Yazarlar, Dr Klaus Kaestner Ngn3-EGFP fare embriyonik kök hücre hattı, Bayan Lucy Brown ve hücre sıralama yardım için Analitik Sitometri Core hediye için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, MW ve LS verilen eğitim hibeleri HTK için verilen NIH hibe R21DK069997 ve R01DK081587 ve Rejeneratif Tıp (CIRM) için California Institute of kısmen finanse edildi

1. Farklılaşma, pankreas-benzeri hücreler in vitro fare ES hücrelerinin koloni tahlil için klimalı ortam oluşturmak için (CM ) Fare ES hücre bakımı için prosedürler, daha fazla farklılaşması için süspansiyon kültür ve ek kültür embriyoid vücut (EB) oluşumu, daha önce 1-3 açıklanan ve bu raporun odak olmuştur. Şematik bir sunum farklılaşma protokolde yer alan adımları Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. Yüksek kaliteli şartlandırılmış ortam elde etmek için, ilk önce, bunların en az% 30-40, en az 150 mm çapları ile olduğu 6 gün eski EBS oluşturmak için önemlidir. Büyük EBS gelişmiş farklılaşma (Şekil 2) öne ışık mikroskobu altında koyu renkli lekeler, içermelidir. Yüksek kalitede fetal buzağı serumu (FCS) seçimi gibi EBS oluşturmak için kritik öneme sahiptir. Yüksek kalite FCS pek çok diferansiye desteklemek için yeteneklerine göre seçilirEBS iyon insülin 1, glukagon ve daha sonraki aşamalarda amilaz 2A gen ekspresyonu (18-20 gün), RT-PCR analizi ile tespit doğru. Hafifçe kuyuların merkezi haline toplamak için gün-6 EBS plakaları döndürmek için önemli Ayrıca, gün-6 EBS süspansiyon kültürünün eklenti kültür (6 kuyucuğu iyi ortalama 100 EBS yaklaşık 80) aktarılır. Sonraki eki kültür aşamasında EBS pankreas gibi hücrelerin daha iyi gelişme hücre-hücre temas sonucu geliştirmek nedenleri bilinmiyor, manevralar için. <ol><li> Kültür 13. günde, taze ek kültürü ile eki kültür ortamı (DMEM/F-12 (1:1),% 15 nakavt serum değiştirme, 2 mM L-glutamin, 50 U / ml penisilin, 50 mikrogram / ml streptomisin) yerine medya containing10 mM nikotinamid, 0.1 nM eksendin-4, ve 10 ng / mL insan rekombinant aktivin SSB (tüm konsantrasyonlarda kesindir). </li><li> Kültür günde 16, 1.1 adım medya toplamak ve 0.2 mikron polieterler filtresindenulfone membran. Bu noktadan itibaren toplanan medya klimalı ortam (CM) olarak sevk edilecektir. Kısım 15 ml Falcon tüp içine CM ve -80 ° C &#39;ye kadar yarı-katı kültür hemen önce (bkz. Bölüm 3). </li></ol> 2. Pankreas gibi bir floresan aktif hücre sıralayıcı kullanarak tek bir hücre süspansiyonu atalarıdır Elde Etme Knock-fare ES hücre hattı, 4 EGFP muhabiri gen Ngn3 lokus bir alleli, daha önce açıklanan 2 Ngn3 bir temel içeren helix-loop-heliks (bHLH) transkripsiyon faktörü olarak farklılaşmış yerine Ngn3 EGFP, olarak belirlenmiş 5 Gün-16 kültürleri normal gelişimi sırasında pankreatik endokrin atalarıdır ifade farklılaşmış Ngn3 EGFP + ve Ngn3 EGFP elde sıralaması - hücreleri 1,2 <ol><li> Farklılaşmış hücreler tek bir hücre süspansiyonu çözülmesi. <ol><li> Inkübe gün-16 kültürleri with% 0.25 tripsin-EDTA (3 dk, 37 ° C) kültür kuyulardan hücreleri yerinden. </li><li> Tripsin aktivitesi durdurmak için% 10 FCS ekleyin. </li><li> , Magnezyum ve kalsiyum hücre yıkayın fosfat tamponlu salin (PBS) 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de% 0.1 sığır serum albumini (BSA) ve santrifüj içeren. </li><li> Süpernatantı ve 4 mg / ml kollajenaz B ve 2000 U / ml deoksiribonükleaz (DNaz) (30 dk, 37 ° C) ile hücre kümeleri, tek bir hücre süspansiyonu üretmek için kuluçkaya yatmaktadır. Hücre pelet ayrışma sürecini hızlandırmak için her 10 dakikada bir bozabilir 1000 mcL pipet kullanın. </li><li> Hücreleri% 0.1 BSA içeren PBS ile yıkayın ve 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de santrifüj. </li><li> Süpernatantı ve% 0.1 BSA içeren PBS ile hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. </li></ol></li><li> Sıralama için hücrelerin hazırlanması. <ol><li> Sıralama sırasında hücre reaggregation önlemek için her türlü mL hücre süspansiyonu için 2 mcL DNaz I (1 MU / ml) ekleyin. </li><li> 40 - 70 mikron m yoluyla Pass tek hücre süspansiyonubüyük hücreli agrega kaldırmak için ESH. </li><li> Tek hücre süspansiyonu DAPI (1 mcg / mL son konsantrasyon) ekleyin. </li><li> Bir hücre sıralayıcı flow sitometri veri elde. MoFlo MLS (Beckman Coulter) hücre sıralayıcı bu rapor için kullanılmıştır. </li><li> Sıralama için hücre popülasyonlarının yolluk. Ngn3-EGFP + ve - Ngn3-EGFP hücreleri forward scatter karşı tarafında dağılım ile ilk kapılı (Şekil 3A), DAPI karşı tarafında dağılım (Şekil 3B), darbe genişliği vs. Tarafında dağılım (Şekil 3C) tarafından takip ve nihayet FL1 vs otomatik floresans (Şekil 3D). Sıralama sırasında hücreler Ngn3-EGFP kirlenmesini sınırlamak amacıyla; Ngn3-EGFP nihai sıralama kapısı + hücreler bilerek hakkı (ok Şekil 3E) taşınır. Negatif kontrol için yolluk Ngn3-ES EGFP çizgi ya da aynı sahnede, gün-16 kültür TL1 ES hücreleri (Şekil 3D, sol panel) gibi transgenik olmayan bir çizgi, kullanılabilir, her iki gün-6 EBS. </li></ol></li><li> Sıralama Ngn3 EGFP + ve Ngn3 EGFP <sup&gt; hücreler. </li></ol> 3. Sıralanmış hücreleri yarı-katı kültür Kaplama <ol><li> Matrigel hazırlanması. <ol><li> Tüp başına 1 ml ve kullanmadan önce -20 ° C&#39;de muhafaza kısım Matrigel. </li><li> Donmuş halde 4 konulmalıdır ° C 3 saat kullanımdan hemen önce çözünmesi için gece boyunca ya da buz. Çözülmüş alikotları resolidification önlemek için, yarı-katı kültür hazırlanması sırasında buz üzerinde kalmalıdır. </li></ol></li><li> Metilselüloz solüsyonu (% 3.3) hazırlanması. Metilselüloz toz otoklava olamaz. Bakteri serbest metilselüloz çözüm elde etmek için, hazırlık sürecinde temiz ağırlığındaki tekneler ve otoklava heyecan bar, bardak, matara ve diğer donanım kullanın. <ol><li> Bir gün önce metilselüloz çözeltisi, steril çift distile su deposu 200 mL, 4 ° C Ayrıca, 2x 500 ml ve 100 U / ml penisilin içeren DMEM/F12 medya (toz DMEM / F-12 eriterek hazırlamak distile su iki katına) hazırlamak4 az 100 mcg / ml streptomisin ve mağaza ° C </li><li> Metilselüloz hazırlık gününde, üstüne bir parça alüminyum folyo ile 1000 ml&#39;lik cam behere 500 mL steril çift distile su ekleyin. Hava kabarcıkları su kurtulmak için en az 30 dakika kaynatın. </li><li> 2000 ml&#39;lik cam balona büyük ölçekli bir heyecan bar (uzunluğu en az 3 inç) yerleştirin. </li><li> 300 ml kaynar su ölçün ve erlene aktarın. </li><li> Bir heyecan plaka (ısıtma olmadan) şişesi yerleştirin. Yavaş yavaş hava kabarcıkları oluşturarak önlemek için sıcak su karıştırılır. </li><li> Metilselüloz tozu 33 gram ağırlığında ve çok yavaş sıcak su ekleyin. Sıcak su verimli metilselüloz tozu, ıslak ve soğuk sonraki çözülme yardım etmek için gerekli. </li><li> Toz sıcaklığı yaklaşık 40-45 azalır kadar çırpmaya devam edin ° C </li><li> 200 ml soğuk steril çift distile su soğutma metilselüloz karışıma ekleyin. Hemensonra, bu metilselüloz sulu fazına çözme gösteren, çözüm saydam ve viskoz açmak görmek için başlamalıdır. Çözüm sağlamak için El girdap şişeyi iyice karıştırılır. </li><li> 500 ml soğuk 2x DMEM/F12 medya ekleyin. Karıştırmak için elle girdap devam edin. </li><li> Soğuk bir odaya heyecan plaka şişesi koyun ve yavaş yavaş 24-48 saat metilselüloz çözüm karıştırın. </li><li> Depolama şişe başına 125 ml, ve -20 ° C&#39;de saklayın içine kısım çözüm Bir örnek steril bir petridish boşaltılan ve 37 ° C inkübatör sterilite test konulmalıdır. Çözülmüş metilselüloz çözüm 2 aya kadar buzdolabında saklanabilir. </li></ol></li><li> Koşullu ortam hazırlanması. Çözülme CM (bkz. Bölüm 1) hemen önce kullanın. CM yarı katı kültür hazırlama boyunca buz üzerinde tutun. </li><li> Aşağıdaki büyüme faktörleri hazırlayın: 1.0 M nikotinamid, 0.1 mcM eksendin-4, 10 mcg / ml rekombinant insan aktivin βB, ve 10 &amp; mu, g / ml VEGF-A. ° C ve aktivin βB ve VEGF-A -80 ° C -20 nikotinamid ve eksendin-4 saklayın ve kullanmadan önce bunları hemen Çözülme. Bütün yarı katı kültür ortamı bileşenleri kaplama sırasında buz üzerinde tutulmalıdır. Ayrıca VEGF-A daha sonra koloni oluşumu için gerekli olduğunu belirtmek gerekir. 2 </li><li> Fetal buzağı serumu hazırlanması. FCS kullanım önce inaktive ısı olmalıdır. 30 dakika boyunca FCS inkübe 56 ° C kompleman proteinleri inaktive bir su banyosu. Ilk FCS stok şişe fazla 500 ml kısım 125 ml flakon içine tutar. Tüm hacim, yüzey alanı artırılmış ve hatta iyi bir ısıtma sağlayacaktır. -20 ° C&#39;de saklamadan önce şişe en az 1 saat oda sıcaklığında soğumaya bırakın Çözülmüş FCS 0.2μm kullanmadan önce filtre edilir. </li><li> Sıralanmış hücreler kültür bileşeninin karıştırın. Katılaşma önlemek için her zaman hazırlanması sırasında buz üzerinde hücreleri ve tüm yarı-katı ortam bileşenleri tutunMatrigel. Dahil olmak üzere Matrigel ile temas eden tüm kaynakları, pipet uçları, şırıngalar ve iğneler, soğuk olmalıdır. -20 ° C ile en az yarım saat kullanmadan önce bu malzemeleri koyun. <ol><li> Kişi başına 24 plaka numaralı seribaşı olması hücrelerin miktarı belirleyin. 24-de ortalama 25.000 hücrelere kaplama olabilir. Bir optimal tohumlama hücre sayısını belirlemek için ilk deneylerde hücre yoğunluğu bir titrasyon gerçekleştirebilir. </li><li> Tablo 1&#39;de açıklanan sıra bir çırpıda kapağı (hücrelerin erken uyarılması önlemek için son eklenen olduğunu unutmayın) ile 5 ml polistiren tüp kültür bileşenlerini ekleyin. Ilk polistiren tüpler için% 3.3 metilselüloz ekleyin ve sıralaması hücreleri son. % 3.3 metilselüloz çözüm hazırlanan ve 16 ½ gauge iğne ve yeterli işaretlenmiş mezun şırınga ile polistiren tüpler eklenecek ihtiyacı olduğunu unutmayın. Için doğru bir biçimde genel olarak,% 3.3 metilselüloz sol gibi, viskoz çözümleri hacmini ölçmek içinution ve nihai bir kültür karışımı, ilk şırınga bazı çözüm aspirat için önemli, ve hemen ardından havayı dışarı atmak için çözüm dışarı itmek. Çizmek için çok zor ise% 3.3 metilselüloz çözüm oda sıcaklığına kadar ısıtılmalıdır. Ancak, polistiren tüp içine ve Matrigel ek önce reçete sonra buz üzerinde soğutulur sağlar. </li></ol></li><li> Sıralanmış hücreleri içeren yarı-katı medya Plate. <ol><li> Polistiren tüplerin kapakları olduktan sonra sıkıca yerinde, güçlü ve tüpler ellerinizi iyice sallayın. Hava kabarcıkları bu işlem sırasında oluşturulur. </li><li> 5 dakika boyunca buz üzerinde veya küçük hava kabarcıkları yüzeyine kadar tüpler yerleştirin. </li><li> Içeriğini aspire 16 ½ veya 18 ½ iğne ile 1 ml şırınga kullanın. Şırınga hava olmadan viskoz çözüm doğru hacmi çekmek için 3.6.2 tavsiyelerine uyun. </li><li> Yavaş yavaş her 24-iyi medya 500 uL dağıtmak. Kullanımdüşük ek 24 kuyucuğu sadece. Medya iyi merkezine doğrudan ekleyin. Yarı-katı medya kuyularda otomatik olarak yayıldı. Her deneysel örnek için, quadruplicated kuyu rutin istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar elde etmek amacıyla kullanılır. Sadece yatay odaklı bir 24 plaka 4 içteki sütun kültür için kullanılmaktadır. Içeren hücre kültürü nemlendirme yardım etmek için, steril su ile kalan kuyuları doldurun. </li><li> 37 ° C ve% 5 CO 2 hava hücreleri inkübe edin. </li><li> Büyüme faktörlerinin yanı sıra Gecikmeli. Kültür başlandıktan sonra büyüme faktörleri eklemek mümkündür. Bu tür manevraları bazı büyüme faktörlerinin sağkalım etkileri gidermek için kullanılan olabilir. 26 G 3 / 8 iğne ile 1 ml şırınga ile damladı iyi ortalama 100 mcL büyüme faktörü çözümleri ve yarı-katı ortama diffüz olabilir. </li></ol></li></ol> 4. Işık mikro altında koloni oluşumu Gözlembaşa çıkmak Hücreler tek hücre rastgele ve kuyulardan dışarı boyunca eşit olarak dağıtılmasını sağlamak için kaplama sonrası hemen dikkat edilmelidir. Hücreleri veya ortaya çıkan koloniler en kuyuların marjı dağıtılır, bu kuyuların içine yarı-katı medya dağıtım (bkz. bölüm 3.7.4) çok zorlayıcı olduğunu gösterecektir. Kültür kuyuların marjları menisküs etkisi koloni yoğunluğu nedeniyle merkezde ikamet edenlere göre daha yüksek olabilir. <ol><li> Koloni sayısı kantifikasyon. 3-boyutlu medya özelliği nedeniyle, koloniler farklı odak noktaları belirir. Böylece, her koloni için odak bir ayarlama, ışık mikroskobu ile gözlem sırasında gerekli olabilir. Iki kez aynı koloni kayıt önlemek için sayarken 24 altında bir ızgara takın. Bir ızgara, bir Nunc petridish (Kat. No.169558) duvar kesim tarafından elde edilebilir. Işık mikroskobu 10x objektif lens atıl olarak kullanılan olmalıdırerve ve kolonilerin sayısı. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Önceki deneyler, 2.5 x 10 5 fare R1 ES hücrelerinin (50 ml medya toplam) ile başlayan biri yaklaşık 5000 uygun büyüklükte gün-6 EBS oluşturmak için bekliyor olabilir göstermişti . Ngn3 EGFP ES hücrelerinin daha az verimli; 6 gün 4 kat daha fazla hücre oluşturmak için benzer büyüklükte EBS istendi. 25 gün-6 EBS içerdiğinden 1.88, ortalama ± 0.67 x 10 5 hücreleri, 1 yaklaşık olarak 37.6 x 10 6 hücre, 5000 EBS elde edilebilir . Ekin kültür sırasında hücreler 2.72 ± 0.32 kat artması beklenmektedir. 1 Bu nedenle, 5000 gün-6 EBS sıralamadan önce yaklaşık 100 x 10 6 gün-16 hücreleri verecektir. Yolluk sonra, Ngn3 EGFP + hücrelerin toplam 16 gün hücre popülasyonu (Protokol Metin Bölüm 2.2.5 ve Şekil 3) yaklaşık% 10 kadar yapacak. Örnek photomicrogrfare ES hücrelerinin insülin ifade koloniler APHS Şekil 4&#39;te gösterilmiştir. Bu koloniler belirgin bir morfoloji; koloniler küçük, karanlık ve yansıtıcı ışık değil, tek tek hücrelerin (~ 60-100 mm) ile küçük yuvarlak koloniler. Daha önceki yayın, 2 real-time RT-PCR ve tek tek elle toplanır koloniler çift immunofluorescent boyama, C-peptid ve glukagon insülin ifade saptandı. Bu sonuçlar, endokrin hücreler gibi ilkel ilk dalga benzeyen, aynı anda en az iki adacık hormon içeren hücrelerin içine ayırt etmek için tek Ngn3-EGFP + hücreler yeteneğini göstermektedir . Dağınık tek hücreler için koloni testi in vitro (Şekil 5) çoğalması ve farklılaşması başlatmak için kapasitesine sahip olanlar atalarıdır için çalışma sağlar. Böylece, bu içsel bireysel progenitör hücrelerin işlevini ölçebilirsiniz bir testtir. Capabi atalarıdırinsülin ifade koloniler olma vasıflı denir insülin ifade koloni oluşturan birim (ICFUs) (Şekil 5). MES hücre kökenli nüfus hücreleri ICFUs zenginleştirilmiş 2 Ancak, bu atalarıdır frekans hala gelişmekte olan pankreas Ngn3 işaretleri endokrin progenitör hücreler, 5 Ngn3-EGFP +, ama Ngn3 EGFP değil fikri tutarlı düşük; 16 gün kültürden izole edilen toplam Ngn3-EGFP + nüfusun yaklaşık% 0.1 -% 0.6 ICFUs 2 Ne olursa olsun, açık bir fark koloni oluşturan verimlilik, en yüksek Ngn3-EGFP + hücreler tarafından takip bekleniyor . sonra presorted hücreleri ve Ngn3 EGFP hücreler. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3148/3148fig1.jpg" /> Şekil 1 pankreas benzeri hücreler in vitro fare ES hücrelerinin farklılaşma Timeline. Klimalı ortam (CM) üretimi için, fare ES cells EBS oluşturmak için monotiyogliserol azalan dozlarda (ilk iki gün ve 6.0 x 10 -4 M 6.0 x 10 -3 M aşağıdaki dört gün süreyle) ile ilk altı gün için% 15 FCS ile süspansiyon yetiştirilmektedir. Gün-6 EBS (iyi ortalama 80-100) sonra Eke aktarılır 6-iyi% 15 nakavt serum değiştirme içeren yemekler. % 5 FCS EBS eki hızlandırmak için kültür 6-10 gün arasında olabilir. Nikotinamid, eksendin-4 ve insan rekombinant aktivin βB sonra medya kültürü gün 13 (bkz. bölüm 1.1) eklenir. Medya kültürünün gün 16 toplanan ve bu noktada klimalı ortam haline gelmiştir. Gün 16 hücreler daha sonra sıralanır ve koloni tayini için yarı-katı ortama kaplanmıştır. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3148/3148fig2.jpg" /> Şekil 2 fare embriyonik kök hücrelerinden elde edilen büyük gün-6 embriyoid organları Temsilcisi yüzey elde. İdeal günlük 6 EBS çapı en az 150 mikronaçmak mümkündür ve karanlık merkezleri (oklar). İfade erken pankreas progenitör belirteçleri (Pdx-1 ve Sox9) bu EBS (veriler gösterilmemiştir). 3 geliştirilmiş <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3148/3148fig3.jpg" /> Şekil 3. MES hücre kökenli gün-16 Ngn3 EGFP ifade hücrelerin kapıları Sıralama. (A) scatter kapıları, hücre boyutu ve sırasıyla taneciklik göstergesi İleri ve yan, hücresel olmayan bir enkaz ortadan kaldırır. (B) DAPI 450/40 bir filtre ile tespit 405-413 nm ve emisyon heyecanlı pozitif boyanmış olacaktır ölü hücreleri tanımlamak için kullanılır. (C) Darbe genişliği, elektronik forward scatter darbe genişliği, çiftlerin, floresan aktif hücre sıralayıcı geçirilerek önce ortadan kaldırılması gerektiğini ortaya koymaktadır. (D) EGFP Ayırıcı (kanal FL1) karşı TL1 (sol panel) gibi bir kontrol ebeveyn hücre hattı otofloresans gün-16 hücreleri kullanarak gerçek floresans ve böylece Ngn3-EGFP aydınlatan &lt;&gt; + hücre popülasyonu (sağ panel) destek. (E) Kırmızı ok sadece yanlış pozitif hücrelerin mesafeyi artırmak için sıralama önce EGFP + kapı manuel sağ-shift gösterir. Olaylar her iki (D) ve (E) bölgelere göre kapılı olan (R1 - R3) (AC) gösterilir. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3148/3148fig4.jpg" /> Şekil 4 Temsilcisi fotomikrografı insülin ifade yarı katı kültür koloniler. Koloniler rastgele dağıtılan ve küçük, karanlık, ışık yansıtıcı olmayan kümeleri olarak görünür. Bireysel koloniler daha sonra, RT-PCR ve immünohistokimyasal analizler, (videoyu görmek gösterilmemiştir) tarafından, gen ve protein ekspresyonu için çalışılmalıdır. <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/3148/3148fig5.jpg" /> Şekil 5, tek progenitör hücrelerin fonksiyonel ve kantitatif değerlendirmelere olanak sağlayan bir koloni tahlil . Kolonilerin sayılandırma frekans hesaplamak için kullanılırtoplam kaplı hücreler arasındaki progenitör hücrelerin uency. Her bir koloni içindeki hücrelerin oluşumu başlatan progenitör soyundan potansiyelinin göstergesidir. Bu testte, fare embriyonik kök hücrelerinden elde edilen Ngn3 EGFP + hücreler insülin ifade koloni oluşturan birim (ICFUs), içine ayırt etmek yeteneğine sahip progenitör hücrelerin insülin ifade koloniler 2 için zenginleştirilmiş olduğu bulundu. <img alt="Tablo 1" src="/files/ftp_upload/3148/3148table1.jpg" /> (Tablo 1). Yarı-katı Kültür Medya Bileşenleri ve Toplama Düzeni.

<ol>
	<li>Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Committing+embryonic+stem+cells+to+early+endocrine+pancreas+in+vitro.">Committing embryonic stem cells to early endocrine pancreas in vitro.</a> Stem cells. 22, 1205-1217 (2004).</li><li>Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-expressing+colonies+developed+from+murine+embryonic+stem+cell-derived+progenitors.">Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors.</a> Diabetes. 56, 921-929 (2007).</li><li>Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+in+vitro+differentiation+assay+for+pancreatic-like+cell+development+from+murine+embryonic+stem+cells:+detailed+gene+expression+analysis.">Characterization of an in vitro differentiation assay for pancreatic-like cell development from murine embryonic stem cells: detailed gene expression analysis.</a> Assay. Drug. Dev. Technol. 9, 403-419 (2011).</li><li>Lee, C. S., Perreault, N., Brestelli, J. E., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenin+3+is+essential+for+the+proper+specification+of+gastric+enteroendocrine+cells+and+the+maintenance+of+gastric+epithelial+cell+identity.">Neurogenin 3 is essential for the proper specification of gastric enteroendocrine cells and the maintenance of gastric epithelial cell identity.</a> Genes. 16, 1488-1497 (2002).</li><li>Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+the+pancreatic+lineage:+NGN3++cells+are+islet+progenitors+and+are+distinct+from+duct+progenitors.">Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors.</a> Development. 129, 2447-2457 (2002).</li><li>Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+proliferation+of+hematopoietic+stem+cells.">Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells.</a> Blood. 81, 2844-2853 (1993).</li><li>Gittes, G. K., Galante, P. E., Hanahan, D., Rutter, W. J., Debase, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-specific+morphogenesis+in+the+developing+pancreas:+role+of+mesenchymal+factors.">Lineage-specific morphogenesis in the developing pancreas: role of mesenchymal factors.</a> Development. 122, 439-447 (1996).</li><li>Miralles, F., Battelino, T., Czernichow, P., Scharfmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+plays+a+key+role+in+morphogenesis+of+the+pancreatic+islets+of+Langerhans+by+controlling+the+activity+of+the+matrix+metalloproteinase+MMP-2.">TGF-beta plays a key role in morphogenesis of the pancreatic islets of Langerhans by controlling the activity of the matrix metalloproteinase MMP-2.</a> J. Cell. Biol. 143, 827-836 (1998).</li><li>Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cultivation+of+human+islets+from+expanded+ductal+tissue.">In vitro cultivation of human islets from expanded ductal tissue.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 7999-8004 (2000).</li><li>Gao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+endocrine+progenitor+cells+and+critical+factors+for+their+differentiation+in+human+adult+pancreatic+cell+culture.">Characterization of endocrine progenitor cells and critical factors for their differentiation in human adult pancreatic cell culture.</a> Diabetes. 52, 2007-2015 (2003).</li><li>Gao, R., Ustinov, J., Korsgren, O., Otonkoski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+neogenesis+of+human+islets+reflects+the+plasticity+of+differentiated+human+pancreatic+cells.">In vitro neogenesis of human islets reflects the plasticity of differentiated human pancreatic cells.</a> Diabetologia. 48, 2296-2304 (2005).</li><li>Suarez-Pinzon, W. L., Lakey, J. R., Brand, S. J., Rabinovitch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy+with+epidermal+growth+factor+and+gastrin+induces+neogenesis+of+human+islet+beta-cells+from+pancreatic+duct+cells+and+an+increase+in+functional+beta-cell+mass.">Combination therapy with epidermal growth factor and gastrin induces neogenesis of human islet beta-cells from pancreatic duct cells and an increase in functional beta-cell mass.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 90, 3401-3409 (2005).</li><li>Hao, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-cell+differentiation+from+nonendocrine+epithelial+cells+of+the+adult+human+pancreas.">Beta-cell differentiation from nonendocrine epithelial cells of the adult human pancreas.</a> Nature Medicine. 12, 310-316 (2006).</li><li>Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+pancreatic+progenitor+cells--recent+studies.">Minireview: pancreatic progenitor cells--recent studies.</a> Endocrinology. 149, 4312-4316 (2008).</li><li>Seaberg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+identification+of+multipotent+precursors+from+adult+mouse+pancreas+that+generate+neural+and+pancreatic+lineages.">Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages.</a> Nature Biotechnology. 22, 1115-1124 (2004).</li><li>Rovira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+centroacinar/terminal+ductal+progenitor+cells+in+adult+mouse+pancreas.">Isolation and characterization of centroacinar/terminal ductal progenitor cells in adult mouse pancreas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 75-80 (2010).</li></ol>

Biz ifşa etmek başka bir şey var.

Bireysel pankreas atalarıdır kantitatif ve fonksiyonel değerlendirmeler izin Colony deneyleri pankreas kök ve progenitör hücre biyolojisi çalışmalarında ilerleme büyük ölçüde engellendiği, şimdiye kadar sınırlı kalmıştır. Bir koloni testinin özünü progenitör hücrelerin işlevselliğini ve soy potansiyelleri uyulması gereken izin, progenitör hücrelerin içsel yeteneği değil, sadece kendi fenotip ölçen. Aynı zamanda, belirli bir nüfus progenitörlerin sayısını belirlemek nicel bir araçtır. Hematopoetik kök hücre alanında, koloni deneyleri tanımlanmasında önemli rol oynadı, hem de bu hücrelerin köken taahhüt düzenleyen büyüme faktörü gereksinimleri, etkileşimleri, ve mekanizmaları deşifre var. 6 pankreas progenitör hücre biyolojisi, pankreas organı 7 alanında 8 veya toplu kültürleri 9-13 icat edilmiştir, ancak, bu tür testlerin biyolojik soru adresi yoktek hücre düzeyinde eklentileri. Tek hücre analizi olmadan, çok potansiyel pankreas kök / progenitörlerin varlığı su götürmez bir şekilde kanıtlanmıştır. 14 Burada olduğunu göstermektedir insülin ifade koloni oluşturan atalarıdır üç boyutlu Matrigel içeren, yarı katı kültür sistemi kullanılarak test edilmelidir. Bir süspansiyon kültürü sistemi 15,16 çoğalmalı ve &quot;pancreatospheres&quot; içine ayırt etmek için tek yetişkin pankreas atalarıdır izin geliştirilmiş olmasına rağmen, koloni tahlil ek avantajlar sağlar. İlk olarak, yarı-katı kültür medya sistemi, 24-de başına 500 mcL kültür ortamı başına 25.000 sıralanmış hücreler kadar kaplama lineer aralıkta meydana gelen koloni oluşumu korurken, 2 aksine, süspansiyon pancreatosphere testi tek kullanımını gerektirir sağlar hücre sıralayıcı hücre birikimi yöntemi tek bir hücre analizleri, izin ve böylece kültür ortamı ve inkübatör alanı daha büyük bir hacimgereklidir. Bu nedenle, bizim koloni tahlil progenitör faaliyetleri için aynı anda çok sayıda farklı hücreler karşılaştırıldığında gerekir yapmak için nispeten kolay ve uygun maliyetli. İkincisi, bizim yarı-katı medya ekstraselüler matriks bileşenleri ve büyüme faktörleri, hem proliferasyonu ve farklılaşması, aynı kuyuda meydana sağlar tekdüze dağılım sağlar. Aksine, hücre süspansiyon kültürü böyle bir ortamda, özellikle de matris sağlamak için daha zordur. Biz iki atalarıdır rastgele birbirlerine ve bir koloni yakın konumlandırılmış olabilir yöntemi ile kesin olarak, her koloninin tek bir hücrenin türetilmiş olduğunu ispat edilemez olduğunu farkındayız. Ancak bu sorun, tek bir hücre manipülasyonu kullanarak ikincil analizi ile üstesinden gelinebilir. Kesin sıralaması tek hücreleri doğrudan el toplama Her koloninin tek bir hücre kökenli göstermelidir. Özet olarak, koloni oluşturan yanlısı aktivite insülin ifadeyarı-katı medya genitors burada açıklanan tek hücre düzeyinde pankreas atalarıdır mekanik çalışmalar için eşsiz fırsatlar sağlar. Örneğin, bir önceki raporda, medya kültürü içine insülin ifade ekstraselüler matriks düşündüren Ngn3-EGFP + hücreler, 2 koloniler oluşumu için gerekli olan Matrigel bu ek, ekstrasellüler matriks proteinleri ham karışımı bulundu . bu atalarıdır için önemlidir. Bu koloni testi kullanılarak, şimdi daha da inceleyecek ve bu tür faaliyet için özel matriks gereksinimleri tanımlamak mümkün olacaktır. Fare embriyonik kök hücrelerinden elde edilen atalarıdır eğitimi için ek olarak, şu anda bu in vitro test sisteminde ayrıca diğer ayırt edici perinatal ve yetişkin farelerin pankreas ve karaciğer türetilmiş koloniler yanı sıra yoksun insan kadavra pankreas dokusundan oluşumu desteği olup olmadığını araştırıyoruz adacık.

<table border="1"><tbody><tr><td> Malzeme / reaktif </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numara </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> 1X DMEM / F-12 (1:1) </td><td> Mediatech </td><td> 15-090-CV </td><td></td></tr><tr><td> Fetal buzağı serumu </td><td> Doku Kültürü Biyolojik </td><td> 201 </td><td> Bölümüne bakın 1,1 </td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Gibco </td><td> 25030-081 </td><td></td></tr><tr><td> 1X Dulbecco&#39;nun Kullanıcı PBS </td><td> Mediatech </td><td> 21-031-CV </td><td></td></tr><tr><td> Sığır Serum Albümin </td><td> Sigma </td><td> A8412 </td><td> % 7.5 </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> Becton Dickinson </td><td> 356231 </td><td> Azaltılmış Büyüme Faktör </td></tr><tr><td> Metilselüloz </td><td> Sinetsu Kimya, Tokyo, Japonya </td><td></td><td> 1.500 Santipuaz (Yüksek-viscosity) </td></tr><tr><td> Nikotinamid </td><td> Sigma </td><td> N0636 </td><td></td></tr><tr><td> Insan Rekombinant Aktivin βB </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 659-AB-025 </td><td></td></tr><tr><td> Eksendin-4 </td><td> Sigma </td><td> E7144 </td><td></td></tr><tr><td> Insan Rekombinant VEGF-A </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 293-VE-010 </td><td></td></tr><tr><td> 24 kuyucuğu </td><td> Costar </td><td> 3473 </td><td> Ultra-düşük Eklenti </td></tr><tr><td> 60mm Petri Dish Izgara ile </td><td> Nunc </td><td> 169558 </td><td></td></tr></tbody></table>

a quantitative assay for insulin-expressing colony-forming progenitors

Pankreas kök ve progenitör hücre biyolojisi alanında eksikliği, tek bir hücrenin analizi için izin in vitro fonksiyonel ve kantitatif tayinlerde bir engel olmuştur . Su götürmez bir şekilde bireysel progenitörlerin soy potansiyelini göstermek için kesin yollar sağlar, çünkü tek atalarıdır analizi, kritik öneme sahip. Yöntemleri, tek hücre süspansiyon kültüründe &quot;pancreatospheres&quot; oluşturmak için icat edilmiş olmasına rağmen, bazı sınırlamalar mevcuttur. İlk olarak, tek bir hücrenin çok sayıda hücre birikimi, kültür ortamı ve uzay geniş hacimli, dönüş komutları. Gerçekleştirmek için zaman alıcıdır İkincisi, ortaya çıkan pancreatospheres sayılandırma pancreatosphere başlatan atalarıdır sıklığının düşük olduğunu, özellikle emek-yoğun. Üçüncü olarak, pancreatosphere tahlil yeniden, aynı kültürün yayılması ve pankreas atalarıdır farklılaşma hem de izin için etkili bir yöntem değildirtestin yararlılığı stricting. Bu sınırlamaları aşmak için, pankreas atalarıdır için yarı-katı medya tabanlı koloni tahlil geliştirilmiştir ve bu raporda sunulmuştur. Bu yöntem, farklılaşma yaygınlaşması ve ayrıca tabi olarak progenitör hücreleri üç boyutlu uzayda kalmak için izin metilselüloz medya viskozite sağlamak için kullanıldığı hematopoetik koloni tahlil, mevcut bir kavram yararlanır. Zenginleştirmek için insülin ifade eden heterojen bir nüfus atalarıdır koloni oluşturan hücreleri kullanılan ifade neurogenin (NGN) 3, pankreatik endokrin progenitör hücre belirteci. Murin embriyonik kök (ES), gelişmiş yeşil flüoresan protein muhabiri ile etiketlenmiş Ngn3 ifade hücreleri sıralanır ve başına kadar çok 25.000 hücreleri düşük eki, 24-kuyu kültür kaplarına içine kaplama hücre kökenli. Aşağıdaki ana bileşenleri ile yarı-katı medya her yer 500 mcL: tanıştımhylcellulose, Matrigel, nikotinamid, eksendin-4, aktivin βB ve klimalı medya fare ES hücre kökenli pankreas gibi hücreler toplanır. 8 ila 12 gün sonra kültür, insülin ifade özgü morfolojisi kolonileri kuruldu ve her koloninin soy kompozisyonunu belirlemek için kantitatif RT-PCR ve immunoflourescent boyama kullanarak pankreas gen ekspresyonu için daha fazla analiz edilebilirdi. Özetle, koloni test kolay algılama ve hücrelerin heterojen bir nüfus içinde fonksiyonel atalarıdır ölçümü sağlar. Buna ek olarak, yarı-katı medya formatı in vitro proliferasyon ve ayırt atalarıdır sağlayan hücrelere ekstraselüler matriks bileşenleri ve büyüme faktörleri tek tip bir sunum sağlar . Bu koloni tahlil tek hücre düzeyinde pankreas progenitör hücrelerin mekanik çalışmalar için eşsiz fırsatlar sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors at JoVE.com

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

Pankreas gibi atalarıdır insülin ifade koloniler içine ayırt etmek için izin veren üç boyutlu clonogenic tahlil açıklanmıştır. Bu yöntem, metilselüloz, Matrigel ve büyüme faktörleri içeren yarı-katı medya yararlanır, tek atalarıdır çoğalırlar ve ayırt<em&gt; In vitro</em&gt; Sayıda bir nüfus fonksiyonel atalarıdır kantifikasyon izin.

İnsülin ifade Koloni oluşturan atalarıdır için Kantitatif Testi

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

a-quantitative-assay-for-insulin-expressing-colony-forming-progenitors

Research

JoVE Journal

Biology

13.4K Görüntüleme.  California State University Channel Islands. Pankreas gibi atalarıdır insülin ifade koloniler içine ayırt etmek için izin veren üç boyutlu clonogenic tahlil açıklanmıştır. Bu yöntem, metilselüloz, Matrigel ve büyüme faktörleri içeren yarı-katı medya yararlanır, tek atalarıdır çoğalırlar ve ayırt In vitro Sayıda bir nüfus fonksiyonel atalarıdır kantifikasyon izin.

Video: A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Yağ Asidi Kantitatif Phosphoproteomics Uyarılmış Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Biyoloji

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

İzolasyon ve Büyük Ölçekli Genişleme Yetişkin İnsan Endotel Koloni Oluşturan Progenitör Hücreler

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal stem cells, MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs). Both cell types are key players in maintaining the integrity of tissue and are probably also involved in regenerative processes and tumor formation.
To study their biology and function in a comparative manner it is important to have both cells types available from the same donor. It may also be beneficial for regenerative purposes to derive MSCs and ECFCs from the same tissue.
Because cellular therapeutics should eventually find their way from bench to bedside we established a new method to isolate and further expand progenitor cells without the use of animal protein. Pooled human platelet lysate (pHPL) replaced fetal bovine serum in all steps of our protocol to completely avoid contact of the cells to xenogeneic proteins.
This video demonstrates a methodology for the isolation and expansion of progenitor cells from one umbilical cord.
All materials and procedures will be described.

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

This protocol describes the isolation and subsequent expansion of mesenchymal stromal cells and endothelial colony forming cells without the use of animal serum to generate autologous pairs for experimental transplantation purposes.

İnsan Göbek kordonu İzolasyon ve Hayvan Serum Genişleme Mezenkimal stromal hücreler (MKH) ve endotel Koloni Oluşturan Progenitör Hücreler (ECFCs) Türetilmiş

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of red cell formation is regulated by the hormone erythropoietin (Epo), whose synthesis is triggered by tissue hypoxia. A threat to adequate tissue oxygenation results in a rapid increase in Epo, driving an increase in erythropoietic rate, a process known as the erythropoietic stress response. The resulting increase in the number of circulating red cells improves tissue oxygen delivery. An efficient erythropoietic stress response is therefore critical to the survival and recovery from physiological and pathological conditions such as high altitude, anemia, hemorrhage, chemotherapy or stem cell transplantation. 
The mouse is a key model for the study of erythropoiesis and its stress response. Mouse definitive (adult-type) erythropoiesis takes place in the fetal liver between embryonic days 12.5 and 15.5, in the neonatal spleen, and in adult spleen and bone marrow. Classical methods of identifying erythroid progenitors in tissue rely on the ability of these cells to give rise to red cell colonies when plated in Epo-containing semi-solid media. Their erythroid precursor progeny are identified based on morphological criteria. Neither of these classical methods allow access to large numbers of differentiation-stage-specific erythroid cells for molecular study. Here we present a flow-cytometric method of identifying and studying differentiation-stage-specific erythroid progenitors and precursors, directly in the context of freshly isolated mouse tissue. The assay relies on the cell-surface markers CD71, Ter119, and on the flow-cytometric 'forward-scatter' parameter, which is a function of cell size. The CD71/Ter119 assay can be used to study erythroid progenitors during their response to erythropoietic stress in vivo, for example, in anemic mice or mice housed in low oxygen conditions. It may also be used to study erythroid progenitors directly in the tissues of genetically modified adult mice or embryos, in order to assess the specific role of the modified molecular pathway in erythropoiesis.

A flow-cytometric method for identification and molecular analysis of differentiation-stage-specific murine erythroid progenitors and precursors, directly in freshly &#x2013;harvested mouse bone marrow, spleen or fetal liver. The assay relies on cell-surface markers CD71, Ter119, and cell size.

CD71/TER119 Flow-sitometrik Testi kullanarak Fare eritro-id progenitörlerin Tanımlama ve Analiz

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of circulating endothelial progenitor cells (EPCs) were first identified in adult human peripheral blood by Asahara et al. in 1997 2 bringing an infusion of new hypotheses and strategies for vascular regeneration and repair. EPCs are rare but normal components of circulating blood that home to sites of blood vessel formation or vascular remodeling, and facilitate either postnatal vasculogenesis, angiogenesis, or arteriogenesis largely via paracrine stimulation of existing vessel wall derived cells3. No specific marker to identify an EPC has been identified, and at present the state of the field is to understand that numerous cell types including proangiogenic hematopoietic stem and progenitor cells, circulating angiogenic cells, Tie2+ monocytes, myeloid progenitor cells, tumor associated macrophages, and M2 activated macrophages participate in stimulating the angiogenic process in a variety of preclinical animal model systems and in human subjects in numerous disease states4, 5. Endothelial colony forming cells (ECFCs) are rare circulating viable endothelial cells characterized by robust clonal proliferative potential, secondary and tertiary colony forming ability upon replating, and ability to form intrinsic in vivo vessels upon transplantation into immunodeficient mice6-8. While ECFCs have been successfully isolated from the peripheral blood of healthy adult subjects, umbilical cord blood (CB) of healthy newborn infants, and vessel wall of numerous human arterial and venous vessels 6-9, CB possesses the highest frequency of ECFCs7 that display the most robust clonal proliferative potential and form durable and functional blood vessels in vivo8, 10-13. While the derivation of ECFC from adult peripheral blood has been presented14, 15, here we describe the methodologies for the derivation, cloning, expansion, and in vitro as well as in vivo characterization of ECFCs from the human umbilical CB.

Endothelial colony forming cells (ECFCs) are circulating endothelial cells with robust clonal proliferative potential that display intrinsic in vivo vessel forming ability. Phenotypic and functional characterization of outgrowth endothelial cells derived from CB are important to identify and isolate bona fide ECFCs for potential clinical application in repairing damaged tissues.

Endotel Colony Forming Hücrelerinin Fenotipik ve Fonksiyonel Karakterizasyonu İnsan Göbek Kordonu Kanı türetilen

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is a complementary series of experimental and computational methods for estimating microbial culture fitnesses. QFA estimates the effect of genetic mutations, drugs or other applied treatments on microbe growth. Experiments scaling from focussed analysis of single cultures to thousands of parallel cultures can be designed.

Kantitatif Spor Analizi İş Akışı

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

Peptid Epitopların Kantitatif Analiz için bir yüksek veri akışı MHC II Bağlanma Deneyi

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting factors, such as labor intensive sample preparations, low detection limits, slow scan speeds, intensive method optimization for each metabolite, and the inability to measure both positively and negatively charged ions in single experiments. Therefore, a novel metabolomics protocol could advance metabolomics studies. Amide-based hydrophilic chromatography enables polar metabolite analysis without any chemical derivatization. High resolution MS using the Q-Exactive (QE-MS) has improved ion optics, increased scan speeds (256 msec at resolution 70,000), and has the capability of carrying out positive/negative switching. Using a cold methanol extraction strategy, and coupling an amide column with QE-MS enables robust detection of 168 targeted polar metabolites and thousands of additional features simultaneously.&#160; Data processing is carried out with commercially available software in a highly efficient way, and unknown features extracted from the mass spectra can be queried in databases.

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. Utilizing normal-phased liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry with polarity switching and a rapid duty cycle, we describe a protocol to analyze the polar metabolic composition of biological material with high sensitivity, accuracy, and resolution.

Hassas, Büyük Ölçekli Kantitatif metabolomik için bir strateji

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Kantitatif İmmünofloresan Deneyi sentrozomlar Protein Düzeyleri Varyasyon Tedbir

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.

Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.

İç Pozitif Kontrol ile Kantitatif Recombinase Polimeraz Amplifikasyon Testi Geliştirme

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...