genotipado óptico 1. óptico Genotipado de Ratón cachorros <ol><li> Compruebe para la expresión de la respectiva marcador fluorescente usando un puntero de láser de la longitud de onda de excitación apropiada (405 nm en los experimentos descritos aquí) y los correspondientes filtros de gafas que bloquean la longitud de onda de excitación, pero que pasa a la longitud de onda de emisión (450 - 700 nm en los experimentos descritos aquí) . Apunte el puntero láser en la parte posterior de la cabeza o la médula espinal de las crías de ratón (ver Figura 1). Evite que brilla el láser en los ojos y la exposición prolongada de la piel a la luz láser. </li></ol> 2. óptico Genotipado de los animales más viejos <ol><li> Profundamente anestesiar el ratón (p14 edad de p138 en los experimentos descritos aquí) con una sobredosis de pentobarbital a través de una inyección intraperitoneal (120 mg / kg de peso corporal). Confirme la anestesia correcta comprobando los reflejos del animal (pellizcar brevemente la punta del XXe oído o una de las patas traseras para provocar el reflejo de retracción de la oreja o la pierna). </li><li> Nota: A pesar de la utilización de una sobredosis de pentobarbital (120 mg / kg de peso corporal) nos referimos al proceso de inyección como &quot;anestesia profunda&quot; en lugar de la eutanasia, porque el animal es ideal sigue vivo (es decir, su corazón sigue latiendo), cuando el la cirugía y la perfusión comienzan. Esto asegura una perfusión más eficiente de los órganos internos, incluyendo el cerebro. </li><li> Una vez que el animal no muestra ningún reflejos, retirar cuidadosamente la piel que recubre el cráneo (Figura 2A) al hacer una incisión en la piel que cubre la parte posterior de la cabeza y de corte a la sección media del cráneo. Exponer el cráneo al descubierto a la luz láser y observar la fluorescencia a través de las gafas de filtro como se describió anteriormente. Si se observa una señal de GFP positivo, continúe con el paso 2, si no es así, sacrificar al animal a través de la decapitación (segundos / garantizar forma de eutanasia siguiendo nuestraReglamentos IACUC). </li></ol> Nota: En los ratones, incluso mayores (&gt; 1 mes) la fluorescencia se puede observar a través de los ojos del animal. 2. transcardial perfusión y Preparación de cerebro <ol><li> Perfundir transcardially con enfriado con hielo salina tamponada con fosfato (PBS; NaCl: 137 mM, KCl: 2,7 mM, KH 2 PO 4: 1,76 mM, Na 2 HPO 4: 10 mM) usando una aguja de jeringa 30 G para eliminar en gran medida la sangre de el animal. <ol><li> En primer lugar, abrir con cuidado la caja torácica con tijeras afiladas y luego empujar la aguja en el ventrículo izquierdo del corazón. Iniciar el bombeo de la PBS en el corazón y la aorta e inmediatamente después de este paso abrir la aurícula derecha del corazón con las tijeras para permitir que la sangre salga del cuerpo. Nota: Perfusión toma 5 - 10 min, dependiendo del tamaño del animal. </li></ol></li><li> Después de desangramiento través de la perfusión, decapitar al animal, asegurar su cabeza con el pin needles (o 30 g agujas de jeringas) por la perforación a través de las cuencas de los ojos en un plato de preparación y retire el cerebro del cráneo. <ol><li> En primer lugar, utilizar tijeras afiladas para cortar la piel que recubre la calavera: hacer una pequeña incisión en la parte posterior de la cabeza, luego se corta a lo largo de la línea media en la cara dorsal de la cabeza, corte a los lados simplemente caudal de los ojos de los animales y por último corte en la dirección caudal para eliminar completamente el colgajos de piel en la parte posterior de la cabeza. </li><li> A continuación, repita el mismo patrón de corte para el propio cráneo, asegúrese de retirar ambas cócleas en el proceso, porque esto va a simplificar significativamente la eliminación de la base del cerebro al final. Después de este procedimiento, la mitad caudal del cerebro mienta completamente expuesta. </li><li> En el siguiente paso, utilizar una hoja de afeitar afilada o un escalpelo para cortar a través de todo el cerebro anterior con un ángulo de aproximadamente 45 ° y aproximadamente 2 mm rostral del cerebelo. Saque la mitad delantera separada del cerebro con abespátula ent. </li><li> Utilice la espátula para elevar el caudal medio del cerebro en su extremo rostral y posteriormente cortar a través de los nervios craneales que todavía están conectados a la base del cerebro en su lado ventral. Como resultado final, el caudal medio del cerebro incluyendo el tronco cerebral debe caer libremente fuera el resto de la cabeza del animal preparado. </li><li> Voltear la mitad caudal eliminado del cerebro para exponer su cara ventral y cortar a lo largo del plano coronal justo rostral (para las inyecciones anterógrada) o simplemente caudal (para las inyecciones retrógradas) de las ventral ubicadas &quot;bombillas&quot; que contienen el cuerpo trapezoide (ver paso 2.3). <ol><li> Siempre use una hoja de afeitar afilada o un escalpelo para el procedimiento de corte para minimizar la muerte celular causada por la tensión mecánica excesiva sobre el tejido. Como resultado final, debería haber sido obtenido un explante cerebral que abarca alrededor de 1 cm de longitud y que contiene el complejo olivar superior completa a lo largo de otras regiones del cerebro. </li></ol></li></ol> &lt;/ li&gt; </ol> Nota: Este protocolo demuestra el procedimiento para una inyección de trazador en el cuerpo trapezoide situado en el tronco cerebral auditivo. Adaptar la ubicación y orientación de los planos de corte y sitios de inyección según sea necesario. Si las regiones del cerebro fluorescentes de interés se encuentran lo suficientemente cerca de la superficie del cerebro, de modo que puedan ser identificados y se inyectan sin cortar el cerebro (véase la Figura 2B), entonces la etapa de corte coronal puede ser omitido. <ol start="3"><li> Identificar el cuerpo trapezoide como dos &quot;bombillas&quot; prominentes ventrales contienen el núcleo ventral del cuerpo trapezoide (VNTB). </li></ol> Nota: Para mayor referencia anatómica sobre la ubicación estereotáctica aproximada de estos planos de corte, consulte Franklin &amp; Paxinos, 2008. Panel 78 del atlas, Bregma ~ -5,7 mm muestra el núcleo medial del cuerpo trapezoide (= MNTB) etiquetados como &quot;Tz &quot;. Panel 69 muestra el núcleo ventral de la bo trapezoidedy (VNTB) etiquetados como &quot;MVPO&quot; (núcleo periolivary medioventral) 19. 3. anterógrada / retrógrada Tracing Nota: Realice todos los procedimientos siguientes a RT (25 ° C). <ol><li> Después de cortar, colocar el explante tronco cerebral en un plato preparado que contiene oxigenada (95% O 2, 5% 2 CO) disección solución (NaCl 125 mM, KCl: 2,5 mM, MgCl2 1 mM, CaCl 2: 0,1 mM, glucosa : 25 mM, NaH 2 PO 4: 1,25 mM, NaHCO3: 25 mM, ácido ascórbico: 0,4 mM, myo-inositol: 3 mM, ácido pirúvico: 2 mM), asegurándola con 30 g agujas de jeringas. Asegúrese de que el área de la inyección está hacia arriba. </li><li> Tire pipetas de inyección de vidrio de borosilicato y llenarlos con una de las tres soluciones siguientes: a) una solución de 1,0 mg / ml de choleratoxin subunidad b conjugado a un Alexa fluoróforo 555 en PBS 12-13 (usado principalmente para el transporte retrógrado), b ) un 1% -dilution en 0,9% de solución salina de tetrametilrodamina dextrano 555 (3000 MW, que se utiliza principalmente para el transporte retrógrado) o c) una -dilution 1% en 0,9% de solución salina de 10.000 MW dextrano TRITC-555 (utilizado principalmente para el transporte anterógrado). <ol><li> Asegúrese de que las resistencias gama pipeta de inyección de 2,5 a 3,5 MOhm y que se fabrican en 3 - 4 ciclos de tracción. Para los experimentos descritos aquí, lograr esto mediante la selección de un algoritmo preprogramado tirando del tirador de pipeta. </li></ol></li><li> Iluminar el explante cerebro usando un puntero láser montado estáticamente de la longitud de onda apropiada (artículo Nº 2 en la Figura 3A; 405 nm de longitud de onda en los experimentos descritos aquí). Utilice el puntero láser como guía para las inyecciones, y apuntar el rayo láser hacia el núcleo o células de interés que se inyectan cerebro marcado con fluorescencia. </li><li> Encuentra y observar la zona diana iluminada a través de un microscopio binocular mientras se usan las gafas de filtro compatibles (450 - 70Filtro de paso de banda 0 nm en los experimentos descritos aquí). Insertar el electrodo de inyección a través de la micromanipulador en el área de interés. </li><li> Se inyecta la sustancia trazadora. Las inyecciones consisten en 2 - 10 pulsos de presión a 15 psi durante 50 mseg cada uno, utilizando un dispositivo de inyección a presión, dirigida perpendicular a la región de interés (ROI) dentro de la sección cerebro. Administrar cada impulso de presión a intervalos de 10 - 15 segundos para permitir que el colorante se extienda. </li><li> En el caso de las inyecciones de tetrametilrodamina (TRITC), además, estimular eléctricamente para mejorar la absorción de colorante a través de la electroporación con el electrodo colocado en el área del cerebro de interés (MNTB y VNTB en los experimentos descritos aquí). <ol><li> Utilice 8 impulsos TTL de 8 voltios durante 50 ms con 50 mseg interpulse intervalos, impulsados ​​por un estimulador y se amplifica a 55 V con una unidad de aislamiento de estimulación (artículos No. 7 y 9 en la Figura 3B). Utilice 10 - 20 repeticiones de este protocolo, administered lo largo de varios minutos 7,8. Asegúrese de conectar a tierra el electrodo correctamente - el cable de tierra se debe conectar a la solución del baño! </li></ol></li><li> Compruebe para el éxito de la inyección. Puesto que un trazador fluorescente con una longitud de onda de emisión más largo también está emitiendo una señal fluorescente tras la excitación láser con longitudes de onda más cortas, comprobar visualmente para la absorción de colorante / extendido en el área objetivo inyectado mientras ilumina la zona con el láser y observando a través de las gafas de filtro. </li></ol> 4. Incubación <ol><li> Después de la inyección, se incuban las brainstems en el fluido cerebroespinal artificial oxigenado (ACSF; NaCl: 125 mM, KCl: 2,5 mM, MgCl 2: 1 mM, CaCl 2: 2 mM, glucosa: 25 mM, NaH 2 PO 4: 1,25 mM, NaHCO 3: 25 mM, ácido ascórbico: 0,4 mM, myo-inositol: 3 mM, ácido pirúvico: 2 mM, burbujeado con 95% O 2 - 5% de CO 2) a temperatura ambiente (RT, 25 ° C) durante 1 - 4 horas, mientras queel colorante está siendo transportado. Burbuja la solución durante todo el período de incubación. </li><li> Posteriormente, transferir los brainstems en 4% de paraformaldehído (PFA) disuelto en PBS (aproximadamente 100 ml;. PH 7 para la mezcla de PFA / PBS) y se incuban a 4 ° C para permitir la posterior a la fijación durante la noche (O / N). </li></ol> 5. Tejido rebanar y montaje <ol><li> El día siguiente, lavar el tronco cerebral tres veces en PBS (5 min para cada etapa de lavado), se cubre en 4% de agar y luego se corta en 50 - 80 micras rodajas gruesas en un vibratome. Rebanadas de montaje utilizando un medio de montaje en un portaobjetos de vidrio, y cubreobjetos. </li><li> Opcionalmente, etiquetar las secciones con Nissl fluorescente para 25 min (por ejemplo azul Nissl en una dilución 1: 100 en AB medios de comunicación). <ol><li> Para preparar AB medios de comunicación, mezclar 250 ml de tampón fosfato 0,2 M (PB; 51 mM KH 2 PO 4, 150 mM Na 2 HPO 4), 15 ml M NaCl 5, 15 ml 10% de Triton-X, 220 ml ddH 2 O y 5 g de albúmina de suero bovino. </li><li> Precede y tener éxito la etapa de marcaje Nissl por 3 etapas de lavado en PBS (10 minutos cada uno). </li></ol></li></ol> Nota: En los casos en que las secciones más gruesas necesitan ser montados y analizados (en los experimentos descritos aquí esas rebanadas eran 100 - 500 micras de espesor para preservar conexiones axonales en distancias más grandes), la técnica se puede combinar con la compensación de los tejidos. Encontramos el ClearT2 12 tenga éxito 20. Cuando se incluye un paso de compensación de tejidos, realizarlo antes de montar las secciones.

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrically+induced+DNA+uptake+by+cells+is+a+fast+process+involving+DNA+electrophoresis.">Electrically induced DNA uptake by cells is a fast process involving DNA electrophoresis.</a> Biophys J. 60 (4), 804-811 (1991).</li><li>Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+Slice+Culture+of+E18+Rat+Brains.">Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains.</a> J. Vis. Exp. (6), e235 (2007).</li><li>G&#228;hwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue.">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 4 (4), 329-342 (1981).</li><li>Tallini, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC+transgenic+mice+express+enhanced+green+fluorescent+protein+in+central+and+peripheral+cholinergic+neurons.">BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons.</a> Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).</li></ol>

No tenemos nada que revelar.

Una fuerza general de la electroporación in vitro trazador, a diferencia de los estudios in vivo de rastreo, es que se da a los investigadores un mejor acceso a la zona del cerebro de interés y por lo tanto, no implica estereotáctica caro (y, a menudo electrofisiológico) equipo. Además, el período de supervivencia necesario para los explantes cerebrales se extiende sólo unas pocas horas (1 - 4) en lugar de días o incluso semanas en el caso de in vivo inyecciones de trazador (ver una re...

Con el fin de definir un cierto (micro) circuito neuronal, hay que empezar por encontrar los diversos participantes de dicho circuito, y su patrón de conexión. Desde la publicación de Waller sobre neurofiber rastreo a través lesioning 1 una gran variedad de técnicas de rastreo neuroanatómicas ha sido establecida. Algunas de estas técnicas se pueden aplicar en el tejido fijado post mortem 2-4, otros se basan en el transporte activo del colorante en neuronas vivas, como descubierto en 1971 6.5. Este último puede subdividirse en dos grupos que discriminan entre los métodos que se aprovechan de retrógrado activo (a partir de la zona de inyección a la fuente de una proyección dada, es decir. La somata de las neuronas que se proyectan hacia dicha zona) y anterógrada activo (desde el inyectada área a la diana de una proyección dada, es decir. las proyecciones axonales y los terminales axonales de las neuronas marcadas) de transporte. También, en algunos casos tramaterial de cer se inyecta en animales vivos que luego sobreviven a la inyección por varios días o semanas (en inyecciones de trazadores vivo), mientras que en otros casos se inyectan cerebros explantadas e incubar durante varias horas después de la inyección en el líquido cefalorraquídeo artificial (in vitro inyecciones de trazadores) . En este protocolo se modificó una existente en la técnica de electroporación in vitro 7.8 para etiquetar somata y procesos neuronal en anterógrada y retrógrada rastreo experimentos utilizando dextrano choleratoxin subunidad-b y tetrametilrodamina como las sustancias de rastreo. El objetivo general de este protocolo es proporcionar neurocientíficos con una herramienta eficiente para rastrear los patrones de conectividad neuronal entre los diferentes núcleos del cerebro, mientras que el aprovechamiento de líneas de ratones transgénicos disponibles y equipos ópticos básica con el fin de aumentar la precisión de la orientación durante las inyecciones de trazadores. Aunque el método de anterógrada y rastreo retrógrado utilizandocholeratoxin y la amina dextrano y sus respectivos conjugados marcados con fluorescencia no es NUEVO 9-13 (como es el método de electroporación, por ejemplo. Haas et al. 14), la combinación de las inyecciones de trazadores con la electroporación en una preparación in vitro que implica bloques de tejido cerebral es un desarrollo más reciente 7. Su principal ventaja sobre las técnicas de rastreo neuronales utilizando el mismo tipo de colorantes trazadores de animales vivos es la mayor intensidad de etiquetado, debido a la mayor eficiencia con la que el colorante a electroporación está siendo tomada por las neuronas. Una ventaja adicional es el período acortado de incubación (requerido para el transporte de colorante) y su mayor precisión de destino durante la inyección del marcador, porque el experimentador tiene el control visual sobre el área objetivo de la inyección. Este último también significa que no se requiere equipo caro estereotáctica para encontrar el área núcleo o el cerebro de interés. Para adinalmente aumentar precisión de la focalización, nos aprovechamos de una línea de ratón transgénico, que expresa GFP en su subpoblación glicinérgica de neuronas 15 y equipos ópticos básicos que consisten en un puntero láser de mano de 405 nm gafas de filtro de longitud de onda y la congruencia de banda de paso (450 - 700 nm). De este modo, logramos un mayor aumento significativo en la precisión de la focalización mediante la identificación de la zona de inyección a través de su señal fluorescente y proporcionando una manera más fina para controlar la propagación de colorante dentro del área de inyección a través de la observación de la interacción entre la señal de GFP indígena y el trazador fluorescencia. Nuestra técnica también permite descubrir la funcionalidad de un circuito junto con su conectividad mediante la identificación de las neuronas inhibitorias GFP-positivas (o excitatorio en otras líneas de ratón) que se llena con el trazador. En resumen, hemos mejorado aún más una poderosa herramienta neurocientífica para estudiar el conectoma del cerebro de los vertebrados y evaluar tque diferentes características neuroanatómicas de un neurocircuit dado. Mediante el uso de ratones transgénicos, junto con equipos ópticos de bajo costo y ampliamente disponible pudimos aumentar significativamente la precisión de la focalización de nuestras inyecciones. Además, los ratones transgénicos nos permitió identificar el tipo de las conexiones trazadas, lo que ayudó descubrir la funcionalidad de un microcircuito inhibitorio en el tronco cerebral auditivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride&#160;</td>
			<td></td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td></td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate di-basic</td>
			<td></td>
			<td>S907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td></td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td></td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td></td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td></td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td>I5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td></td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine</td>
			<td></td>
			<td>A2153</td>
			<td>optional, for additional (immuno)histochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td></td>
			<td>X100</td>
			<td>optional, for additional (immuno)histochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol), 8000 MW</td>
			<td></td>
			<td>P2139</td>
			<td>optional, for brain clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F84</td>
			<td>optional, for brain clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choleratoxin subunit-b</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C-34776 (Alexa 555)&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrane tetramethyl-rhodamine</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>D-7162 (Alexa 555)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Nissl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>N-21479 (blue)</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbi-tal</td>
			<td>Vortech Pharmaceuticals</td>
			<td>Fatal-Plus&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass filaments</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>G150F-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Zeitz Instruments, Germany</td>
			<td>DMZ Universal Puller</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion setup</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser pointer&#160;</td>
			<td>laserpointerpro.com, Hong Kong</td>
			<td>HK-88007294 (405 nm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter/safety goggles</td>
			<td>Dragon Lasers, China</td>
			<td>LSG09 (band-pass 450-700 nm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bionocular microscope&#160;</td>
			<td>Wild Heerbrugg, Switzerland</td>
			<td>Wild M3</td>
			<td>Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer</td>
			<td>Parker Instruments</td>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC with installed MC Stimulus software</td>
			<td>Multi Channel Sys-tems, Germany (software)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-channel stimulator</td>
			<td>Multi Channel Sys-tems, Germany</td>
			<td>STG-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulation isolation unit</td>
			<td>A.M.P.I., Israel</td>
			<td>Iso-Flex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige, Japan</td>
			<td>YOU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica, Germany</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-guided neuronal tracing in brain explants

Se presenta una técnica que combina un protocolo de inyección vitro trazador en, que utiliza una serie de pulsos eléctricos y de presión para aumentar la absorción de colorante a través de la electroporación en explantes cerebrales con iluminación láser específica y que emparejan gafas de filtro durante el procedimiento. La técnica descrita de electroporación in vitro por sí mismo rendimientos relativamente buen control visual para que apuntan a ciertas áreas del cerebro. Al combinar con excitación láser de marcadores genéticos fluorescentes y su lectura a través de gafas de filtro de banda de paso, que puede recoger las emisiones de las marcadas genéticamente células / núcleos y el tinte de rastreo fluorescente, un investigador puede aumentar considerablemente la precisión de las inyecciones encontrando el área de interés y el control para el tinte de difusión / absorción en la zona de inyección de forma mucho más eficiente. Además, la técnica de iluminación láser permite estudiar la funcionalidad de un neurocircuit propuesta por provIding información sobre el tipo de neuronas que se proyectan a una cierta área en casos en que la expresión de GFP está relacionada con el tipo de transmisor expresada por una subpoblación de neuronas.

Las figuras 1 y 2 muestran como el puntero láser y gafas láser se puede utilizar para determinar el genotipo de forma rápida y económica animales positivos GFP de una camada. En los casos de los cachorros de ratón, la técnica se puede utilizar para identificar de forma no invasiva etiqueta GFP en los cerebros de los animales a través del cráneo y la piel suprayacente (Figura 1A - D). Fluorescencia emitida se puede ver a través de la piel y el cráneo de crías ...

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Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

Describimos una técnica para etiquetar las neuronas y sus procesos a través de anterógrada o retrógrada trazadores inyecciones en núcleos cerebrales utilizando una preparación in vitro. Hemos modificado un método existente de i n vitro electroporación trazador mediante el aprovechamiento de la etiqueta fluorescente mutantes de ratón y equipo óptico básica con el fin de aumentar la precisión de etiquetado.

Neuronal Tracing en explantes cerebrales guiadas por láser

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

laser-guided-neuronal-tracing-in-brain-explants

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K vistas.  University of Colorado School of Medicine.  Describimos una técnica para etiquetar las neuronas y sus procesos a través de anterógrada o retrógrada trazadores inyecciones en núcleos cerebrales utilizando una preparación in vitro. Hemos modificado un método existente de i n vitro electroporación trazador mediante el aprovechamiento de la etiqueta fluorescente mutantes de ratón y equipo óptico básica con el fin de aumentar la precisión de etiquetado. 

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DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

Etiquetado DiOLISTIC de las neuronas de los roedores y no humanos rodajas de cerebro de los primates

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Investigación

Neurociencias

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Electrodos múltiples grabaciones matriz de avalanchas neuronal en cultivos organotípicos

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Fast Micro-iontoforesis de glutamato y GABA: una herramienta útil para investigar la integración sináptica

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

La manipulación genética de las neuronas cerebelosa gránulo<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em&gt; Estudiar Neuronal Morfología y Migración

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

La inducción de la plasticidad de astrocítico Receptores por manipulación de Neuronales cocción Precios

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

Inyección Viral Intracerebroventricular de Neonatología del ratón Cerebro de transducción neuronal persistente y generalizada

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Closed-loop Neuro-robotic Experiments to Test Computational Properties of Neuronal Networks

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation of a given stimulus might be dependent on context and history. If this is actually the case, bi-directional interactions between the brain (or if need be a reduced model of it) and sensory-motor system can shed a light on how encoding and decoding of information is performed. Here an experimental system is introduced and described in which the activity of a neuronal element (i.e., a network of neurons extracted from embryonic mammalian hippocampi) is given context and used to control the movement of an artificial agent, while environmental information is fed back to the culture as a sequence of electrical stimuli. This architecture allows a quick selection of diverse encoding, decoding, and learning algorithms to test different hypotheses on the computational properties of neuronal networks.

In this paper, an experimental framework to perform closed-loop experiments is presented, in which information processing (i.e., coding and decoding) and learning of neuronal assemblies are studied during the continuous interaction with a robotic body.

Experimentos Neuro-robótica de circuito cerrado para comprobar propiedades computacionales de Redes Neuronales

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits during embryonic maturation of the brain however is technically challenging because most transsynaptic tracing methods developed to date depend on stereotaxic tracer injection. To overcome this problem, we developed a binary genetic strategy for conditional genetic transsynaptic tracing in the mouse brain. Towards this end we generated two complementary knock-in mouse strains to selectively express the bidirectional transsynaptic tracer barley lectin (BL) and the retrograde transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment C from the ROSA26 locus after Cre-mediated recombination. Cell-specific tracer production in these mice is genetically encoded and does not depend on mechanical tracer injection. Therefore our experimental approach is suitable to study neural circuit formation in the embryonic murine brain. Furthermore, because tracer transfer across synapses depends on synaptic activity, these mouse strains can be used to analyze the communication between genetically defined neuronal populations during brain development at a single cell resolution. Here we provide a detailed protocol for transsynaptic tracing in mouse embryos using the novel recombinant ROSA26 alleles. We have utilized this experimental technique in order to delineate the neural circuitry underlying maturation of the reproductive axis in the developing female mouse brain.

Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution.

Condicional transsynaptic genética Seguimiento en el cerebro de embriones de ratón

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Proyección de imagen de calcio de dos fotones en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively thin to properly visualize and access neurons for patch-clamping or imaging, and in vitro examination of brain circuitry is limited to only what is physically present in the acute slice. To maintain the benefits of in vitro slice experimentation while preserving a larger portion of presynaptic nuclei, we developed a novel slice preparation. This &#8220;wedge slice&#8221; was designed for patch-clamp electrophysiology recordings to characterize the diverse monaural, sound-driven inputs to medial olivocochlear (MOC) neurons in the brainstem. These neurons receive their primary afferent excitatory and inhibitory inputs from neurons activated by stimuli in the contralateral ear and corresponding cochlear nucleus (CN). An asymmetrical brain slice was designed which is thickest in the rostro-caudal domain at the lateral edge of one hemisphere and then thins towards the lateral edge of the opposite hemisphere. This slice contains, on the thick side, the auditory nerve root conveying information about auditory stimuli to the brain, the intrinsic CN circuitry, and both the disynaptic excitatory and trisynaptic inhibitory afferent pathways that converge on contralateral MOC neurons. Recording is performed from MOC neurons on the thin side of the slice, where they are visualized using DIC optics for typical patch-clamp experiments. Direct stimulation of the auditory nerve is performed as it enters the auditory brainstem, allowing for intrinsic CN circuit activity and synaptic plasticity to occur at synapses upstream of MOC neurons. With this technique, one can mimic in vivo circuit activation as closely as possible within the slice. This wedge slice preparation is applicable to other brain circuits where circuit analyses would benefit from preservation of upstream connectivity and long-range inputs, in combination with the technical advantages of in vitro slice physiology.

Integration of diverse synaptic inputs to neurons is best measured in a preparation that preserves all pre-synaptic nuclei for natural timing and circuit plasticity, but brain slices typically sever many connections. We developed a modified brain slice to mimic in vivo circuit activity while maintaining in vitro experimentation capability.

In Vitro Wedge Slice Preparación para imitar la conectividad del circuito neuronal In Vivo

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...