Die Autoren bedanken sich bei Dr. Klaus Kaestner für das Geschenk des murinen Ngn3-EGFP embryonale Stammzell-Linie, Mrs. Lucy Brown und die Analytische Cytometry Core-Unterstützung bei der Zellsortierung danken. Diese Arbeit wurde zum Teil durch NIH gewährt R21DK069997 und R01DK081587 verliehen HTK und vom California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Ausbildung Zuschüsse, MW-und LS-finanziert

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	<li>Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Committing+embryonic+stem+cells+to+early+endocrine+pancreas+in+vitro.">Committing embryonic stem cells to early endocrine pancreas in vitro.</a> Stem cells. 22, 1205-1217 (2004).</li><li>Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-expressing+colonies+developed+from+murine+embryonic+stem+cell-derived+progenitors.">Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors.</a> Diabetes. 56, 921-929 (2007).</li><li>Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+in+vitro+differentiation+assay+for+pancreatic-like+cell+development+from+murine+embryonic+stem+cells:+detailed+gene+expression+analysis.">Characterization of an in vitro differentiation assay for pancreatic-like cell development from murine embryonic stem cells: detailed gene expression analysis.</a> Assay. Drug. Dev. Technol. 9, 403-419 (2011).</li><li>Lee, C. S., Perreault, N., Brestelli, J. E., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenin+3+is+essential+for+the+proper+specification+of+gastric+enteroendocrine+cells+and+the+maintenance+of+gastric+epithelial+cell+identity.">Neurogenin 3 is essential for the proper specification of gastric enteroendocrine cells and the maintenance of gastric epithelial cell identity.</a> Genes. 16, 1488-1497 (2002).</li><li>Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+the+pancreatic+lineage:+NGN3++cells+are+islet+progenitors+and+are+distinct+from+duct+progenitors.">Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors.</a> Development. 129, 2447-2457 (2002).</li><li>Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+proliferation+of+hematopoietic+stem+cells.">Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells.</a> Blood. 81, 2844-2853 (1993).</li><li>Gittes, G. K., Galante, P. E., Hanahan, D., Rutter, W. J., Debase, H. 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Biol. 143, 827-836 (1998).</li><li>Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cultivation+of+human+islets+from+expanded+ductal+tissue.">In vitro cultivation of human islets from expanded ductal tissue.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 7999-8004 (2000).</li><li>Gao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+endocrine+progenitor+cells+and+critical+factors+for+their+differentiation+in+human+adult+pancreatic+cell+culture.">Characterization of endocrine progenitor cells and critical factors for their differentiation in human adult pancreatic cell culture.</a> Diabetes. 52, 2007-2015 (2003).</li><li>Gao, R., Ustinov, J., Korsgren, O., Otonkoski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+neogenesis+of+human+islets+reflects+the+plasticity+of+differentiated+human+pancreatic+cells.">In vitro neogenesis of human islets reflects the plasticity of differentiated human pancreatic cells.</a> Diabetologia. 48, 2296-2304 (2005).</li><li>Suarez-Pinzon, W. L., Lakey, J. R., Brand, S. J., Rabinovitch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy+with+epidermal+growth+factor+and+gastrin+induces+neogenesis+of+human+islet+beta-cells+from+pancreatic+duct+cells+and+an+increase+in+functional+beta-cell+mass.">Combination therapy with epidermal growth factor and gastrin induces neogenesis of human islet beta-cells from pancreatic duct cells and an increase in functional beta-cell mass.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 90, 3401-3409 (2005).</li><li>Hao, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-cell+differentiation+from+nonendocrine+epithelial+cells+of+the+adult+human+pancreas.">Beta-cell differentiation from nonendocrine epithelial cells of the adult human pancreas.</a> Nature Medicine. 12, 310-316 (2006).</li><li>Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+pancreatic+progenitor+cells--recent+studies.">Minireview: pancreatic progenitor cells--recent studies.</a> Endocrinology. 149, 4312-4316 (2008).</li><li>Seaberg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+identification+of+multipotent+precursors+from+adult+mouse+pancreas+that+generate+neural+and+pancreatic+lineages.">Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages.</a> Nature Biotechnology. 22, 1115-1124 (2004).</li><li>Rovira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+centroacinar/terminal+ductal+progenitor+cells+in+adult+mouse+pancreas.">Isolation and characterization of centroacinar/terminal ductal progenitor cells in adult mouse pancreas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 75-80 (2010).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Colony Assays, die quantitative und funktionale Bewertung der einzelnen Pankreas-Vorläuferzellen ermöglichen wurden bisher begrenzt, die stark die Fortschritte in den Studien von Pankreas-Stamm-und Vorläuferzellen Zellbiologie behindert. Das Wesen einer Kolonie Assay ist, dass sie die intrinsische Fähigkeit von Vorläuferzellen, anstatt ausschließlich deren Phänotyp Maßnahmen, indem sie die Funktionalität und die Linie Potenziale der Vorläuferzellen zu beachten. Es ist auch ein quantitatives Werkzeug, dass die Zahl der Vorfahren in einer bestimmten Population bestimmen können. In der hämatopoetischen Stammzelltransplantation Bereich haben Kolonie-Assays eine wichtige Rolle bei der Identifizierung spielte, sowie die Entschlüsselung der Wachstumsfaktor Anforderungen, Wechselwirkungen und Mechanismen, die die Linie Engagement dieser Zellen. 6 In dem Gebiet der Pankreas-Vorläuferzellen Zellbiologie, Bauchspeicheldrüsen-Orgel 7 , 8 oder Bulk-Kulturen 9-13 entwickelt worden, aber solche Tests nicht auf biologische questions in der einzelnen Zelle Ebene. Ohne einzelne Zelle analysiert, kann die Existenz von mehreren möglichen Bauchspeicheldrüse Stammzellen / Vorläuferzellen nicht zweifelsfrei nachgewiesen werden. 14 Hier zeigen wir, dass Insulin-exprimierenden koloniebildenden Vorläuferzellen können untersucht unter Verwendung einer dreidimensionalen, Matrigel-haltigen, halbfeste Kultur-System. Obwohl eine Suspensionskultur System 15,16 entwickelt worden ist, die es erlaubt einzelne erwachsene Bauchspeicheldrüse Vorläuferzellen zur Proliferation und Differenzierung in &quot;pancreatospheres&quot; bietet unsere Kolonie Assay weitere Vorteile. Erstens ermöglicht es unseren halbfesten Kulturmedien System Beschichtung von bis zu 25.000 sortierten Zellen pro 500 ul Kulturmedium pro 24-well und gleichzeitig die daraus resultierenden Koloniebildung im linearen Bereich. 2 Im Gegensatz, die Aussetzung pancreatosphere Test die Verwendung einzelner erfordert Zellablagerungsvorrichtung Methode aus der Zell-Sorter, damit einzelne Zelle analysiert, und somit ein größeres Volumen von Kulturmedien und Platz im Inkubatorerforderlich sind. Deshalb ist unsere Kolonie Assay relativ einfach und kostengünstig durchzuführen, wenn eine große Anzahl von verschiedenen Zellen gleichzeitig für Vorläuferzellen Aktivitäten verglichen werden müssen. Zweitens ermöglicht es unseren halbfesten Medien gleichmäßige Verteilung der Komponenten der extrazellulären Matrix und Wachstumsfaktoren, die sowohl die Proliferation und Differenzierung in der gleichen auch auftreten können. Im Gegensatz dazu ist es schwieriger, eine solche Umgebung, vor allem die Matrix, die Zellen in Suspension Kultur. Wir sind uns bewusst, dass wir mit unserer Methode ist es nicht endgültig bewiesen werden, dass jede Kolonie aus einer einzigen Zelle abgeleitet ist, als zwei Vorläufern kann zufällig nahe beieinander und bilden eine Kolonie positioniert werden. Allerdings kann dieses Problem durch die sekundäre Analyse mit einzelnen Zelle Manipulation überwunden werden. Direkte Handlese der sortierten Einzelzellen konnte endgültig zeigen die einzelne Zelle Ursprung jeder Kolonie. Zusammenfassend ist der Insulin-exprimierenden koloniebildenden Aktivität progenitors in halbfesten Medien hierin beschriebenen bietet einzigartige Möglichkeiten für mechanistische Untersuchungen von Pankreas-Vorläuferzellen an der einzelnen Zelle Ebene. Zum Beispiel, in einem früheren Bericht haben wir festgestellt, dass neben der Matrigel, eine krude Mischung aus Proteine ​​der extrazellulären Matrix, in die Kulturmedien für die Bildung des Insulin-exprimierenden Kolonien von Ngn3-EGFP +-Zellen, 2 was auf die extrazelluläre Matrix wird benötigt wichtig für die Vorfahren. Mit dieser Kolonie Assay, wird es nun möglich sein, weitere sezieren und definieren spezifische Matrix Anforderungen für eine solche Tätigkeit. Neben dem Studium Vorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus gewonnen, untersuchen wir derzeit, ob diese in-vitro-Assay-System unterstützt auch die Bildung von anderen charakteristischen Kolonien aus der Bauchspeicheldrüse und der Leber von perinatalen und erwachsenen Mäusen stammen, sowie von menschlichen Leichen Pankreasgewebe ohne von Inselchen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Material / Reagent </td><td> Firma </td><td> Katalog Anzahl </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> 1X DMEM / F-12 (1:1) </td><td> Mediatech </td><td> 15 bis 090-CV </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Calf Serum </td><td> Tissue Culture Biologicals </td><td> 201 </td><td> Siehe Abschnitt 1,1 </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Gibco </td><td> 25030-081 </td><td></td></tr><tr><td> 1X Dulbecco PBS </td><td> Mediatech </td><td> 21 bis 031-CV </td><td></td></tr><tr><td> Bovine Serum Albumin </td><td> Sigma </td><td> A8412 </td><td> 7,5% </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> Becton Dickinson </td><td> 356231 </td><td> Reduziertes Wachstum Faktor </td></tr><tr><td> Methylcellulose </td><td> Sinetsu Chemical, Tokyo, Japan </td><td></td><td> 1.500 centipoise (High-viscosity) </td></tr><tr><td> Nicotinamid </td><td> Sigma </td><td> N0636 </td><td></td></tr><tr><td> Mensch Rekombinante Activin βB </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 659-AB-025 </td><td></td></tr><tr><td> Exendin-4 </td><td> Sigma </td><td> E7144 </td><td></td></tr><tr><td> Mensch Rekombinante VEGF-A </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 293-VE-010 </td><td></td></tr><tr><td> 24-Well-Platten </td><td> Costar </td><td> 3473 </td><td> Ultra-low Befestigung </td></tr><tr><td> 60mm Petrischale mit Grid </td><td> Nunc </td><td> 169558 </td><td></td></tr></tbody></table>

a quantitative assay for insulin-expressing colony-forming progenitors

Das Gebiet der Pankreas-Stamm-und Vorläuferzellen der Zellbiologie hat durch einen Mangel an in vitro funktionale und quantitative Tests, die für die Analyse der einzelnen Zelle ermöglichen behindert. Analysen der einzelnen Vorfahren sind von entscheidender Bedeutung, weil sie definitive Möglichkeiten, eindeutig beweisen die Abstammung Potenzial der einzelnen Vorfahren geben. Obwohl Methoden entwickelt worden, um &quot;pancreatospheres&quot; in Suspensionskultur aus einzelnen Zellen zu generieren, gibt es einige Einschränkungen. Erstens ist es zeitaufwendig, einzelne Zelle Deposition für eine große Zahl von Zellen, was wiederum Befehle große Mengen von Nährmedien und Raum. Durchführen Zweitens, Nummerierung der resultierenden pancreatospheres ist arbeitsintensiv, vor allem, wenn die Frequenz des pancreatosphere-Einleitung Vorfahren niedrig ist. Drittens ist die pancreatosphere Assay keine effiziente Methode, um damit sowohl die Proliferation und Differenzierung von Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse in der gleichen Kultur gut, restricting die Nützlichkeit des Tests. Um diese Einschränkungen zu überwinden, hat eine halbfeste Medien basieren Kolonie Assay für Pankreas-Vorläuferzellen entwickelt worden und wird in diesem Bericht vorgestellt. Diese Methode nutzt eine bestehende Konzept von der hämatopoetischen Kolonie-Assay, in dem Methylcellulose verwendet, um die Viskosität zu den Medien geben wird, so dass die Vorläuferzellen in drei-dimensionalen Raum bleiben, wie sie die Proliferation sowie Differenzierung zu unterziehen. Zur Bereicherung Insulin-exprimierenden koloniebildenden Vorläuferzellen aus einer heterogenen Bevölkerung, verwendeten wir Zellen, die Express Neurogenin (NGN) 3, ein Pankreas endokrine Vorläuferzellen Zell-Marker. Murine embryonale Stammzellen (ES)-Zellen abgeleiteten Ngn3 exprimierenden Zellen mit dem Enhanced Green Fluorescent Protein Reporter getaggt wurden sortiert und bis zu 25.000 Zellen pro Vertiefung ausplattiert in low-Anlage 24-Well-Kulturschalen. Jedes Well enthielt 500 ul von halbfesten Medien mit den folgenden Hauptkomponenten: methylcellulose, Matrigel, Nicotinamid, Exendin-4, Activin βB und konditionierten Medien von murinen ES-Zellen abgeleiteten Pankreas-ähnlichen Zellen gesammelt. Nach 8 bis 12 Tagen Kultur, Insulin-exprimierenden Kolonien mit ausgeprägter Morphologie wurden gebildet und könnte weiter für Pankreas-Genexpression mittels quantitativer RT-PCR und immunoflourescent Färbung der Linie Zusammensetzung der einzelnen Kolonie bestimmen analysiert werden. Zusammenfassend können unsere Kolonie Assay leicht Detektion und Quantifizierung von funktionellen Vorfahren innerhalb einer heterogenen Population von Zellen. Darüber hinaus ermöglicht der halbfesten Medien-Format einheitliche Darstellung der Komponenten der extrazellulären Matrix und Wachstumsfaktoren auf Zellen, so dass Vorläuferzellen zu vermehren und in vitro zu differenzieren. Diese Kolonie Assay bietet einzigartige Möglichkeiten für mechanistische Untersuchungen von Pankreas-Vorläuferzellen an der einzelnen Zelle Ebene.

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A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

Eine dreidimensionale klonogene Test, dass Pankreas-like Vorläuferzellen in Insulin-exprimierenden Kolonien unterscheiden können beschrieben. Diese Methode nutzt die Vorteile von halbfesten Medien mit Methylcellulose, Matrigel und Wachstumsfaktoren, in denen einzelne Vorläuferzellen proliferieren und differenzieren<em&gt; In-vitro-</em&gt;, Erlauben die Quantifizierung der Anzahl der funktionellen Vorfahren in einer Population.

A Quantitative Assay für Insulin-exprimierenden Koloniebildende Vorläufern

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

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Biology

13.4K Aufrufe.  California State University Channel Islands. Eine dreidimensionale klonogene Test, dass Pankreas-like Vorläuferzellen in Insulin-exprimierenden Kolonien unterscheiden können beschrieben. Diese Methode nutzt die Vorteile von halbfesten Medien mit Methylcellulose, Matrigel und Wachstumsfaktoren, in denen einzelne Vorläuferzellen proliferieren und differenzieren In-vitro-, Erlauben die Quantifizierung der Anzahl der funktionellen Vorfahren in einer Population.