Nos gustaría dar las gracias al Dr. Paul Weigel en la Universidad. de Oklahoma para el uso de anticuerpos monoclonales para la detección de 30 de los receptores de HARE/Stabilin-2 Weigel y Janet por su asistencia técnica. Esta investigación está financiada por la Universidad de los Fondos de Investigación de Nebraska.

1. Extirpación del hígado (adoptado de PO Seglen 12 y R. Blomhoff 13 con modificaciones 14,15) <ol><li> Añadir 10 ml de 30% de isoflurano en polietilenglicol a una placa de Petri en una cámara de 5,5 L cerrada. Lo mejor es esperar 10-15 minutos después de la adición de isoflurano para crear un ambiente estabilizado dentro de la cámara. </li><li> Lugar a una rata en la cámara sellada y permitir que se convierta anestesiados. Pleno efecto de la anestesia son evidentes cuando el animal se queda sin fuerzas, que no responde, y presenta una respiración profunda. </li><li> Coloque 2 mL de isoflurano en polietilenglicol en unas bolas de algodón en la parte inferior de un tubo de la jeringa de 30 ml. </li><li> Coloque el ratón sobre su espalda en una bandeja cubierta de pañal y se coloca el tubo de la jeringa sobre el hocico. </li><li> Inmediatamente confirmar anestesia profunda mojando el abdomen con un 70% de etanol. No deje que el animal muere por sobredosis de isoflurano. </li><li> El uso de tijeras y pinzas venda, exponga toda la abdcavidad NOMINAL. </li><li> Localizar la vena porta y, con las pinzas, sacar dos hilos de seda o hilo de poliéster quirúrgica (ligadura) por debajo de la vena porta inmediatamente encima de la rama mesentérica. </li><li> Retirar las pinzas y corbata un nudo suelto. </li><li> El uso de pinzas por debajo de la vena porta y tirando suavemente de vuelta a enderezar la vena, canular la vena con un catéter AutoGuard Insyte (18 GA, 1.3 x 300 mm, BD Biosciences), catéter o similar. El catéter debe ir más allá de varios mm el bucle formado por el hilo. </li><li> Retractarse y retirar la aguja se suelta el gatillo con resorte en el catéter. Sangre deberá empezar a filtrarse a través del catéter que indica la colocación correcta de ligadura. </li><li> Apretar el nudo simple y segura con otro nudo. </li><li> Sever o la vena cava inferior o la aorta descendente (aorta abdominalis) para permitir que la sangre fluya en el sistema circulatorio. </li><li> Comience a enjuagar el hígado con oxigenadaTBS a 37 ° C para eliminar la sangre (blanqueo), con un caudal de 20 mL / min. El hígado se convierta de un color púrpura rojizo a un color arcilla. </li><li> Mientras que el hígado está descargando, extirpar el hígado a través de cortar el tubo digestivo y el tejido conectivo. Es importante no lacerar el hígado o el pinchazo de la cápsula de Glisson. </li><li> Lugar en el hígado en una red de plástico sobre un embudo que permite a los topes que se recojan y recircula. Buffers en este punto no debe ser recirculado, pero el flujo en el vaso de residuos. Lavado no debe durar más de 10 min. (Fig. 2A). Prepare la solución requiere endocitosis en 2,1 paso. </li></ol> 2. La internalización de 125 I-SA-b-Hep (u otro ligando adecuado etiquetado) <ol><li> A 50 ml medio RPMI en un vaso pequeño, se suman a una concentración final de BSA al 0,05% y 0,01 mCi 125 I-SA-b-Hep o ligando otros debidamente etiquetados para la endocitosis. </li><li> Adjunte este vaso a la Apparatus para permitir la oxigenación. </li><li> Apague la bomba, cambiar la tubería de entrada, y luego pasar a la bomba a 20 ml / min. </li><li> Como el RPMI etiquetado se aproxima a la del hígado, apague la bomba y permita que el exceso de líquido en el embudo y drenar la tubería. </li><li> Coloque el tubo de drenaje en el vaso de los medios de comunicación que permita la recirculación de los medios de comunicación la etiqueta y luego reiniciar la bomba. </li><li> Permitir que los líquidos para recircular a través del hígado por no más de 1 hora. </li><li> Durante esta etapa, la internalización, asegúrese que la temperatura en el hígado es estable por lo cubre y preparar la colagenasa para la digestión. </li></ol> 3. La digestión del hígado por la digestión con colagenasa <ol><li> Recién disuelto y se filtra (0,45 m) colagenasa (100 mg / kg de peso del animal) debe ser añadido al buffer 2 en un volumen total que no exceda de 60 ml a 37 ° C. El volumen depende de la longitud / volumen interno de la tubería y debe ajustarse en consecuencia. </li><li> Parar la bomba y el intercambioTubo de entrada del vaso medios de comunicación a la TBS. </li><li> Lavar el hígado durante 2 min a 50 ml / min que permite el aflojamiento de la unión entre las células que se desmosómicas dependiente de calcio. </li><li> Mientras que el hígado es el lavado, cambio de la copa de los medios de comunicación con el frasco que contiene colagenasa en el aparato. </li><li> Inmediatamente después del lavado, comienza la digestión con colagenasa en un bucle de circulación a una velocidad de flujo de 20 mL / min durante 15 min. Desde lotes colagenasa varían según el número de lote, las variaciones en la cantidad y el tiempo de la digestión deben ser optimizados para cada nuevo lote de colagenasa. La colagenasa es también dependiente de calcio. Apague la bomba y el interruptor de la memoria intermedia y las líneas de gas de A a B. Frasco Frasco de transferencia de la línea de efluentes del contenedor de desechos de frasco B (Fig. 2B). </li><li> Parar la bomba, retirar el catéter y la transferencia del hígado a un plato que contiene 20 a 30 ml de tampón 1. </li><li> Pele la cápsula de Glisson del hígado y del movimiento de la células en el líquido. </li><li> A medida que el líquido se vuelve opaco con material celular, transferir las células a través de una malla de 100 micras seguido de una filtración a través de una malla de 30 micras y luego en un Erlenmeyer de 50 ml en hielo. </li><li> Añadir más Tampón 1 en el hígado y continuar agitando las células de la matriz del hígado, la transferencia de los líquidos a los filtros de malla y cónicos. </li><li> Repita los pasos 3,7 hasta 3,9 hasta que no haya más células pueden desprenderse con agitación razonable del hígado. </li></ol> 4. Hepatocitos y purificación de la SEC <ol><li> Centrífuga de 50 ml que contiene conicals células a 150 g durante 3 min. para que sedimenten los hepatocitos. </li><li> Transferencia de la fracción de líquido que contiene células no parenquimatosas a un nuevo 50 conicals ml en hielo. </li><li> Lavar los hepatocitos se resuspender el pellet en tampón 3 y repitiendo los pasos 4.1 y 4.2 veces más de tres. </li><li> Al final de los lavados, los pellets son ≥ 97% pura hepatocitos. Para obtener la SECS, centrífuga de todos los tubos de containing agrupados sobrenadante (que contiene HSCs, SECS, y KCS y algunos hepatocitos pequeños) a 200 g durante 10 min. a 4 ° C. </li><li> Aspirar el buffer y resuspender todas las bolas en 5 ml de RPMI / BSA a 4 ° C. </li><li> Piscina de las células, junto a dos tubos y añadir RPMI / BSA, hasta un volumen de 35 ml. </li><li> Se centrifuga la conicals a 100 g durante 3 min. </li><li> Recoge los 25 ml de líquido y la transferencia a un lugar limpio cónico de 50 ml. </li><li> Resuspender el precipitado en los medios de comunicación ml restantes 10 y volver a agregar 25 ml de RPMI frío / BSA y centrifugar a 100 g durante 3 min. </li><li> Repita los pasos 3.8 y 3.9, una vez más, desechar el sedimento celular y los medios de comunicación inferior a 10 ml. </li><li> Se centrifuga la supernatents de pellet SECS, KC, y HSCs a 200 g durante 10 min. a 4 ° C. </li><li> Prepare tres tubos de 50 ml que contiene 20 ml de Percoll al 25% en PBS en hielo. Subcapa con 15 ml de Percoll al 50% en cada tubo. </li><li> Resuspender los pellets de células en un volumen total de 30 ml de RPMI / BSA. </li><li> Cuidadosamente superposición each gradiente con 10 ml de células y se centrifuga a 900 g durante 20 min a 4 ° C. </li><li> SECS y KCS tiene muy cerca de la densidad de flotación y se encuentran en la interfaz de un 25/50%. HSCs son típicamente menos del 25% / interfaz de medios debido a su flotabilidad mayor medida que las células lípidos de almacenamiento. Cualquier resto de los hepatocitos y las células sanguíneas tienen la buoyancies inferior y se precipitan. Aspirar de arriba hacia abajo cerca de la interfaz de un 25/50% y desechar este material. </li><li> Recoger las células de la interfaz de un 25/50% y la transferencia a un nuevo cono de frío RPMI. El volumen final debe ser ~ 40 ml para diluir el Percoll. </li><li> Se centrifuga la cónica a 350 g durante 10 min a 4 ° C para que sedimenten las células. </li><li> Resuspender las células en el ~ 10 ml previamente calentada RPMI que contiene 100 U / mL Penicillin/100 g / ml estreptomicina células y colocar en un lavado con ácido de cristal placa de Petri o Cristalizador. </li><li> Se incuban las células durante 15 minutos. a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos. </li><li> Roca o agitar la placa un pocoy luego recoger los segundos en el sobrenadante. El KC se adhieren al cristal mucho más rápidamente que la SECS. Por otra parte, SECS puede ser separado de KC por inmunopurificación el uso de anticuerpos anti-CD31 o anti-Stabilin2/HARE conjugada con partículas magnéticas. </li><li> Números de la viabilidad celular y puede ser evaluada por exclusión del azul tripano usando un hemocitómetro o con el uso de un contador celular automático. </li><li> La cultura de la SECS en fibronectina recubiertos platos de plástico a 37 ° C, 5% de CO 2, RPMI/0.25% BSA con 40 ng / mL de VEGF, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina o con medio condicionado de hepatocitos. </li><li> Hepatocitos, KC, y SECS puede evaluar para la internalización de material marcado por el uso de un contador gamma y la normalización de la proteína celular total o por microscopía (si la etiqueta fluorescente) utilizando estos métodos de cultivo. </li></ol> 5. Los resultados representativos: Purificación de hepatocitos es ≥ 97% y purificación SEC es Typicaliado de ≥ 95% con este método. La escisión de la cavidad abdominal, la canalización de la vena porta y palidez del hígado todos debe ocurrir dentro de un minuto para obtener mejores resultados. HARE/Stabilin-2 es un receptor específico en la SECS hígado y no se expresa en otros tipos de células del hígado. En esta muestra, lisados ​​celulares de ambos hepatocitos y SECS fueron separados en un 5% SDS-PAGE y probaron con un anticuerpo monoclonal contra las dos isoformas de Stabilin-2 (Fig. 3). La heparina no fraccionada se inyecta en el torrente sanguíneo se elimina por el hígado 16. El aclaramiento se realiza principalmente por la SECS hígado a diferencia de los hepatocitos y KC 17. El receptor Stabilin-2/HARE es el receptor principal de depuración que se une a la heparina e internaliza en las secciones 18. En nuestro ejemplo, hemos denominado heparina con una etiqueta de biotina en el grupo carboxilato de GlcNAc / NS. La biotina se conjugó con estreptavidina yodado para la detección de prot heparina internalizadoeoglycan. La inyección de la heparina etiqueta seguido por exanguinación 30 minutos después de la inyección nos permite controlar que los órganos interiorizar esta forma de heparina. En este corto intervalo de tiempo, el hígado es el órgano tolerancia primaria (Fig. 4). Para entender más claramente qué tipo de célula es responsable del despacho, hemos añadido 125 I-SA-b-Hep a los medios de comunicación RPMI suplementado con BSA al 0,05% y se deja que circule a través del hígado durante 20 minutos. Después de la digestión de colagenasa y la purificación celular, la gran mayoría de heparina marcada es internalizado por segundos en contraste con los hepatocitos (Fig. 5). <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Arquitectura básica del hígado. SECS forman las paredes de los sinusoides y normalmente son fenestrados (pequeños grupos de círculos). Las células estrelladas (HSC) se encuentran en el espacio de Disse, en contraste con Kupffer canas (KCS), que normalmente están presentes en la microvasculatura de los sinusoides. Hepatocitos ocupan el otro lado del espacio de Disse. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Esquema del aparato de perfusión. A) Puesta en marcha del aparato durante el lavado / lavado de los sinusoides del hígado. TBS es en un frasco de 1 litro. B) Un frasco de 125 ml que contenga aproximadamente 60 ml de tampón 2 con colagenasa se utiliza para la digestión del hígado en un circuito cerrado. La línea de aguas residuales también se puede cambiar el contenedor de residuos para el frasco B a través de una muesca en el tapón de goma. La línea de oxígeno no se sumerge en el tampón que contiene colagenasa (frasco B) para evitar la formación de espuma. Los tapones en cada frasco se hacen muescas para permitir una transferencia eficiente de la línea de efluentes y para evitar aumento de la presión del gas de oxígeno. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. </spreparaciones trong&gt; hepatocitos no están contaminados con SECS. Igual cantidad de lisados ​​celulares de los lotes purificados de los hepatocitos (carril 1) y segundos (carril 2), fueron separados en un 5% SDS-PAGE y se transfirieron a nitrocelulosa. Anticuerpo monoclonal # 30, que es específica contra las dos isoformas (315 kDa y 190) de HARE/Stabilin-2 fue utilizado para investigar los lisados. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Distribución de la heparina en los órganos de la etiqueta. Las ratas fueron inyectadas a través de la vena lateral de la cola con 125 I-SA-b-hep esperar 30 minutos y se desangraron entonces. La sangre fue recolectada a fin de no dar a alguno de los órganos artificialmente altas lecturas. Cuentas por minuto (CPM) de cada órgano se normalizaron en contra el peso de los órganos en gramos. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig5.jpg" alt="Figura 5"/> Figura 5. Cantidad de heparina etiquetados en los hepatocitos y SECS. RPMYo los medios de comunicación que contiene 125 I-SA-b-Hep se permite la circulación a través de un hígado intacto durante 20 minutos seguido por la digestión de colagenasa y la purificación celular. Igual cantidad de lisados ​​de los hepatocitos y SEC proteína celular se cuantificó con el ensayo de Bradford y contados por un contador gamma. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig6.jpg" alt="Figura 6"/> Figura 6. Las células de Kupffer son separados de SECS por adhesión sobre el vidrio. Las células se colocan en un recipiente de vidrio lavado con ácido y la cristalización permite que se adhieran durante 15 min a 37 ° C, 5% de CO 2. El sobrenadante que contiene las células no adheridas fue agitado vigorosamente y se coloca en un tubo de centrífuga. Lisados ​​de células adheridas, tanto en el vidrio (carril 1) y de células no adheridas (carril 2), fueron separados en un 8% SDS-PAGE, se transfirieron, y probaron con un anticuerpo contra el CD163 que es específica para las células de Kupffer. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig7.jpg" alt="Figura 7"/> SECS la figura 7. Chapada en fibronectina recubiertos de plástico de 6 pocillos se incubaron durante la noche en medio RPMI suplementado con 0,1% de BSA. Imágenes de contraste de fase se tomaron en (A) 100x y (B) aumento de 200x.

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Commun. 218, 314-319 (1996).</li><li>Duryee, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+is+a+cofactor+for+malondialdehyde-acetaldehyde+adduct-mediated+cytokine/chemokine+release+by+rat+sinusoidal+liver+endothelial+and+Kupffer+cells.">Lipopolysaccharide is a cofactor for malondialdehyde-acetaldehyde adduct-mediated cytokine/chemokine release by rat sinusoidal liver endothelial and Kupffer cells.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 28, 1931-1938 (2004).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

La anestesia de la rata, por el método de la gota colgante en el que el isoflurano produce vapor de inconsciencia es el método preferido para nuestros estudios. Un vaporizador también puede utilizarse en lugar de una jeringa con un algodón para mantener los animales fuera de la cámara, pero los procedimientos quirúrgicos son tan rápidos, que no es necesario. Glicol de polietileno se añade a la isoflurano para disminuir la presión de vapor y velocidad de evaporación. El exceso de vapor de isoflurano se induce la muerte muy rápidamente. Si el animal muere antes que el hígado es canulado y se blanquean con TBS, la acumulación de sangre puede coagularse en el hígado y prevenir el lavado eficiente de los sinusoides y la digestión con colagenasa. La adición de heparina puede ser útil como un anticoagulante, pero no es utilizada en estos estudios ya que el uso de heparina etiquetados como nuestra sonda. Solución salina tamponada de Gey (GBSS) es a menudo sustituida por otros laboratorios para la purificación de la SECS. Si bien es útil para la purificación de la SEC, la hepatitisatocytes no toleran GBSS, así como amortiguadores de 1-3 y viabilidades que no son tan altos. Cuando se mide la endocitosis, es una buena práctica para medir los niveles de fondo en el órgano y en los hepatocitos purificada. Este método es uno de los dos para la purificación eficiente de la SECS después de la perfusión del hígado con colagenasa. El otro método que separa las células no parenquimatosas por centrifugación elutriación 19 en lugar de gradiente de Percoll. Las ventajas para el uso de decantación en gradientes de Percoll son ligeramente mayores viabilidades celulares y números. La desventaja es que requiere de una decantación centrifugación rotor especializados, dedicados centrífuga y bomba peristáltica juntos que cuesta decenas de miles de dólares. Este método sólo requiere el uso de una centrífuga de mesa refrigerada y una bomba peristáltica que es estándar en muchos laboratorios. La separación de SECS y KCS de adhesión selectiva es un método estándar20-22. Si bien es cierto que la SECS se adhiere al vidrio y el plástico, el punto clave es el uso de lavado con ácido de vidrio limpio con no más de una incubación de 15 minutos a 37 ° C en 5% CO 2. KC siempre se adherirá más rápido que SECS y es recomendable lavar el KC con los medios para extraer cualquier resto de SECS que se han convertido en poco adheridas. Pronasa y otras proteasas también se omiten los pasos de la digestión de colagenasa en este protocolo para incrementar las viabilidades de las células. Proteasas digieren receptores extracelulares y puede inhibir la adhesión celular en las etapas de purificación final. El método que aquí se presenta tiene una amplia variedad de aplicaciones. A pesar de que muestran el resultado final en el que la heparina es un principio asumido para el despacho, la perfusión del hígado para la obtención de hepatocitos primarios, KC, SECS, y HSC puede ser útil para una serie de estudios que involucra diferentes vías metabólicas, inmunorregulación, las actividades del tesoro, y otros fisiológicos studies. La parte más difícil de este procedimiento es la canalización buena digestión del hígado, y la manipulación del hígado sin tener el recibo de catéter de la vena porta.

<ul><li> Tampón 1: 142 mM NaCl 6,7 mM KCl, 10 mM HEPES, el 1,5% de BSA, pH 7,4 </li><li> Tampón 2 (tampón de perfusión): 67,0 mM NaCl, 6,7 mM KCl, 4,8 mM de CaCl2-H2O, 101,0 mM HEPES, BSA 1,5%, pH 7,4. </li><li> Tampón 3: 137 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,7 mM MgSO 4, 1,2 mM CaCl 2 2H 2 O, HEPES 10 mM, 1,5% de BSA, pH 7,4 </li><li> RPMI / BSA: 15 g / l de BSA en RPMI </li><li> Tampón con Tris (TBS): 154 mM NaCl, 10 mM de sal Base Trizma. </li><li> Colagenasa: colagenasa A (# 11088785103) de Roche, colagenasa tipo I (# LS004691) de Bioquímica Worthington o yo colagenasa (# C0130) o IA (# C9891) de Sigma-Aldrich. </li></ul> Todas las sales son de Sigma-Aldrich <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td><td> Modelo / Catálogo # </td><td> Comentario </td></tr><tr><td> Baño de agua de 20 litros </td><td> ThermoFisher </td><td> 2231 </td><td> El agua es de aproximadamente 45 ° C para compensar la refrigeración </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> dentro del tubo. </td></tr><tr><td> Bomba peristáltica </td><td> Cole-Parmer </td><td> 7553-70 </td><td> Masterflex serie </td></tr><tr><td> Centrífuga refrigerada </td><td> Sorvall </td><td> Leyenda XTR </td><td></td></tr><tr><td> Catéter </td><td> BD Biosciences </td><td> 381444 </td><td></td></tr><tr><td> Desecador cámara </td><td> Pescador </td><td> 08595E </td><td> Use la placa interna </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> Sigma </td><td> P4937 </td><td></td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino </td><td> SeraCare </td><td> AP-4510 a 01 </td><td></td></tr><tr><td> 100 micras de malla </td><td> Espectro de los laboratorios </td><td> 146488 </td><td></td></tr><tr><td> 30 micras de malla </td><td> Espectro de los laboratorios </td><td> 146506 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 21870 </td><td></td></tr><tr><td> Polietilenglicol </td><td> Espectro de laboratorios </td><td> PO107 </td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion

El hígado es el centro metabólico del cuerpo de los mamíferos y sirve como un filtro para la sangre. La arquitectura básica del hígado se ilustra en la figura 1 en la que se compone más del 85% de la masa hepática de los hepatocitos y el restante 15% de la masa celular se compone de células de Kupffer (KC), las células estrelladas (HSC), y las células endoteliales sinusoidales (segundos). SECS forman las paredes de los vasos sanguíneos en el hígado y contener la morfología especializadas llamadas fenestras en el citoplasma. Fenestración del citoplasma es la aparición de agujeros (~ 100 m) dentro de las células para que el acto SECS como un tamiz en el que la mayoría de los quilomicrones, remanentes de quilomicrones y macromoléculas, pero no células, pasan a través de los hepatocitos y HSC 1 (Fig. 1). Debido a la falta de una membrana basal, la brecha entre la SECS y hepatocitos forman el espacio de Disse. HSCs ocupar este espacio y desempeñar un papel destacado en la regulación y la respuesta a la injury, almacenamiento de ácido retinoico y la inmunorregulación de las 2 de hígado. SECS se encuentran entre las células más activas endocytically del cuerpo mostrando una gran variedad de receptores scavenger en sus tres la superficie celular. Estos incluyen SR-A, 1-Stabilin y Stabilin-2. En general, las pequeñas partículas coloidales menos de 230 nm y macromoléculas en la fase de amortiguación son tomados por SECS, mientras que las partículas grandes y los restos celulares proceso de endocitosis (fagocitosis) por KC 4. Por lo tanto, la eliminación masiva de materiales extracelulares, tales como los glicosaminoglicanos de la sangre depende en gran medida la salud y las funciones endocítica de las § 5,6. Por ejemplo, un aumento en los niveles en sangre de ácido hialurónico es un indicativo de la enfermedad hepática de leve a formas más graves 7. Con la excepción de un informe 8, no hay inmortalizado líneas celulares SEC en existencia. Incluso esta línea celular inmortalizada es de-diferenciaciónated en que no expresan receptores scavenger que están presentes en SECS primaria (nuestros datos, no se muestra). Todos los estudios de biología celular se debe realizar en las células primarias recién obtenido del animal. Desafortunadamente, la SECS desdiferencian en condiciones estándar de cultivo y debe usarse dentro de 1 o 2 días después de aislamiento de los animales. La diferenciación de SECS está marcada por la expresión de Stabilin-2 o receptor HACE 9, CD31, y la presencia de fenestración citoplasma 1. La diferenciación de SECS se puede ampliar mediante la adición de VEGF en medios de cultivo o por el cultivo de células en un medio condicionado de hepatocitos 10,11. En este informe, vamos a demostrar la actividad endocítica de segundos en el órgano intacto con radio-marcado con heparina de ácido hialurónico para la SEC específicos Stabilin-2 receptor. A continuación, se purifican los hepatocitos y segundos desde el hígado perfundido para medir la endocitosis.

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In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

El estudio del hígado de las células endoteliales sinusoidales (segundos) se debe realizar con las células primarias procedentes de los animales que no existen líneas celulares. Este método se basa en la digestión del hígado y centrifugación diferencial para la purificación de la SEC para el cultivo posterior y experimentar.

La endocitosis en vivo de hígado seguido por la purificación de las células hepáticas de la perfusión del hígado

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood.  The basic architecture of the liver is illustrated in ...

in-vivo-liver-endocytosis-followed-purification-liver-cells-liver

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

18.9K vistas.  University of Nebraska, Lincoln. El estudio del hígado de las células endoteliales sinusoidales (segundos) se debe realizar con las células primarias procedentes de los animales que no existen líneas celulares. Este método se basa en la digestión del hígado y centrifugación diferencial para la purificación de la SEC para el cultivo posterior y experimentar.

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Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In addition, liver stem cells are hypothesized to be the precursors for a subset of liver cancer, Hepatocellular carcinoma. One of the primary challenges to stem cell work in any solid organ like the liver is the isolation of a rare population of cells for detailed analysis. For example, the vast majority of cells in the liver are hepatocytes (parenchymal fraction), which are significantly larger than non-parenchymal cells. By enriching the specific cellular compartments of the liver (i.e. parenchymal and non-parenchymal fractions), and selecting for CD45 negative cells, we are able to enrich the starting population of stem cells by over 600-fold.The proceduresdetailed in this report allow for a relatively rare population of cells from a solid organ to be sorted efficiently. This process can be utilized to isolateliver stem cells from normal murine liver as well as chronic liver injury models, which demonstrate increased liver stem cell proliferation. This method has clear advantages over standard immunohistochemistry of frozen or formalin fixed liver as functional studies using live cells can be performed after initial co-localization experiments. To accomplish the procedure outlined in this report, a working relationship with a research based flow-cytometry core is strongly encouraged as the details of FACS isolation are highly dependent on specialized instrumentation and a strong working knowledge of basic flow-cytometry procedures. The specific goal of this process is to isolate a population of liver stem cells that can be clonally expanded in vitro.

Here we describe the isolation of CD133 expressing liver stem cells and cancer stem cells from whole murine liver, a process that requires tissue digestion, cell enrichment, and flow cytometry isolation. We include methods for advanced single cell isolation and clonal expansion.

El aislamiento de células madre CD133 + hígado para la expansión clonal

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In ...

Investigación

Biología

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Liver fibrosis is defined by the excessive deposition of extracellular matrix by activated myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic myofibroblasts, including hepatic stellate cells, portal fibroblasts and bone marrow derived fibroblasts 1. Hepatic stellate cells have been the best studied, but portal fibroblasts are increasingly recognized as important contributors to the myofibroblast pool, particularly in biliary fibrosis 2. Portal fibroblasts undergo proliferation in response to biliary epithelial injury, potentially playing a key role in the early stages of biliary scarring 3-5. A method of isolating portal fibroblasts would allow in vitro study of this cell population and lead to greater understanding of the role portal fibroblasts play in biliary fibrosis.
Portal fibroblasts have been isolated using various techniques including outgrowth 6, 7 and liver perfusion with enzymatic digestion followed by size selection 8. The advantage of the digestion and size selection technique compared to the outgrowth technique is that cells can be studied without the necessity of passage in culture. Here, we describe a modified version of the original technique described by Kruglov and Dranoff 8 for isolation of portal fibroblasts from rat liver that results in a relatively pure population of primary cells.

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

A technique for isolating portal fibroblasts from rat liver is described. Livers are perfused and digested in situ with collagenase, followed by ex vivo digestion of the liver slurry and size selection of cells. This method provides a pure population of portal fibroblasts without the need for passage in culture.

El aislamiento de fibroblastos portales rata por<em&gt; In situ</em&gt; Hígado de perfusión

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

Do-It-Yourself de dispositivos para la recuperación de las muestras criopreservadas de caída accidental en los tanques de almacenamiento criogénicos

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. As such, hepatocytes are an important model for a large variety of research questions. In particular, the use of human hepatocytes is especially important in the fields of pharmacokinetics, toxicology, liver regeneration and translational research. Thus, this method presents a modified version of a two-step collagenase perfusion procedure to isolate hepatocytes as described by Seglen 1.
Previously, hepatocytes have been isolated by mechanical methods. However, enzymatic methods have been shown to be superior as hepatocytes retain their structural integrity and function after isolation. This method presented here adapts the method designed previously for rat livers to human liver pieces and results in a large yield of hepatocytes with a viability of 77&plusmn;10%. The main difference in this procedure is the process of cannulization of the blood vessels. Further, the method described here can also be applied to livers from other species with comparable liver or blood vessel sizes.

A modified two-step collagenase perfusion procedure for isolation of human hepatocytes is described. This method can also be applied to other mammalian livers. The isolated hepatocytes are available in high yield and viability, making them a suitable model for scientific research in areas such as liver regeneration, pharmacokinetics and toxicology.

El aislamiento de hepatocitos humanos por una colagenasa perfusión Procedimiento de dos pasos

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures - both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.

The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.

Un método estandarizado para el análisis de las células del hígado sinusoidal endoteliales y sus Fenestraciones por Microscopía Electrónica de Barrido

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A deeper understanding of the changes in gene expression that occur during repopulation could help identify therapeutic targets to promote the restoration of liver function in the setting of injuries. Nonetheless, methods to isolate specifically the repopulating hepatocytes are inhibited by a lack of cell markers, limited cell numbers, and the fragility of these cells. The development of translating ribosome affinity purification (TRAP) technology in conjunction with the Fah-/- mouse model to recapitulate repopulation in the setting of liver injury allows gene expression profiling of the repopulating hepatocytes. With TRAP, cell type-specific translating mRNA is rapidly and efficiently isolated. We developed a method that utilizes TRAP with affinity-based isolation of translating mRNA from hepatocytes that selectively express the green fluorescent protein (GFP)-tagged ribosomal protein (RP), GFP:RPL10A. TRAP circumvents the long time period required for fluorescence-activated cell sorting that could change the gene expression profile. Furthermore, since only the repopulating hepatocytes express the GFP:RPL10A fusion protein, the isolated mRNA is devoid of contamination from the surrounding injured hepatocytes and other cell types in the liver. The affinity-purified mRNA is of high quality and allows downstream PCR- or high-throughput sequencing-based analysis of gene expression.

Translating ribosome affinity purification (TRAP) enables rapid and efficient isolation of cell type-specific translating mRNA. Here, we demonstrate a method that combines hydrodynamic tail-vein injection in a mouse model of liver repopulation and TRAP to examine the expression profile of repopulating hepatocytes.

Perfilado de expresión génica específico del tipo de celda en el hígado del ratón

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

Aislamiento y caracterización de células endoteliales sinusoidales sinusoidales hepáticas primarias de ratón

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Human Liver Microphysiological System for Assessing Drug-Induced Liver Toxicity In Vitro

DILI is a major cause of attrition in drug development with over 1000 FDA-approved drugs known to potentially cause DILI in humans. Unfortunately, DILI is often not detected until drugs have reached clinical stages, risking patients' safety and leading to substantial losses for the pharma industry. Taking into account that standard 2D models have limitations in detecting DILI it is essential to develop in vitro models that are more predictive to improve data translatability. To understand causality and mechanistic aspects of DILI in detail, a human liver MPS consisting of human primary liver parenchymal and non-parenchymal cells (NPCs) and cultured in 3D microtissues on an engineered scaffold under perfusion has been developed. Cryopreserved primary human hepatocytes (PHHs) and Kupffer cells (HKCs) were cocultured as microtissues in the MPS platform for up to two weeks, and each compound of interest was repeatably dosed onto liver microtissues at seven test concentrations for up to four days. Functional liver-specific endpoints were analyzed (including clinical biomarkers such as alanine aminotransferase, ALT) to evaluate liver function. Acute and chronic exposure to compounds of various DILI severities can be assessed by comparing responses to single and multi-dosed microtissues. The methodology has been validated with a broad set of severe and mildly hepatotoxic compounds. Here we show the data for pioglitazone and troglitazone, well-known hepatotoxic compounds withdrawn from the market for causing liver failures. Overall, it has been shown that the liver MPS model can be a useful tool to assess DILI and its association with changes in hepatic function. The model can additionally be used to assess how novel compounds behave in distinct patient subsets and how toxicity profiles may be affected by liver disease states (e.g., viral hepatitis, fatty liver disease).

Human Liver Microphysiological System for Assessing Drug-Induced Liver Toxicity In Vitro

Drug-induced liver injury (DILI) is a major cause of drug failure. A protocol has been developed to accurately predict the DILI liability of a compound using a liver microphysiological system (MPS). The liver model uses the coculture of primary hepatic cells and translationally relevant endpoints to assess cellular responses to treatment.

Sistema microfisiológico hepático humano para evaluar la toxicidad hepática inducida por fármacos in vitro

DILI is a major cause of attrition in drug development with over 1000 FDA-approved drugs known to potentially cause DILI in humans. Unfortunately, DILI is ...

Novel In Vivo Micro-Computed Tomography Imaging Techniques for Assessing the Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a growing global health issue, and the impact of NAFLD is compounded by the current lack of effective treatments. Considerable limiting factors hindering the timely and accurate diagnosis (including grading) and monitoring of NAFLD, as well as the development of potential therapies, are the current inadequacies in the characterization of the hepatic microenvironment structure and the scoring of the disease stage in a spatiotemporal and non-invasive manner. Using a diet-induced NAFLD mouse model, we investigated the use of in vivo micro-computed tomography (CT) imaging techniques as a non-invasive method to assess the progression stages of NAFLD, focusing predominantly on the hepatic vascular network due to its significant involvement in NAFLD-related hepatic dysregulation. This imaging methodology allows for longitudinal analysis of liver steatosis and functional tissue uptake, as well as the evaluation of the relative blood volume, portal vein diameter, and density of the vascular network. Understanding the adaptations of the hepatic vascular network during NAFLD progression and correlating this with other ways of characterizing the disease progression (steatosis, inflammation, fibrosis) using the proposed method can pave the way toward the establishment of new, more efficient, and reproducible approaches for NAFLD research in mice. This protocol is also expected to upgrade the value of preclinical animal models for investigating&#160;the development of novel therapies against disease progression.

Novel In Vivo Micro-Computed Tomography Imaging Techniques for Assessing the Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease

Using a diet-induced non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) mouse model, we describe the use of novel in vivo micro-computed tomography imaging techniques as a non-invasive method to assess the progression stages of NAFLD, focusing predominantly on the hepatic vascular network due to its significant involvement in NAFLD-related hepatic dysregulation.