Este trabajo fue financiado por los fondos de los Institutos Nacionales de Salud y el Instituto de Investigación Beckman de la Ciudad de la Esperanza. Tenemos que agradecer los revisores para los constructivos comentarios que agregaron claridad manuscrito.

1. HO-estimulado las frecuencias de desplazamiento <ol><li> Inocular 10-20 independientes 1 ml de cultivos de YPGly / Lac medio (1% extracto de levadura, 2% de peptona, 3% de glicerol y 3% de lactato), con colonias aisladas del genotipo deseado. Incubar los cultivos de una noche, o durante el tiempo suficiente para llegar a una densidad celular de aproximadamente 5x10 7 1x10 8 células / ml, a 30 ° C en un rotor, o con una suave agitación. </li><li> Añadir galactosa a las culturas a una concentración final de 2% para inducir HO endonucleasa dirigida DSBs en el his3-Δ3 (cromosoma III) y his3 Δ5-&#39;(cromosoma XV) sustratos translocación. </li><li> Se incuba durante 4 horas a 30 ° C en un rotor, o con una suave agitación. </li><li> Después de 4 h, diluciones placa adecuada de los cultivos en YPD (1% extracto de levadura, 2% de peptona, 2% de glucosa) para producir entre 100 y 200 colonias por placa, y un número suficiente de células en medio carente de histidina para producir un observable Su número de colonias + recombinante. Incubar las placas a 30 ° C durante dos o tres días. </li></ol> NOTA: El paso 1.4 describe la determinación de las frecuencias de desplazamiento bajo condiciones selectivas mediante siembra de los cultivos en medio carecen de histidina. Este ensayo también puede llevarse a cabo bajo condiciones no selectivas mediante siembra de cultivos en YPD, y luego replica-recubrimiento de las colonias que surgen en sus placas, dos o tres días más tarde. Estos métodos producen con frecuencias similares de translocación (Figura 2C). <ol start="5"><li> Determinar la frecuencia de translocaciones dividiendo el número de colonias prototróficas histidina por el número total de células viables en placas (determinado por diluciones en placas de YPD). Determinar la frecuencia de translocaciones mediana y el 95% intervalo de confianza 15. </li></ol> 2. La eficiencia de chapado <ol><li> Quitar una parte alícuota de las células de cada cultivo de una noche, y determinar el número de células por hemocitómetro cuenta (Baxter Healthcare Corporation Catolog #:. B3178-1). </li><li> Placa de 100 a 200 células por medio de una dilución adecuada en YPD. Se incuba durante dos o tres días a 30 ° C (por ejemplo, para una cultura con una densidad celular de 1x10 8 células / ml, se debe placa 100-200 l de una dilución de 5.10 por placa). </li><li> Agregar 20% de galactosa a las culturas a una concentración final de 2%. </li><li> Después de 4 horas, retirar una alícuota de células de cada cultura, determinar el número de células, en número, hemocitómetro, y la placa de 100 a 200 células por medio de una dilución adecuada en YPD. Se incuba durante dos o tres días a 30 ° C. </li><li> Determinar la eficiencia de plaqueo de dividir el número de colonias que aparecen en YPD por el número de células sembradas, y multiplicando este cociente por 100. Determinar el porcentaje de la mediana con un intervalo de confianza del 95%. </li></ol> 3. El análisis genómico por Southern blot <ol><li> Seleccione una sola colonia + Su recombinante de cada ensayo independiente y preparar el ADN genómico 16. </li><li> Compendio de aproximadamente 4 g de ADN con la endonucleasa de restricción BamHI. </li><li> Separados BamHI digerido fragmentos en un 0,7% en gel de agarosa y transferencia a una membrana de nylon con carga positiva (Hybond N +, GE Healthcare Código de producto:. RPN303B) 17. </li><li> Hibridar con un 32 P-etiquetados sonda obtenida mediante cebado aleatorio (Amersham Biosciences Código de producto:. RPN1604) con un 1,8 kb BamHI / BamHI clon genómico que contiene el gen HIS3. </li><li> Visualizar los fragmentos de ADN por autorradiografía o phosphorimaging. </li></ol> 4. Análisis de los cromosomas blot utilizando cromosomas separados en un contorno de los enganches de campo eléctrico homogéneo (CHEF): <ol><li> Preparar los cromosomas de una selección de sus recombinantes + en tapones de agarosa 18: <ul><li> Crecer un cultivo líquido de la válvula de expansión + Su candidato:: III cromosoma recombinante que contiene en 5 ml de YPD a aproximadamente 2.1 x 10 8 células / ml. </li><li> Decantar y lavar las células dos veces con 50 mM EDTA. </li><li> Resuspender las células en unos 200 l de 50 mM EDTA, y caliente a 50 ° C. </li><li> Añadir un volumen igual de líquido al 2% (w / v) de agarosa de baja fusión llevado a 50 ° C, mezclar bien. </li><li> Prescindir de aproximadamente el 80 alícuotas en los moldes tapón y dejar que se enfríe durante 30 minutos a 4 ° C. </li><li> Extrusión enchufes del molde en un plato de 12 pocillos. Hasta cinco tapones se pueden colocar en cada pocillo. </li><li> Añadir 3 ml de solución recién preparada spheroplasting (14 mM 2-β-mercaptoetanol, 20 mM EDTA, 0,5 mg / ml Zymolyase 20T, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 M sorbitol) a cada pocillo. Se incuba a 37 ° C durante 4 horas con agitación suave. </li><li> Retire la solución spheroplasting y reemplazar con 3 ml de solución de LDS (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM EDTA, 1% (w / v) de litio de dodecilsulfato, ajust pH de 8,0). Se incuba a 37 ° C durante 15 min con agitación suave. </li><li> Retire la solución LDS y sustituirla por otra parte alícuota de 3 ml de LDS. Se incuba a 37 ° C durante la noche con agitación suave. </li><li> Quitar LDS y reemplazar con 3 ml de 0,2 X NDS (0,6 g Tris base, 93 g de EDTA disódico dihidrato, 5 g de N-lauroilsarcosina, ajustar el pH a 8.0, llevado a 500 ml con dH 2 O). Incubar a temperatura ambiente durante 30 min con agitación suave. Quitar NDS, y repetir dos veces. </li><li> Quitar NDS y reemplazar con 3 ml de TE. Lavar con agitación suave durante 30 minutos a temperatura ambiente. Repetir 4 veces. </li><li> Tienda de tapones a 4 ° C en 2 ml de TE. Los enchufes pueden mantener hasta por un año. </li></ul></li><li> Los cromosomas se separan en un 1% en gel de agarosa utilizando un Bio-Rad CHEF-DRII aparato a 14 ° C (Catálogo #: 170 a 3612). </li></ol> Parámetros: 1 º Bloque: tiempo de cambiar 70, 15h en 6V/cm. 2 º Bloque: tiempo de cambio de 120, de 11h a 6V/cm <ol start="3"><li> Visualizar los cromosomas por tinción con bromuro de etidio 1μg/ml durante 30 minutos, la irradiación con 60 mJ de la radiación UV en un Stratalinker UV (Stratagene), y de la tinción durante 30 minutos en dH 2 O. La irradiación de bromuro de etidio cromosomas teñidos nicks el ADN para permitir la transferencia eficaz de la membrana. </li><li> La transferencia de cromosomas de una membrana con carga positiva (Hybond N +, GE Healthcare Código de producto:. RPN303B) por la acción capilar en condiciones de desnaturalización (NaOH 0.4N, 1,5 M NaCl). </li><li> Hibridar con un 32 P-etiquetados sonda obtenida mediante cebado aleatorio (Amersham Biosciences Código de producto:. RPN1604) con un clon genómico de 1,8 kb BamHI / BamHI que contiene el gen HIS3 17. </li><li> Visualizar los cromosomas por autorradiografía o phosphorimaging. </li></ol> 5. Los resultados representativos: Una representación gráfica de la prueba de desplazamiento se representa en el nivel de los cromosomas (Figura 1). Un esquema del procedimiento experimental también se muestra (Figura 2). Tanto antes como después de la inducción, la eficiencia de placas se determina dividiendo el número total de células viables de la colonia, formando por el número total de cuerpos celulares en la cultura determinada por hemocitómetro cuenta (Figura 4). Pre-y post-inducción de la eficiencia de la galvanización no fueron significativamente diferentes de células de tipo salvaje (p-valor = 0,1400) (Tabla 1). <img src="/files/ftp_upload/3150/3150table1.jpg" alt="Tabla 1" /> Tabla 1. Pre-y post-inducción de la eficiencia de la siembra en células de tipo salvaje. a El número de cuerpos de células por mililitro se determinan por el número hemocitómetro. b El número de células viables por mililitro se determinó mediante siembra de diluciones adecuadas en un medio no selectivo para producir ~ 100-200 colonias. c El pre-y post-inducción de la eficiencia de placas se determina dividiendo el número total de viables, formadoras de colonias, las células por el número total de cuerpos celulares en la cultura, determinada por el número hemocitómetro. Esto sugiere que la presencia o ausencia de cualquiera de cromosoma por translocación no afecta a la capacidad de sobrevivir a la formación de OSD. La frecuencia de las translocaciones cromosómicas se puede calcular dividiendo el número de colonias prototróficas histidina por el número total de células viables determinado por placas en YPD (Figura 2B). Este ensayo se puede realizar utilizando las cepas de genotipo diferente para identificar cómo la pérdida de función de la proteína afecta a la SSA (es decir, rad51Δ - / -). Determina las frecuencias de recombinación de cepas distintas se pueden graficar para comparar las diferencias en la capacidad de estas cepas para reparar el DSBs endonucleasa HO-inducida por la SSA (Figura 2C). Frecuencias translocación obtenidos con la cepa diploide de tipo salvaje en selectivo (2.2x10 -2) y no selectivos (2.17x10 -2) las condiciones no fueron estadísticamente diferentes entre sí (p-valor = 0,9131), mientras que las frecuencias de desplazamiento obtenido de forma selectiva (6.0x10 -2) y no selectiva (11.9x10 -2) con el rad51Δ - / - homocigotos fueron similares, pero estadísticamente diferente (p-valor = 0,0089). Las frecuencias obtenidas tanto de forma selectiva (p-valor = 0,0001) y no selectiva-(p-valor = 0,0002) con el · rad51 - / - homocigotos fueron estadísticamente diferentes de los obtenidos con las condiciones correspondientes a la cepa de tipo salvaje. Putativo teniendo translocación-clones pueden ser examinadas mediante transferencia genómica del Sur y los análisis cromosómicos blot (Figura 3). Para el análisis de Southern, el ADN genómico es digerido con la endonucleasa BamHI antes de la electroforesis en gel de agarosa, secante y la hibridación de un 32P-etiquetados 1.8kb HIS3 sonda para visualizar el diagnóstico de 0,8 kb his3Δ200, 1,7 kb his3-Δ3 &#39;, 4 kb tiii:: XV, 5 kb TXV:: III, y 8 kb his3-Δ5&#39; fragmentos (Figura 3B.1) . Cromosomas intactos se pueden preparar, separados por CHEF (Figura 3B.2), se transfirieron al nylon y se hibridó con los 32 P-etiquetados 1,8 kb HIS3 sonda para visualizar el 1,1 Mb intacta cromosoma XV, 0,8 Mb TXV: cromosoma III translocación, 0,6 Mb tiii: cromosoma XV translocación, y 0,3 Mb intacto el cromosoma III (Figura 3B.3). Un mapa gráfico que representa espera endonucleasa BamHI digerir fragmentos de ADN genómico, y los padres y los cromosomas recombinantes, se muestra (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Formación de los cromosomas de translocación por un solo capítulo recocido (SSA). 1) DSBs se crean en el his3-Δ3 y his3-Δ5 &#39;sustratos (cromosomas XV y III, respectivamente) por la endonucleasa HO después de la adición de galactosa a los cultivos. 2) DSBs son procesadas para generar 3 &#39;de un solo hilos en los extremos de los cromosomas rotos. 3) anneals SSA maquinaria complementaria 311 o 60 nucleótidos de cadena sencilla HIS3 secuencias formadas en cada uno de los sustratos de recombinación. No homólogas colas formadas en el recocido se eliminan mediante la digestión con endonucleasas. Complementarios cuatro aleros pb en los fragmentos restantes cromosómica formada por la endonucleasa HO-digestión también puede recocido. 4) Ligadura concluye la creación de un gen intacto HIS3 y válvula de expansión:: cromosoma III desplazamiento por la SSA. Células portadoras de este cromosoma puede ser seleccionado por su capacidad para crecer en medio carecen de histidina. La ligadura puede también generar el recíproco tiii:: cromosoma XV translocación de un mecanismo de NHEJ-como. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Ensayo para determinar la frecuencia de la translocación de la SSA. A) Un ml YPGly / Lac culturas son inoculados con colonias aisladas de las células de un genotipo seleccionar y crecido hasta una densidad adecuada de aproximadamente 5x10 7 1x10 8 células / ml. Galactosa se añade a una concentración final de 2% para crear DSBs en los sustratos de recombinación de los cromosomas III y XV. Para llevar a cabo el ensayo bajo condiciones selectivas, las diluciones adecuadas se hará de manera que entre 100 y 200 células se colocan en YPD y un número suficiente de células se colocan en medio carecen de histidina para producir una cantidad observable de sus colonias + recombinante. Para llevar a cabo el ensayo, sin selección, entre 100 y 200 células se colocan en YPD, crecido por dos o tres días a las colonias de una sola y luego réplica chapada en medio carecen de histidina. B) frecuencia de translocaciones se puede determinar al dividir el número de colonias que crecen en sus placas por la fracción que crecen en YPD. C) Las frecuencias de la translocación de las cepas del genotipo diferente (es decir, de tipo salvaje y rad51Δ - / -) puede ser graficada para comparar las diferencias en la capacidad de estas cepas para reparar el DSBs por la SSA. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Determinar la eficiencia de placas. (A) una alícuota de células se ha tomado de la cultura durante la noche antes y después de la inducción del OSD, las diluciones adecuadas se hacen, seguido de un recuento hemocitómetro para determinar el número total de cuerpos de células por ml de la cultura. Diluciones apropiadas se sembraron en un medio no selectivo para determinar el número total de células viables por ml, al contar las colonias que aparecen en YPD. (B) La eficiencia de plaqueo se determina dividiendo el número total de células viables por el número total de cuerpos celulares, y multiplicando este cociente por 100. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. La detección de eventos translocación cromosómica mediante transferencia genómica del Sur y los análisis de cromosomas blot. A) La representación gráfica de los cromosomas pertinentes antes (izquierda) y después de la formación desplazamiento (derecha). Los tamaños de los padres y los cromosomas recombinantes se enumeran en los pares megabase (Mb). Los tamaños de los fragmentos de restricción que contienen secuencias relevantes generados por la digestión BamHI del ADN genómico de los padres y las cepas recombinantes, y puso de manifiesto en transferencias por hibridación con una copia 1,8 kb BamHI HIS3 genómica, se enumeran en pares de kilobases (kb). Los cromosomas no están dibujados a escala. B) Análisis físico de los supuestos teniendo translocación-clones. (1) El análisis genómico por Southern blot - El ADN genómico se recogió y se digirió con la endonucleasa de restricción BamHI, fraccionado por electroforesis en gel, blotted de nylon, y se hibridó con un 32 P-etiquetados 1,8 kb HIS3 sonda para visualizar los siguientes fragmentos: 0,8 kb his3Δ200, 1,7 kb his3-Δ3 &#39;, 4 kb tiii:: XV, 5 kb TXV:: III, y 8 kb his3-Δ5. Carriles: a) diploide padres, b) Su + no recíprocas translocación recombinante, c) Su desplazamiento + recombinantes recíprocas. (2) geles CHEF - cromosomas intactos fueron preparados en los enchufes de agarosa, separados por el chef, teñido con bromuro de etidio y visualizados con luz ultravioleta. Carriles: Igual que el anterior. (3) manchas cromosómicas - los cromosomas separados fueron borrados de nylon y se hibridó con los 32 P-etiquetados 1,8 kb HIS3 sonda para visualizar los cromosomas: 1.1 Mb intacta cromosoma XV, 0,8 Mb TXV: cromosoma III translocación, 0,6 Mb tiii: translocación XV cromosoma, y ​​0,3 Mb intacto el cromosoma III. Carriles: Igual que el anterior.

<ol>
	<li>Sen, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+genomic+deletions+mediated+by+recombination+between+Alu+elements.">Human genomic deletions mediated by recombination between Alu elements.</a> The American Journal of Human Genetics. 79, 41-53 (2006).</li><li>Han, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alu+recombination-mediated+structural+deletions+in+the+chimpanzee+genome.">Alu recombination-mediated structural deletions in the chimpanzee genome.</a> Plos Genetics. 3, 1939-1949 (2007).</li><li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+variation+in+human+health,+disease,+and+evolution.">Copy number variation in human health, disease, and evolution.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 10, 451-481 (2009).</li><li>Goodier, J. L., Kazazian, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrotransposons+revisited:+The+restraint+and+rehabilitation+of+parasites.">Retrotransposons revisited: The restraint and rehabilitation of parasites.</a> Cell. 135, 23-35 (2008).</li><li>Lanktree, M., Hegele, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+variation+in+metabolic+phenotypes.">Copy number variation in metabolic phenotypes.</a> Cytogenet Genome Res. 123, 169-175 (2008).</li><li>Mullighan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+genetic+alterations+in+acute+lymphoblastic+leukaemia.">Genome-wide analysis of genetic alterations in acute lymphoblastic leukaemia.</a> Nature. 446, 758-764 (2007).</li><li>Mattarucchi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microhomologies+and+interspersed+repeat+elements+at+genomic+breakpoints+in+chronic+myeloid+leukemia.">Microhomologies and interspersed repeat elements at genomic breakpoints in chronic myeloid leukemia.</a> Genes Chromosomes Cancer. 47, 625-632 (2008).</li><li>Stenger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biased+distribution+of+inverted+and+direct+Alus+in+the+human+genome:+implications+for+insertion,+exclusion,+and+genome+stability.">Biased distribution of inverted and direct Alus in the human genome: implications for insertion, exclusion, and genome stability.</a> Genome Res. 11, 12-27 (2001).</li><li>Hedges, D., Deininger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inviting+instability:+Transposable+elements,+double-strand+breaks,+and+the+maintenance+of+genome+integrity.">Inviting instability: Transposable elements, double-strand breaks, and the maintenance of genome integrity.</a> Mutat Res. 616, 46-59 (2007).</li><li>Symington, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+RAD52+epistasis+group+genes+in+homologous+recombination+and+double-strand+break+repair.">Role of RAD52 epistasis group genes in homologous recombination and double-strand break repair.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 66, 630-670 (2002).</li><li>Lewis, L., Resnick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tying+up+loose+ends:+nonhomologous+end-joining+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Tying up loose ends: nonhomologous end-joining in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mutat Res. 451, 71-89 (2000).</li><li>Pannunzio, N. R., Manthey, G. M., Bailis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAD59+is+required+for+efficient+repair+of+simultaneous+double-strand+breaks+resulting+in+translocations+in+Saccharomyces+cerevisiae.">RAD59 is required for efficient repair of simultaneous double-strand breaks resulting in translocations in Saccharomyces cerevisiae.</a> DNA Repair (Amst). 7, 788-800 (2008).</li><li>Nicholas, R., Pannunzio, G. M. M., Bailis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAD59+and+RAD1+cooperate+in+translocation+formation+by+single-strand+annealing+in+Saccharomyces+cerevisiae.">RAD59 and RAD1 cooperate in translocation formation by single-strand annealing in Saccharomyces cerevisiae.</a> Curr Genet. 56, 87-100 (2010).</li><li>Manthey, G. M., Bailis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad51+Inhibits+Translocation+Formation+by+Non-Conservative+Homologous+Recombination+in+Saccharyomyces+cerevisiae.">Rad51 Inhibits Translocation Formation by Non-Conservative Homologous Recombination in Saccharyomyces cerevisiae.</a> Plos One. 5, (2010).</li><li>Hoffman, C. S., Winston, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ten-minute+DNA+preparation+from+yeast+efficiently+releases+autonomous+plasmids+for+transformation+of+Escherichia+coli.">A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli.</a> Gene. 57, 267-272 (1987).</li><li>Sambrook, J., MacCallum, P., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2001).</li><li>Iadonato, S. P., Gnirke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RARE-cleavage+analysis+of+YACs.">RARE-cleavage analysis of YACs.</a> Methods Mol. Biol. , 75-85 (1999).</li><li>Argueso, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand+breaks+associated+with+repetitive+DNA+can+reshape+the+genome.">Double-strand breaks associated with repetitive DNA can reshape the genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 11845-11850 (2008).</li><li>Batzer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alu+repeats+and+human+disease.">Alu repeats and human disease.</a> Molecular Genetic Metabolism. 67, 183-193 (1999).</li><li>Fasullo, M., Dave, P., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-damaging+agents+stimulate+the+formation+of+directed+reciprocal+translocations+in+Saccharomyces+cerevisiae.">DNA-damaging agents stimulate the formation of directed reciprocal translocations in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mutat. Res. 314, 121-133 (1994).</li><li>Richardson, C., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+chromosomal+translocations+induced+by+DNA+double-strand+breaks.">Frequent chromosomal translocations induced by DNA double-strand breaks.</a> Nature. 405, 697-700 (2000).</li><li>Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+altered+by+chromosomal+translocations+in+leukemias+and+lymphomas.">Genes altered by chromosomal translocations in leukemias and lymphomas.</a> The Genetic Basis of Human Cancer. , (2002).</li><li>Fasullo, M. T., Davis, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direction+of+chromosome+rearrangements+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+use+of+his3+recombinational+substrates.">Direction of chromosome rearrangements in Saccharomyces cerevisiae by use of his3 recombinational substrates.</a> Mol. Cell. Biol. 8, 4370-4380 (1988).</li><li>Manthey, G. M., Naik, N., Bailis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Msh2+Blocks+an+Alternative+Mechanism+for+Non-Homologous+Tail+Removal+during+Single-Strand+Annealing+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Msh2 Blocks an Alternative Mechanism for Non-Homologous Tail Removal during Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae.</a> PLoS One. 4, e7488-e7488 (2009).</li><li>Muller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-course+of+radiation-induced+chromosomal+aberrations+in+tumor+patients+after+radiotherapy.">Time-course of radiation-induced chromosomal aberrations in tumor patients after radiotherapy.</a> Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 63, 1214-1220 (2005).</li><li>Lin, F. L., Sperle, K., Sternberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+for+homologous+recombination+during+transfer+of+DNA+into+mouse+L+cells:+role+of+DNA+ends+in+the+recombination+process.">Model for homologous recombination during transfer of DNA into mouse L cells: role of DNA ends in the recombination process.</a> Mol. Cell. Biol. 4, 1020-1034 (1984).</li><li>Ivanov, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Requirements+for+the+single-strand+annealing+pathway+of+double-strand+break+repair+in+Saccharyomyces+cerevisiae.">Genetic Requirements for the single-strand annealing pathway of double-strand break repair in Saccharyomyces cerevisiae.</a> Genetics. 142, 693-704 (1996).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Altas dosis de radiación ionizante presente un riesgo inherente de la inestabilidad del genoma a través de la generación de un gran número de DSBs 19. Genomas eucariotas están repletos de secuencias repetitivas que son excelentes sustratos para la generación de translocaciones y reordenamientos genómicos otros 20,21. Translocaciones cromosómicas de recursos humanos se observan con frecuencia cuando DSBs se introducen entre las secuencias repetitivas 12,21,22. Hay pruebas abrumadoras que indican que gran parte de la inestabilidad genómica asociada con leucemias y linfomas se pueden atribuir a translocaciones cromosómicas, destacando la importancia de comprender cómo funciona este mecanismo se produce en las células eucariotas 22,23. Hemos desarrollado un sistema en ciernes levadura para examinar la formación de los cromosomas de translocación por el OSD inducida de recursos humanos entre las regiones cortas de homología en diferentes cromosomas que son similares en tamaño a los elementos repetitivos dispersos a lo largo de la levadura y el genoma humano. En el ensayo, el sustrato his3-Δ3 &quot;translocación se encuentra en una copia del cromosoma XV. El otro his3 alelo (his3-Δ200) tiene una deleción de ~ 1 kb del promotor y la secuencia codificante HIS3 que impide que esta secuencia sea utilizada como una plantilla para la reparación de 24. El sustrato his3-Δ5 &#39;se encuentra en el locus LEU2 en una copia del cromosoma III, con la otra copia del cromosoma III que contiene un alelo alterado LEU2 (Figura 1). A galactosa-inducible endonucleasa HO casete de expresión marcadas con KAN-MX se ha insertado en el locus del cromosoma trp1 IV (trp1:: GAL-HO-KAN-MX). Cada sustrato translocación está flanqueado por una secuencia de reconocimiento de endonucleasa HO-que pueden ser objeto de división mediante la inducción de la expresión del gen HO a través de la adición de galactosa en el medio. Después de HO-endonucleasa división inducida en el his3-Δ3 y his3-Δ5 &#39;sustratos, las células pueden usar eficientemente las vías compartidas por debajo de homología de secuencia HIS3 (311 pb o 60 pb) para reparar los cromosomas rotos de recursos humanos, la generación de un cromosoma por translocación con un alelo intacto HIS3 12-14,25. Debido a que las células madre carecen de una copia intacta del gen HIS3, que son incapaces de crecer en su medio. Sólo las células que han sufrido el evento translocación pueden ser seleccionados para el medio carece de histidina. Por lo tanto, la frecuencia de las translocaciones cromosómicas se puede calcular dividiendo el número de colonias prototróficas histidina por el número total de células viables plateado, determinado por la chapa en YPD. ADN genómico y los cromosomas intactos se pueden aislar de su representante colonias +, y la presencia de un cromosoma por translocación verificada por el sur de genómica y el análisis de cromosomas blot. Un cuidadoso análisis nos ha permitido obtener información adicional importante acerca de la prueba 12. El análisis genómico por Southern blot ha aportado pruebas de que existe el corte casi total de cromosomas XV y III después de 30 minutos de la endonucleasa HO-inducción, y por lo tanto no hay antecedentes importantes de cortar sustratos cromosómicas en la población (G. Manthey y Bailis A., resultados no publicados). Genómica análisis Southern blot y el cromosoma de su - los sobrevivientes indica que las células suelen perder uno, el otro, o ambos cromosomas cortar y seguir siendo viable (L. Liddell y Bailis A., resultados no publicados). Es importante destacar que la eficiencia de placas casi equivalente a un medio no selectivo, antes y después de la inducción de la expresión de HO-endonucleasa indica que ni la falta de reparación de los cromosomas rotos, ni el fracaso de la translocación de los cromosomas para mantener afecta a la capacidad de sobrevivir a la formación de OSD. Consistente con esto, la válvula de expansión: el cromosoma III translocación ha demostrado ser inestable en las células mitóticas en la ausencia de la selección. Esto fue demostrado por la creciente TXV:: III contiene su recombinantes + noche a la mañana no selectiva, placas colonias aisladas en placas no selectivos, y las planchas de réplica en un medio selectivo que carecen de histidina. Diez a 70% de las colonias que surgen de estas placas ha perdido la válvula de expansión:: translocación cromosómica III (N. Pannunzio y Bailis A., resultados no publicados). Translocación cromosomas generados por la exposición de infrarrojos en los seres humanos presentan una inestabilidad similar 26. Esto sugiere que la formación puede contribuir a la translocación de los primeros eventos en la tumorigénesis mediante la promoción de la pérdida de heterocigosidad. En segundo lugar, extensos análisis genéticos y moleculares sugieren que la SSA, un mecanismo eficiente y obligatoriamente no conservadora de recursos humanos, es el principal mecanismo de formación de recursos humanos por translocación después de la creación simultánea de DSBs en dos cromosomas 12,27,28. Esta es la consistent con la conclusión de que grandes dosis de resultado IR en una densidad de DSBs suficiente para crear saltos junto a varias secuencias repetitivas en el genoma de la levadura, y una alta frecuencia de formación de recursos humanos por translocación. En conjunto, estas observaciones sugieren que el efecto oncogénico de la exposición de infrarrojos en los seres humanos pueden, en parte, resultado de la reparación de DSBs por un mecanismo eficiente de los recursos humanos que genera desplazamientos que, a través de su inestabilidad intrínseca, promover los cambios genéticos que la tumorogénesis de lanzamiento. Dado que la radiación se usa a menudo para tratar el cáncer, reordenamientos del genoma que se derivan de la reparación de la radiación inducida DSBs puede contribuir a la generación de cánceres secundarios que aparecen con frecuencia en los pacientes. Así, este modelo nos puede ayudar a obtener una mejor comprensión de las bases genéticas y moleculares de una importante respuesta clínica al tratamiento IR.

quantitation and analysis of the formation of ho-endonuclease stimulated chromosomal translocations by single-strand annealing in saccharomyces cerevisiae

La variación genética es frecuentemente mediado por reordenamientos genómicos que se presentan a través de la interacción entre los dispersos elementos repetitivos presentes en cada genoma eucariótico. Este proceso es un mecanismo importante para la generación de la diversidad entre y dentro de los organismos 1.3. El genoma humano consta de aproximadamente 40% de secuencias repetitivas de origen retrotransposon, incluyendo una variedad de líneas y Sines 4. Eventos de intercambio entre estos elementos repetitivos puede dar lugar a reordenamientos del genoma, incluyendo desplazamientos, que pueden alterar la dosis génica y la expresión que puede resultar en enfermedades autoinmunes y cardiovasculares 5, así como el cáncer en los seres humanos 6-9. Intercambio entre los elementos repetitivos se produce en una variedad de maneras. Intercambio entre las secuencias que comparten perfecta (o casi perfecto) homología se produce mediante un proceso llamado recombinación homóloga (HR). Por el contrario, de extremos no homólogos de unión (NHEJ) utiliza poco o no-homología de secuencia para el intercambio de 10,11. El propósito principal de recursos humanos, en células mitóticas, es la reparación de roturas de doble cadena (DSB) generada endógenamente por la replicación del ADN aberrante y lesiones oxidativas, o por la exposición a las radiaciones ionizantes (RI), y otros agentes que dañan el ADN exógeno. En el ensayo que se describe aquí, DSBs se crean, simultáneamente limítrofes sustratos de recombinación en dos loci diferentes cromosomas en las células diploides por un galactosa-inducible HO-endonucleasa (Figura 1). La reparación de los cromosomas rotos genera translocaciones cromosómicas por solo hilo recocido (SSA), un proceso donde las secuencias homólogas adyacentes a los extremos cromosómicos son unidos covalentemente posterior al recocido. Uno de los sustratos, his3-Δ3 &quot;, contiene un 3 &#39;truncado HIS3 alelo y se encuentra en una copia del cromosoma XV en el lugar natal HIS3. El segundo sustrato, his3-Δ5, se encuentra en el locus LEU2 en una copia del cromosoma III, y contiene un 5 &#39;truncado HIS3 alelo. Ambos soportes están flanqueadas por un sitio de reconocimiento HO endonucleasa que pueden utilizarse para efectuar la incisión por la endonucleasa HO-. HO sitios de reconocimiento de endonucleasa de nativos con el locus MAT, en ambas copias del cromosoma III, se han suprimido en todas las cepas. Esto impide la interacción entre los sustratos de recombinación y otros extremos de los cromosomas rotos de interferir en el ensayo. La KAN-MX-marcada en galactosa inducible endonucleasa HO casete de expresión se inserta en el locus trp1 en el cromosoma IV. Los sustratos comparten 311 pb y 60 pb de la secuencia de codificación HIS3 que puede ser utilizado por la maquinaria de recursos humanos para la reparación de la SSA. Las células que utilizan estos soportes para reparar los cromosomas rotos por HR formar una intacta HIS3 alelo y una válvula de expansión:: translocación cromosómica III que pueden ser seleccionadas por la capacidad de crecer en medio carecen de histidina (Figura 2A). Frecuencia de translocaciones por el AR se calcula dividiendo el número de colonias prototróficas histidina que surgen en el medio selectivo por el número total de células viables que surgen después de placas diluciones adecuadas en un medio no selectivo (Figura 2B). Una variedad de mutantes de reparación del ADN se han utilizado para estudiar el control genético de la formación de desplazamiento por la SSA mediante este sistema 12-14.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae at 

Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae

El ensayo de translocación HO-estimulado monitores de una sola hebra de recocido después de la creación de ADN de doble filamento se rompe en múltiples loci en diploide<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Este mecanismo puede ser modelo de reordenamientos del genoma en las células somáticas de los eucariotas superiores después de la exposición a altas dosis de radiación ionizante.

Cuantificación y análisis de la formación de HO-endonucleasa Estimulado translocaciones cromosómicas por un solo capítulo recocido en Saccharomyces cerevisiae</em

Genetic variation is frequently mediated by genomic rearrangements that arise through interaction between dispersed repetitive elements present in every ...

quantitation-analysis-formation-ho-endonuclease-stimulated

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae

14.6K vistas.  Irell & Manella Graduate School of Biological Sciences. El ensayo de translocación HO-estimulado monitores de una sola hebra de recocido después de la creación de ADN de doble filamento se rompe en múltiples loci en diploide Saccharomyces cerevisiae. Este mecanismo puede ser modelo de reordenamientos del genoma en las células somáticas de los eucariotas superiores después de la exposición a altas dosis de radiación ionizante.

Video: Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

La disección de Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Investigación

Biología

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoproteomics cuantitativo de ácidos grasos estimulada Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

El análisis de microarrays para Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Un ensayo de microscopía de fluorescencia para Mitophagy Vigilancia de la levadura Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Expresión y purificación de la proteína transmembrana de la fibrosis quística regulador de la conductancia en la Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualización y Análisis de las moléculas de ARNm mediante fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Los ensayos acoplados para Monitoreo replegamiento de proteínas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

La purificación de la fibrosis quística regulador de conductancia transmembrana de proteínas expresadas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to identify and quantify the cofactors in their detectable redox state.
The technique is complementary to direct electrochemistry (voltammetry) approaches, as it does not offer information on electron transfer rates, but does establish the identity and redox state of the cofactors in the protein under study. The technique is widely applicable to any protein containing an electron paramagnetic resonance (EPR) detectable cofactor.
A typical titration requires 2 ml protein with a cofactor concentration in the range of 1-100 &#181;M. The protein is titrated with a chemical reductant (sodium dithionite) or oxidant (potassium ferricyanide) in order to poise the sample at a certain potential. A platinum wire and a Ag/AgCl reference electrode are connected to a voltmeter to measure the potential of the protein solution. A set of 13 different redox mediators is used to equilibrate between the redox cofactors of the protein and the electrodes. Samples are drawn at different potentials and the Electron Paramagnetic Resonance spectra, characteristic for the different redox cofactors in the protein, are measured. The plot of the signal intensity versus the sample potential is analyzed using the Nernst equation in order to determine the midpoint potential of the cofactor.

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

EPR supervisado Redox La titulación de los cofactores de<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

La medición de mRNA decadencia Tarifas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Uso<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Cepas

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...