Los autores desean agradecer al Dr. Klaus Kaestner por el don de murino Ngn3-EGFP línea de células madre embrionarias, la señora Lucy Brown y el Núcleo de Citometría de análisis para la asistencia en la selección de células. Este trabajo fue financiado en parte por subvenciones del NIH R21DK069997 y R01DK081587 otorgado a HTK y del Instituto de California para la Medicina Regenerativa (CIRM), becas de formación concedidas a MW y LS

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	<li>Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Committing+embryonic+stem+cells+to+early+endocrine+pancreas+in+vitro.">Committing embryonic stem cells to early endocrine pancreas in vitro.</a> Stem cells. 22, 1205-1217 (2004).</li><li>Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-expressing+colonies+developed+from+murine+embryonic+stem+cell-derived+progenitors.">Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors.</a> Diabetes. 56, 921-929 (2007).</li><li>Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+in+vitro+differentiation+assay+for+pancreatic-like+cell+development+from+murine+embryonic+stem+cells:+detailed+gene+expression+analysis.">Characterization of an in vitro differentiation assay for pancreatic-like cell development from murine embryonic stem cells: detailed gene expression analysis.</a> Assay. Drug. Dev. Technol. 9, 403-419 (2011).</li><li>Lee, C. S., Perreault, N., Brestelli, J. E., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenin+3+is+essential+for+the+proper+specification+of+gastric+enteroendocrine+cells+and+the+maintenance+of+gastric+epithelial+cell+identity.">Neurogenin 3 is essential for the proper specification of gastric enteroendocrine cells and the maintenance of gastric epithelial cell identity.</a> Genes. 16, 1488-1497 (2002).</li><li>Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. 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Biol. 143, 827-836 (1998).</li><li>Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cultivation+of+human+islets+from+expanded+ductal+tissue.">In vitro cultivation of human islets from expanded ductal tissue.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. 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J., Rabinovitch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy+with+epidermal+growth+factor+and+gastrin+induces+neogenesis+of+human+islet+beta-cells+from+pancreatic+duct+cells+and+an+increase+in+functional+beta-cell+mass.">Combination therapy with epidermal growth factor and gastrin induces neogenesis of human islet beta-cells from pancreatic duct cells and an increase in functional beta-cell mass.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 90, 3401-3409 (2005).</li><li>Hao, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-cell+differentiation+from+nonendocrine+epithelial+cells+of+the+adult+human+pancreas.">Beta-cell differentiation from nonendocrine epithelial cells of the adult human pancreas.</a> Nature Medicine. 12, 310-316 (2006).</li><li>Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+pancreatic+progenitor+cells--recent+studies.">Minireview: pancreatic progenitor cells--recent studies.</a> Endocrinology. 149, 4312-4316 (2008).</li><li>Seaberg, R. 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No tenemos nada que revelar.

Ensayos de colonia que permite la evaluación cuantitativa y funcional de los progenitores pancreáticos individuales se han limitado hasta ahora, que en gran medida obstaculizado el progreso en los estudios de la madre del páncreas y la biología de células progenitoras. La esencia de un ensayo de la colonia es que mide la capacidad intrínseca de las células progenitoras, y no sólo su fenotipo, lo que permite la funcionalidad y el potencial del linaje de las células progenitoras que se observa. También es una herramienta cuantitativa que puede determinar el número de células progenitoras en una población dada. En el campo de células madre hematopoyéticas, los ensayos de la colonia han jugado un papel importante en la identificación, así como descifrar los requisitos del factor de crecimiento, las interacciones y los mecanismos que rigen el compromiso del linaje de estas células. 6 En el campo de la biología de las células pancreáticas progenitoras, el órgano de páncreas 7 , 8 o mayor culturas 9-13 se han concebido, sin embargo, estos ensayos no tratan biológica Questicomplementos en el nivel de células individuales. Sin análisis de células individuales, la existencia de células madre del páncreas de varios potenciales / progenitores no se puede probar de manera inequívoca. 14 Aquí nos muestran que la insulina que expresan la formación de colonias progenitoras se puede probar con una de tres dimensiones, que contienen Matrigel, semi-sólido sistema de cultivo. Aunque un sistema de cultivo en suspensión 15,16 se ha desarrollado lo que permite un solo progenitores pancreáticos adultos a proliferar y diferenciarse en &quot;pancreatospheres&quot;, nuestro ensayo colonia proporciona ventajas adicionales. En primer lugar, nuestra cultura semi-sólido sistema de los medios de comunicación permite placas de hasta 25.000 células ordenados por 500 medios de cultivo L por 24 y manteniendo la formación de colonias resultantes en el rango lineal. 2 Por el contrario, el ensayo pancreatosphere suspensión requiere el uso de un solo método de celdas de deposición del clasificador de células para permitir los análisis de células individuales, y por lo tanto un mayor volumen de medios de cultivo y el espacio de la incubadorase requieren. Por lo tanto, nuestro ensayo colonia es relativamente fácil y económica para llevar a cabo cuando un gran número de células diferentes hay que comparar al mismo tiempo para las actividades de las células progenitoras. En segundo lugar, nuestro medio semi-sólido que permite una distribución uniforme de los componentes de la matriz extracelular y factores de crecimiento, lo que permite tanto la proliferación y la diferenciación que se produzca en el mismo pozo. Por el contrario, es más difícil proporcionar un entorno, en especial la matriz, a las células en cultivo en suspensión. Somos conscientes de que con nuestro método no puede ser probado definitivamente que cada colonia se deriva de una sola célula, como dos progenitores pueden ser colocados aleatoriamente uno cerca del otro y forman una colonia. Sin embargo, este problema puede ser superado mediante el análisis secundario mediante la manipulación de células individuales. Directa la recolección manual de las células individuales ordenados definitivamente podría demostrar el origen de célula única de cada colonia. En resumen, la insulina que expresan la formación de colonias de la actividad profesionalgenitores en medio semi-sólido se describe en este documento ofrece una oportunidad única para estudios de mecánica de células progenitoras pancreáticas en el nivel de células individuales. Por ejemplo, en un informe anterior se encontró que la adición de Matrigel, una mezcla cruda de proteínas de matriz extracelular, en la cultura de los medios de comunicación es necesaria para la formación de la insulina que expresan las colonias de Ngn3-EGFP + células, 2 lo que sugiere la matriz extracelular es importante para los progenitores. El uso de este ensayo de colonia, ahora será posible dividir más y definir los requisitos específicos de la matriz de dicha actividad. Además de estudiar los progenitores derivados de las células madre embrionarias de ratón, actualmente estamos investigando si este sistema de ensayo in vitro también es compatible con la formación de otras colonias distintivo derivado del páncreas y el hígado de ratones adultos y perinatal, así como a partir de tejido pancreático humano desprovisto de cadáveres de los islotes.

<table border="1"><tbody><tr><td> Material / Reactivo </td><td> Empresa </td><td> Catálogo Número </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> 1X DMEM / F-12 (01:01) </td><td> Mediatech </td><td> 15 a 090 CV </td><td></td></tr><tr><td> Suero fetal de ternero </td><td> Cultivo de Tejidos Productos Biológicos </td><td> 201 </td><td> Refiérase a la Sección 1.1 </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Gibco </td><td> 25030-081 </td><td></td></tr><tr><td> 1X PBS de Dulbecco </td><td> Mediatech </td><td> 21 a 031 CV </td><td></td></tr><tr><td> Suero bovino Albúmina </td><td> Sigma </td><td> A8412 </td><td> 7,5% </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> Becton Dickinson </td><td> 356231 </td><td> Reducción del crecimiento Factor </td></tr><tr><td> Metilcelulosa </td><td> Sinetsu Químicos, Tokio, Japón </td><td></td><td> 1.500 centipoise (High-viscosity) </td></tr><tr><td> Nicotinamida </td><td> Sigma </td><td> N0636 </td><td></td></tr><tr><td> Humano Recombinante Activina βB </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 659-AB-025 </td><td></td></tr><tr><td> La exendina-4 </td><td> Sigma </td><td> E7144 </td><td></td></tr><tr><td> Humano Recombinante VEGF-A </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 293-VE-010 </td><td></td></tr><tr><td> Placas de 24 pocillos </td><td> Costar </td><td> 3473 </td><td> Ultra-bajo Fijación </td></tr><tr><td> 60mm Petri con rejilla </td><td> Nunc </td><td> 169558 </td><td></td></tr></tbody></table>

a quantitative assay for insulin-expressing colony-forming progenitors

El campo de la madre del páncreas y la biología de células progenitoras se ha visto obstaculizada por la falta de ensayos funcionales in vitro y cuantitativos que permiten el análisis de la célula. Los análisis de los progenitores solo son de vital importancia porque proporcionan formas definitivas para demostrar de manera inequívoca el potencial del linaje de los progenitores individuales. Aunque los métodos han sido diseñados para generar &quot;pancreatospheres&quot; en la cultura de la suspensión de células individuales, existen varias limitaciones. En primer lugar, es mucho tiempo para llevar a cabo la deposición única célula de un gran número de células, que a su vez en los comandos de grandes volúmenes de medios de cultivo y el espacio. Numeración segundo, de la pancreatospheres resultante es mano de obra, sobre todo cuando la frecuencia de los progenitores iniciar pancreatosphere-es baja. En tercer lugar, el ensayo pancreatosphere no es un método eficiente para permitir que tanto la proliferación y diferenciación de células progenitoras pancreáticas en la misma cultura, así, volver astricting la utilidad de la prueba. Para superar estas limitaciones, un ensayo semi-sólido basado en colonia de células progenitoras pancreáticas se ha desarrollado y se presenta en este informe. Este método se aprovecha de un concepto ya existente de la prueba de la colonia hematopoyéticas, en el que la metilcelulosa se utiliza para proporcionar la viscosidad de los medios de comunicación, permitiendo que las células progenitoras de permanecer en un espacio tridimensional que sean sometidos a la proliferación y la diferenciación. Para enriquecer la insulina que expresan la formación de colonias progenitoras de una población heterogénea, que utilizaron las células que expresan neurogenina (NGN) 3, un endocrino pancreático progenitor marcador de célula. Madre embrionarias murinas (ES) derivadas de células Ngn3 células que expresan marcado con el mejor reportero de la proteína verde fluorescente fueron ordenados y hasta 25.000 células por pocillo se sembraron en poco apego de 24 y placas de cultivo. Cada así figura 500 l de medio semi-sólido con los siguientes componentes principales: se reunióhylcellulose, Matrigel, nicotinamida, la exendina-4, βB activina, y los medios de comunicación condicionado recogido de murino de células ES de origen como de páncreas células. Después de 8 a 12 días de la cultura, la insulina que expresan las colonias con morfología característica se formaron y podrían ser analizadas para la expresión de genes de páncreas utilizando RT-PCR cuantitativa y tinción immunoflourescent para determinar la composición del linaje de cada colonia. En resumen, nuestro análisis colonia permite una fácil detección y cuantificación de los progenitores funcionales dentro de una población heterogénea de células. Además, el formato semi-sólido permite la presentación uniforme de los componentes de la matriz extracelular y factores de crecimiento para las células, permitiendo a los progenitores que proliferan y se diferencian in vitro. Este ensayo colonia ofrece oportunidades únicas para estudios sobre el mecanismo de las células progenitoras pancreáticas en el nivel de células individuales.

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A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

Un ensayo de tres dimensiones que permite clonigénicas como de páncreas, células progenitoras a diferenciarse en la insulina que expresan las colonias se describe. Este método tiene la ventaja de medio semi-sólido que contiene factores de metilcelulosa, Matrigel y el crecimiento, en el que los progenitores solo proliferan y se diferencian<em&gt; In vitro</em&gt;, Lo que permite la cuantificación del número de células progenitoras funcional en una población.

Un análisis cuantitativo de la insulina que expresan la formación de colonias de progenitores

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

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Biology

13.4K vistas.  California State University Channel Islands. Un ensayo de tres dimensiones que permite clonigénicas como de páncreas, células progenitoras a diferenciarse en la insulina que expresan las colonias se describe. Este método tiene la ventaja de medio semi-sólido que contiene factores de metilcelulosa, Matrigel y el crecimiento, en el que los progenitores solo proliferan y se diferencian In vitro, Lo que permite la cuantificación del número de células progenitoras funcional en una población.