이 작품은 건강과 희망의 도시의 베크 만 연구소의 국립 연구소의 자금에 의해 지원되었다. 우리는 원고에 투명도를 추가들은 건설 덧글에 대한 검토를 감사하고 싶습니다.

1. 호 - 자극 translocation 주파수 <ol><li> 원하는 유전자형의 한 식민지와 YPGly / LAC 매체 (1 % 효모 추출물, 펩톤 2 %, 3 % 글리세롤과 3 % 젖산)의 10-20 독립적인 하나 ML 문화의 예방. ° C 회전, 또는 ​​부드러운 교반 30에서 약 5x10 1x10 7 8 셀 / ML의 세포 밀도에 도달하는 데 충분한 시간을 하룻밤, 또는 문화를 품다. </li><li> his3 - Δ3 &#39;(염색체 III)와 his3 - Δ5&#39;(염색체 XV) translocation 기판에 호 endonuclease - 감독 DSBs를 유도하기 위해 2 %의 최종 농도 문화 갈락토 오스를 ​​추가합니다. </li><li> 30 4 H에 대한 품어 ° C 회전, 또는 부드러운 선동과 함께. </li><li> 네 후 H, YPD에 문화 (1 % 효모 추출물, 2 % 펩톤, 2 %의 덱스 트로 오스)의 플레이트 적절한 dilutions는 관찰할 수를 얻을 수 약 100-200 판 당 식민지, 그리고 세포의 충분한 수의 중간 부족한 히스티딘로를 양보하기 위해 그의 + 재조합 식민지의 개수. 30 접시를 품어 ° C 2-3일하십시오. </li></ol> 참고 : 단계 1.4 중간 부족한 히스티딘에 문화를 도금하여 선택적 조건 하에서 translocation 주파수의 결정에 대해 설명합니다. 이 분석은 또한 2-3일 나중에 접시 - 그의에 발생하는 식민지가 복제 - 도금 후 YPD에 문화를 도금하여 비 선택적 조건에서 실시하고 있습니다. 이러한 방법은 translocation 비슷한 주파수 (그림 2C)을 생산하고 있습니다. <ol start="5"><li> 도금 가능한 세포의 총 개수 (YPD에 도금 dilutions에 의해 결정)에 의해 히스티딘 prototrophic 식민지의 수를 나누어 translocation 주파수를 확인합니다. 중간 translocation 주파수와 95 % 신뢰 구간 15 결정합니다. </li></ol> 2. 도금 효율성 <ol><li> 각 숙박 문화의 세포의 나누어지는를 제거하고, hemacytometer 카운트 (박스터 헬스케어 공사 Catolog #. : B3178 - 1)에서 휴대폰 번호를 확인합니다. </li><li> 플레이트 약 100 YPD에 적절한 희석을 사용하여 200 세포 수 있습니다. 30 두 3 일 동안 품어 ° C (예 : 1x10 8 셀 / ML의 세포 밀도와 문화, 한 판해야 접시 당 10-5 희석의 100-200 μl). </li><li> 2 %의 최종 농도 문화 20 % 갈락토 오스를 추가합니다. </li><li> 4 H 후, 각 문화의 세포의 나누어지는를 제거 hemacytometer 카운트하여 휴대폰 번호를 결정하고, YPD에 적절한 희석을 사용하여 번호판 약 100-200 세포. 30 두 3 일 동안 품어 ° C. </li><li> 도금 세포의 숫자로 YPD에 게재하고, 100이 지수를 곱한 콜로니의 수를 나누어 도금 효율을 확인합니다. 95 % 신뢰 구간으로 평균 비율을 결정합니다. </li></ol> 3. 게놈 남부 얼룩 분석 <ol><li> 각각의 독립적인 재판으로부터 하나의 그의 + 재조합 식민지를 선택하고 게놈 DNA에게 16 준비. </li><li> BamHI 제한 endonuclease와 함께 DNA의 약 4 μg을 소화. </li><li> 별도의 BamHI은 0.7 % 아가로 오스 겔에 조각을 소화하고, 긍정적 - 충전 나일론 막 (Hybond N +, GE 헬스케어 제품 코드. : RPN303B)로 전송 17. </li><li> HIS3 유전자를 포함하는 1.8 킬로바이트 BamHI / BamHI 게놈 클론과 함께 : 임의의 프라이밍 (RPN1604. Amersham Biosciences 제품 코드)에 의해 얻은 32 P - 라벨 프로브와 함께 잡종. </li><li> autoradiography 또는 phosphorimaging로의 DNA 조각을 시각화. </li></ol> 4. 에서 분리된 염색체를 사용하여 염색체 얼룩 분석 윤곽 - 고정되어 균일한 전기장 (요리사) : <ol><li> 아가로 오스 플러그 18 선택된 그의 이상 recombinants에서 염색체 준비 : <ul><li> 그의 + 후보 tXV의 액체 문화를 성장 : III 약 1-2 x를 YPD 5 ML에서 재조합 염색체 함유 10 8 셀 / ML. </li><li> 다운 스핀 50 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 함께 세포에게 2 번 씻는다. </li><li> Resuspend 50 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 약 200 μl의 세포, 그리고 50 따뜻한 ° C. </li><li> 낮은 용융 아가로 오스는 50 ° C, 철저하게 믹스를 가져온이 용융 %의 동일한 부피 (W / V)를 추가합니다. </li><li> 플러그 금형에 약 80 μl aliquots을 분배하고, 그들 4 30 분 시원한 수 있습니다 ° C. </li><li> 압출 성형은 12 잘 요리로 금형에서 플러그. 최대 5 플러그에 각 우물에 삽입할 수 있습니다. </li><li> 각 잘하는 신선한 spheroplasting 솔루션 3 ML (2 - β - 메르 캅 토 에탄올 14 MM 20 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.5 MG / ML Zymolyase 20T, 10 MM 트리스 - HCL, pH를 7.5, 1 M Sorbitol) 추가합니다. ° C 4 시간 동안은 부드러운 교반과 함께 37 알을 품다. </li><li> spheroplasting 솔루션을 제거하고 신분증 솔루션 (3 ML로 교체 10 MM 트리스 - HCL, pH를 8.0, 100 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % (W / V) 리튬 Dodecyl 황산, adjus8.0 t의 산도). 37 ° C 부드러운 교반과 함께 15 분 알을 품다. </li><li> 신분증 솔루션을 제거하고 신분증의 다른 세 ML의 나누어지는로 바꿉니다. 부드러운 교반과 함께 ° C 하루 37 알을 품다. </li><li> 신분증을 제거하고 0.2 X NDS (0.6 g 트리스베이스, 93g 나트륨 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 이수화물, 5g N - Lauroyl Sarcosine, 8.0 산도를 조정, DH 2 O 500 ML로 이동) 3 ML로 바꿉니다. 부드러운 교반 30 분 실온에서 알을 품다. NDS를 제거하고, 2 번 반복합니다. </li><li> NDS를 제거 및 3 ML TE로 바꿉니다. 상온에서 30 분 부드러운 교반과 함께 씻으십시오. 4 번 반복합니다. </li><li> 저장소가 4 플러그 ° C TE 2 ML 인치 플러그는 일년까지 유지할​​ 수 있습니다. </li></ul></li><li> 14에서 바이오 - RAD 요리사 - DRII 장치를 사용하여 1 % 아가로 오스 겔에 별도의 염색체 ° C (카탈로그 # : 170-3612). </li></ol> 매개 변수 : 1 일 블록 : 70 년대 스위치 시간 6V/cm에서 15h. 2 차 차단 : 120s 스위치 시간 6V/cm에서 11h <ol start="3"><li> UV Stratalinker (Stratagene)에 자외선 60 MJ와 irradiating 30 분 1μg/ml ethidium의 브로마이드와 얼룩에 의한 염색체를 시각화하고, DH 2 O를 30 분 드 염색법 멤브레인에 효율적으로 전송할 수 있도록 ethidium의 브로마이드 자국 염색체 닉스에게 DNA를 Irradiating. </li><li> denaturing 조건에서 모세관 작용 (0.4N NaOH, 1.5M NaCl)에 의해 : 긍정 청구 멤브레인 (RPN303B. Hybond N +, GE 헬스케어 제품 코드)로 염색체를 전송합니다. </li><li> HIS3 유전자 17 포함 1.8 킬로바이트 BamHI / BamHI 게놈의 복제와 함께 : 임의의 프라이밍 (RPN1604. Amersham Biosciences 제품 코드)에 의해 얻은 32 P - 라벨 프로브와 함께 잡종. </li><li> autoradiography 또는 phosphorimaging하여 염색체를 시각화. </li></ol> 5. 대표 결과 : translocation 분석의 그래픽 표현은 염색체 수준 (그림 1)에 그려져 있습니다. 실험 절차의 구조도 (그림 2A)이 표시됩니다. 모두 사전 및 사후 유도 도금 효율성은 hemacytometer 카운트 (그림 4B)에 의해 결정 문화에 세포 기관의 총 숫자로 가능한, 콜로니 형성 세포의 총 숫자를 나눔으로써 결정됩니다. 사전 및 사후 유도 도금 효율성은 야생 형 전지 (P - 값 = 0.1400) (표 1) 크게 다르지 않아. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150table1.jpg" alt="표 1" /> 표 1. 사전 및 야생 형 세포에서 포스트 유도 도금 효율성. 밀리리터 당 세포 기관의 숫자는 hemacytometer 개수에 따라 결정됩니다. B 밀리리터 당 가능한 세포의 숫자는 ~ 100-200 식민지를 생산하지 않는 선택적 중간에 적절한 dilutions를 도금에 의해 결정됩니다. C 사전 및 사후 유도 도금 효율성이의 총 숫자를 나눔으로써 결정됩니다 실용적, 식민지가 형성 hemacytometer 개수에 의해 결정 문화에 세포 기관의 총 숫자로 셀. 이것은 하나의 염색체 translocation의 존재 또는 부재가 DSB 형성 살아남을 수있는 능력에 영향을 미치지 않는 것이 좋습니다. 염색체 translocations의 빈도는 YPD에 도금 (그림 2B)에 의해 결정 가능한 세포의 총 숫자로 히스티딘 prototrophic 식민지의 수를 나누어 계산하실 수 있습니다. (- / - 예 rad51Δ)이 분석은 단백질 기능의 손실이 특수 요원 어떤 영향을 주는지 확인하기 위해 서로 다른 유전자형의 변종을 사용하여 진행하실 수 있습니다. 다른 변종 결정 재조합 주파수는 다음 (그림 2C) 특수 요원으로 호 - endonuclease 유도 DSBs을 복구하려면 다음과 종자의 능력의 차이를 비교하는 그래프로 작성할 수 있습니다. translocation 주파수가 선택 얻은 동안 선택에 따라 야생 형 diploid 스트레인 (2.2x10 -2) 및 조건 (2.17x10 -2) 이외의 선택과 함께 얻은 Translocation 주파수는 (P - 값 = 0.9131) 서로 통계적으로 다르지 않아 (6.0x10 -2) 및 비 - 선택 (11.9x10 -2) rad51Δ과 함께 - / - homozygote는 비슷하지만 (P - 값 = 0.0089) 통계 달랐다. / - - 주파수 rad51 °로 선택 모두 (P - 값 = 0.0001) 및 비 - 선택 (P - 값 = 0.0002) 획득 homozygote는 야생 타입 변형으로 해당 조건을 사용하여 얻은 이들의 통계 달랐다. Putative translocation 베어링 클론은 더욱 게놈 남부 얼룩 및 염색체 얼룩 분석 (그림 3)에 의해 검사를하실 수 있습니다. 남부의 분석을 위해, 게놈 DNA는 32 blotting과 하이브 리다이 제이션, 사전 아가로 오스 겔 전기 영동에 BamHI endonuclease의와 소화조각 (그림 3B.1) 1.8kb HIS3 탐사선이 진단 0.8 킬로바이트 his3Δ200, 1.7 킬로바이트 his3 - Δ3 &#39;: : : XV, 5킬로바이트 tXV : III, 그리고 8킬로바이트 his3 - Δ5, 4킬로바이트 때까지&#39;을 시각화하기 위해 P - 라벨 . 그대로 염색체는 요리사 (그림 3B.2)로 구분하여 준비 나일론으로 blotted 및 32 hybridized 수있는 P - 라벨 1.8 킬로바이트 HIS3 탐사선이 1.1 MB 그대로 염색체 XV, 0.8 MB tXV 시각 : III의 translocation의 염색체, 0.6 MB의 얹혀 : XV의 translocation의 염색체, 그리고 0.3 MB 그대로 염색체 III (그림 3B.3). 그래픽지도 BamHI endonuclease - 소화가 게놈 DNA 조각, 그리고 부모와 재조합 염색체를 (그림 3A) 그려져 있습니다 예상 묘사. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 단일 스트랜드로 translocation 염색체의 형성은 (특수 요원) 어닐링. 1) DSBs가 문화 갈락토 오스의 또한 다음과 같은 his3 - Δ3 &#39;와 his3 - Δ5&#39;기판 (각각 염색체 XV 및 III) 호 endonuclease에 의해에서 만들어집니다. 2) DSBs은 깨진 염색체의 끝에 3 &#39;단일 가닥을 생성하는 처리됩니다. 3) 특수 요원 기계 anneals 보완 311 또는 재조합 기판의 각에서 형성된 60 염기 단일 좌초 HIS3 시퀀스. 소둔시 형성이 아닌 동종 꼬리는 endonuclease의 소화에 의해 제거됩니다. HO - endonuclease의 소화에 의해 형성 나머지 염색체 조각을 보완 네 BP의 overhangs도 어닐링 수 있습니다. 특수 요원에 의해 III의 translocation의 염색체 : 4) 결합이 손상 HIS3 유전자와 tXV의 생성을 마칩니다. 이 염색체를 가지고 세포 중간 부족한 히스티딘의 성장 능력에 의해 선택하실 수 있습니다. : NHEJ 같은 메커니즘을 통해 XV의 translocation의 염색체 : 내고 또한 상호 때까지 생성할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 특수 요원으로 translocation의 빈도를 결정하는 분석.) 하나 ML YPGly / LAC 문화가 선택 유전자형의 세포 하나의 식민지로 주사하고 약 5x10 1x10 7 8 셀 / ML의 적절한 밀도로 성장하고 있습니다. 갈락토 오스는 염색체 III와 XV에 재조합 기판에 DSBs을 만드는 2 %의 최종 농도에 추가됩니다. 선택적 조건 하에서 분석을 실시하기 위해 적절한 dilutions는 약 100-200 세포 YPD에 도금하는 등 만들어집니다과 세포의 충분한 숫자는 그의 + 재조합 식민지의 관찰 번호를 양보하기 위해 중간 부족한 히스티딘에 도금입니다. 선택하지 않고 분석을 실시하기 위해 약 100-200 세포는 YPD에 도금 중간 부족한 히스티딘에 도금 하나의 식민지 후 복제에 2 ~ 3 일 동안 성장하고 있습니다. B) Translocation 주파수는 YPD에서 성장 분획하여 - 그의 접시 성장 식민지의 개수를 나눔으로써 결정하실 수 있습니다. C) 다른 유전자형 (예 야생 유형과 rad51Δ의 변종의 translocation 주파수는 - / -) 특수 요원으로 DSBs을 복구하려면 다음과 종자의 능력의 차이를 비교하는 그래프로 작성할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 도금의 효율성을 결정. (A) 세포의 나누어지는가 하룻밤 이전 문화와 이후 DSB 유도에서 가져온 것입니다, 해당 dilutions는 문화의 ML 당 세포 기관의 총 수를 결정하는 hemacytometer 카운트 뒤에, 만들 수 있습니다. 적절한 dilutions는 YPD에 나타나는 식민지를 세어, ML 당 실용적 세포의 총 수를 결정하기 위해 비 선택적 중간에 도금입니다. (B) 도금 효율 후 세포 기관의 총 숫자로 가능한 세포의 총 수를 나누어, 100으로이 지수를 곱하여 결정됩니다. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. 게놈 남부 얼룩 및 염색체 얼룩 분석에 의한 염색체 translocation 이벤트 감지. A) 그래픽 전에 관련 염색체의 표현 (왼쪽)와 (오른쪽) translocation 형성 후. 부모와 재조합 염색체의 크기는 megabase - 쌍 (MB)로 나열됩니다. 부모와 재조합 종자의 게놈 DNA의 BamHI는 소화 과정에 의해 생성된 관련 시퀀스를 포함하는 제한 조각의 크기, 그리고 1.8 킬로바이트 BamHI HIS3 게놈 복제와 이종 교잡에 의해 blots에 대한 공개는 kilobase - 쌍 (KB)로 나열됩니다. 염색체는 규모에 그려되지 않습니다. putative translocation 베어링 클론 B) 물리적 분석. (1) 게놈 남부 얼룩 분석 - 게놈 DNA가 겔 전기 영동, blo에 의해 fractionated, BamHI 제한 endonuclease로 수집하고 소화했습니다나일론 to tted, 다음과 같은 조각 시각화하는 32 P - 라벨 1.8 킬로바이트 HIS3 프로브 hybridized : 0.8 킬로바이트 his3Δ200, 1.7 킬로바이트 his3 - Δ3 &#39;4킬로바이트 때까지 : XV, 5킬로바이트 tXV : III, 그리고 8킬로바이트를 his3 - Δ5. 레인 : 재조합) 부모 diploid, B) 그의 재조합 + 비 상호 translocation, C) 그의 + 상호 translocation. (2) 요리사 젤 - 손상 염색체는 ethidium의 브로마이드 물들일, 요리사로 구분하여, 아가로 오스 플러그의 준비와 자외선 아래에서 시각되었습니다. 레인 : 위에서. (3) 염색체 blots - 분리된 염색체는 나일론으로 blotted 다음과 같은 염색체 시각화하는 32 P - 라벨 1.8 킬로바이트 HIS3 프로브와 hybridized되었습니다 : 1.1 MB 그대로 염색체 XV, 0.8 MB tXV : III의 translocation의 염색체, 0.6 MB 때까지 : XV의 translocation을 염색체, 그리고 0.3 MB 그대로 염색체 III. 레인 : 위에서.

<ol>
	<li>Sen, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+genomic+deletions+mediated+by+recombination+between+Alu+elements.">Human genomic deletions mediated by recombination between Alu elements.</a> The American Journal of Human Genetics. 79, 41-53 (2006).</li><li>Han, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alu+recombination-mediated+structural+deletions+in+the+chimpanzee+genome.">Alu recombination-mediated structural deletions in the chimpanzee genome.</a> Plos Genetics. 3, 1939-1949 (2007).</li><li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+variation+in+human+health,+disease,+and+evolution.">Copy number variation in human health, disease, and evolution.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 10, 451-481 (2009).</li><li>Goodier, J. L., Kazazian, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrotransposons+revisited:+The+restraint+and+rehabilitation+of+parasites.">Retrotransposons revisited: The restraint and rehabilitation of parasites.</a> Cell. 135, 23-35 (2008).</li><li>Lanktree, M., Hegele, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+variation+in+metabolic+phenotypes.">Copy number variation in metabolic phenotypes.</a> Cytogenet Genome Res. 123, 169-175 (2008).</li><li>Mullighan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+genetic+alterations+in+acute+lymphoblastic+leukaemia.">Genome-wide analysis of genetic alterations in acute lymphoblastic leukaemia.</a> Nature. 446, 758-764 (2007).</li><li>Mattarucchi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microhomologies+and+interspersed+repeat+elements+at+genomic+breakpoints+in+chronic+myeloid+leukemia.">Microhomologies and interspersed repeat elements at genomic breakpoints in chronic myeloid leukemia.</a> Genes Chromosomes Cancer. 47, 625-632 (2008).</li><li>Stenger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biased+distribution+of+inverted+and+direct+Alus+in+the+human+genome:+implications+for+insertion,+exclusion,+and+genome+stability.">Biased distribution of inverted and direct Alus in the human genome: implications for insertion, exclusion, and genome stability.</a> Genome Res. 11, 12-27 (2001).</li><li>Hedges, D., Deininger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inviting+instability:+Transposable+elements,+double-strand+breaks,+and+the+maintenance+of+genome+integrity.">Inviting instability: Transposable elements, double-strand breaks, and the maintenance of genome integrity.</a> Mutat Res. 616, 46-59 (2007).</li><li>Symington, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+RAD52+epistasis+group+genes+in+homologous+recombination+and+double-strand+break+repair.">Role of RAD52 epistasis group genes in homologous recombination and double-strand break repair.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 66, 630-670 (2002).</li><li>Lewis, L., Resnick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tying+up+loose+ends:+nonhomologous+end-joining+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Tying up loose ends: nonhomologous end-joining in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mutat Res. 451, 71-89 (2000).</li><li>Pannunzio, N. R., Manthey, G. M., Bailis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAD59+is+required+for+efficient+repair+of+simultaneous+double-strand+breaks+resulting+in+translocations+in+Saccharomyces+cerevisiae.">RAD59 is required for efficient repair of simultaneous double-strand breaks resulting in translocations in Saccharomyces cerevisiae.</a> DNA Repair (Amst). 7, 788-800 (2008).</li><li>Nicholas, R., Pannunzio, G. M. M., Bailis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAD59+and+RAD1+cooperate+in+translocation+formation+by+single-strand+annealing+in+Saccharomyces+cerevisiae.">RAD59 and RAD1 cooperate in translocation formation by single-strand annealing in Saccharomyces cerevisiae.</a> Curr Genet. 56, 87-100 (2010).</li><li>Manthey, G. M., Bailis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad51+Inhibits+Translocation+Formation+by+Non-Conservative+Homologous+Recombination+in+Saccharyomyces+cerevisiae.">Rad51 Inhibits Translocation Formation by Non-Conservative Homologous Recombination in Saccharyomyces cerevisiae.</a> Plos One. 5, (2010).</li><li>Hoffman, C. S., Winston, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ten-minute+DNA+preparation+from+yeast+efficiently+releases+autonomous+plasmids+for+transformation+of+Escherichia+coli.">A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli.</a> Gene. 57, 267-272 (1987).</li><li>Sambrook, J., MacCallum, P., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2001).</li><li>Iadonato, S. P., Gnirke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RARE-cleavage+analysis+of+YACs.">RARE-cleavage analysis of YACs.</a> Methods Mol. Biol. , 75-85 (1999).</li><li>Argueso, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand+breaks+associated+with+repetitive+DNA+can+reshape+the+genome.">Double-strand breaks associated with repetitive DNA can reshape the genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 11845-11850 (2008).</li><li>Batzer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alu+repeats+and+human+disease.">Alu repeats and human disease.</a> Molecular Genetic Metabolism. 67, 183-193 (1999).</li><li>Fasullo, M., Dave, P., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-damaging+agents+stimulate+the+formation+of+directed+reciprocal+translocations+in+Saccharomyces+cerevisiae.">DNA-damaging agents stimulate the formation of directed reciprocal translocations in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mutat. Res. 314, 121-133 (1994).</li><li>Richardson, C., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+chromosomal+translocations+induced+by+DNA+double-strand+breaks.">Frequent chromosomal translocations induced by DNA double-strand breaks.</a> Nature. 405, 697-700 (2000).</li><li>Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+altered+by+chromosomal+translocations+in+leukemias+and+lymphomas.">Genes altered by chromosomal translocations in leukemias and lymphomas.</a> The Genetic Basis of Human Cancer. , (2002).</li><li>Fasullo, M. T., Davis, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direction+of+chromosome+rearrangements+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+use+of+his3+recombinational+substrates.">Direction of chromosome rearrangements in Saccharomyces cerevisiae by use of his3 recombinational substrates.</a> Mol. Cell. Biol. 8, 4370-4380 (1988).</li><li>Manthey, G. M., Naik, N., Bailis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Msh2+Blocks+an+Alternative+Mechanism+for+Non-Homologous+Tail+Removal+during+Single-Strand+Annealing+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Msh2 Blocks an Alternative Mechanism for Non-Homologous Tail Removal during Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae.</a> PLoS One. 4, e7488-e7488 (2009).</li><li>Muller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-course+of+radiation-induced+chromosomal+aberrations+in+tumor+patients+after+radiotherapy.">Time-course of radiation-induced chromosomal aberrations in tumor patients after radiotherapy.</a> Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 63, 1214-1220 (2005).</li><li>Lin, F. L., Sperle, K., Sternberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+for+homologous+recombination+during+transfer+of+DNA+into+mouse+L+cells:+role+of+DNA+ends+in+the+recombination+process.">Model for homologous recombination during transfer of DNA into mouse L cells: role of DNA ends in the recombination process.</a> Mol. Cell. Biol. 4, 1020-1034 (1984).</li><li>Ivanov, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Requirements+for+the+single-strand+annealing+pathway+of+double-strand+break+repair+in+Saccharyomyces+cerevisiae.">Genetic Requirements for the single-strand annealing pathway of double-strand break repair in Saccharyomyces cerevisiae.</a> Genetics. 142, 693-704 (1996).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이온화 방사선의 다량으로 복용는 DSBs 19 다수의 생성을 통해 게놈 불안정성의 고유 위험을 제시한다. 진핵세포 genomes는 translocations 및 기타 게놈의 rearrangements 20,21 생성을 위해 우수한 기판 아르 반복 시퀀스들로 가득 차 있습니다. DSBs가 반복 시퀀스 12,21,22 사이에 도입하는 경우 인사에 의해 염색체 translocations이 자주 관찰됩니다. 압도적인 증거는이 메커니즘 eukaryotes 22,23에서 발생하는 방법 이해의 중요성을 강조, leukemias과 lymphomas 염색체 translocations에 의한 수와 관련된 게놈 불안정성의 정도를 제안합니다. 우리는 누룩과 인간의 genomes에 걸쳐 분산 반복 요소의 크기와 유사한 다른 염색체에있는 상동 부족 지역 간의 DSB 유발 HR로 translocation 염색체의 형성을 조사를 위해 신진 효모의 시스템을 개발했습니다. 분석에서 his3 - Δ3 &#39;translocation 기판은 염색체 XV 중 하나를 복사에 있습니다. 다른 his3 allele (his3 - Δ200)은 수리 24 템플릿으로 사용되는에서이 순서를 방지 HIS3 발기인 및 코딩 순서 ~ 1킬로바이트 삭제되었습니다. his3 - Δ5 &#39;기판 변형 LEU2 allele (그림 1)을 포함하는 염색체 III의 다른 사본, 염색체 III 중 하나를 복사에 LEU2 현장에 있습니다. KAN - MX로 표시 갈락토 - inducible 호 endonuclease 표현 카세트는 염색체 IV (: : GAL 호 - KAN - MX trp1)의 TRP1 현장에 삽입되었다. 각 translocation 기판은 매체 갈락토 오스의 추가를 통해 HO 유전자의 표현을 유도하여 절단을위한 타겟이 될 수있는 호 - endonuclease 인식 시퀀스의 어귀이다. his3 - Δ3 &#39;와 his3 - Δ5&#39;기판에서 HO - endonuclease 유도 절단 후, 세포가 효율적으로 translocation의 염색체를 생성, HR에 의해 깨진 염색체를 복구 HIS3 순서 상동의 공유 짧은 넓이 (311 BP 60 BP)를 사용할 수 있습니다 손상 HIS3 allele 12-14,25와 함께. 부모 세포 HIS3 유전자의 손상 사본이 부족하기 때문에, 그들은 중간 그의 - 어서 성장 수 없습니다. translocation 이벤트를받은 경우에만 세포는 중간 부족한 히스티딘에 대해 선택할 수 있습니다. 따라서 염색체 translocations의 빈도는 YPD에 도금에 의해 결정 도금 가능한 세포의 총 숫자로 히스티딘 prototrophic 식민지의 수를 나누어 계산하실 수 있습니다. 게놈 DNA와 염색체 손상은 다음 대표 그의 +의 식민지, 그리고 게놈 남부와 염색체 얼룩 분석에 의해 확인 translocation의 염색체의 존재로부터 격리 수 있습니다. 조심 분석 분석 12에 대한 추가 중요한 정보를 수집하는 우리를 허용하고 있습니다. 게놈 남부 얼룩 분석 호 - endonuclease 유도 30 분 후에 염색체 XV 및 III 거의 완벽하게 커팅이있다는 것을 증거를 제공하고 있으며, 따라서 포경 염색체 기판에 대한 중요한 배경은 (G. Manthey &amp; A Bailis, 인구 없습니다 게시되지 않은 결과). 그의 게놈 남부와 염색체 얼룩 분석 - 생존자는 세포가 자주 하나 다른, 또는 둘 모두를 자른 염색체를 잃게하고 (L. Liddell &amp; A Bailis, 발표되지 않은 결과) 가능한 남아있는 것을 나타냅니다. 중요한 것은 아닌 선택적 매체에 거의 동등한 도금 효율성은 HO - endonuclease 표현의 유도 이전과 이후 translocation 염색체를 유지하기 위해 깨진 염색체를 복구에 실패하거나 실패도가 DSB 형성 살아남을 수있는 능력에 영향을 미치는 것을 나타냅니다. 이걸로 일관 tXV : III의 translocation의 염색체가 선택의 부재에서 mitotic 세포의 불안정으로 표시되었습니다. 이것은 tXV 성장에 의해 입증되었습니다 : III가 아닌 선택 밤새 그의 이상 recombinants를 포함하지 않는 선택적 접시에 하나의 식민지를 도금하고, 히스티딘이 부족해 중간에 선택적 복제 도금. : III의 translocation의 염색체 (북아 일 Pannunzio &amp; A Bailis, 발표되지 않은 결과를) 다음 접시에 발생하는 식민지의 열 70 %가 tXV을 잃었습니다. 인간 IR 노출에 의해 생성된 Translocation 염색체는 비슷한 불안정 26 나타냅니다. 이것은 translocation 형성이 heterozygosity의 손실을 홍보하여​​ tumorigenesis 초기에 이벤트에 참여할 수 있습니다 제안합니다. 둘째, 광범위한 유전자와 분자 분석은 특수 요원, HR의 비 보수 obligatorily 효율적이고 메커니즘, 두 염색체 12,27,28에 DSBs의 동시 생성에 따라 HR하여 translocation 형성의 기본 메커니즘이다하는 것이 좋습니다. 이것은 공동입니다찾는 nsistent되는 HR하여 효모의 게놈에서 여러 반복적인 시퀀스에 인접한 휴식을 만들 수있는 충분한 DSBs의 밀도, 그리고 translocation 형성의 고주파로 IR 결과의 과다. 함께, 이러한 관측 것이 좋습니다 종양 인간 IR 노출 효과 수, 부분적으로 그들의 고유 불안정을 통해, 그 출시 tumorigenesis 유전자 변화를 추진, translocations를 생성하는 HR의 효율적인 메커니즘에 의해 DSBs의 수리로 인한. 방사는 종종 방사선 유발 DSBs 수리의 결과가 환자의 자주 발생하는 이차 암의 발생에 기여할 수있는 암, 게놈 rearrangements을 치료하는 데 사용되기 때문입니다. 따라서,이 모델은 우리가 IR 치료에 중요한 임상 응답의 유전 및 분자 기초에 대한 이해를 얻을 도움이 될 수 있습니다.

quantitation and analysis of the formation of ho-endonuclease stimulated chromosomal translocations by single-strand annealing in saccharomyces cerevisiae

유전자 변이가 자주 모든 진핵세포 게놈에 존재 반복 요소를 분산 간의 상호 작용을 통해 발생하는 게놈 rearrangements에 의해 중재됩니다. 이 과정은 1-3 사이의 유기체 내의 다양성을 생성하는 중요한 메커니즘입니다. 인간 게놈은 라인과 SINEs 4 다양한 포함한 retrotransposon의 원산지의 약 40% 반복 순서로 이루어져 있습니다. 이러한 반복적인 요소 간의 교류 이벤트는 유전자 투약과 인간 6-9에서 면역, 심장 혈관 질병 5,뿐만 아니라 암이 발생할 수 표현을 중단 할 수 translocations를 포함한 게놈 rearrangements, 발생할 수 있습니다. 반복 요소 간의 교류 다양한 방법으로 발생합니다. 완벽한 (또는 가까운 완벽한) 상동를 공유 시퀀스 사이의 교류 과정 상동 재조합이라고 (HR)에 의해 발생합니다. 반대로, 이외의 동종 끝 (NHEJ) 가입이 교환 10,11 거의 또는 전혀 순서 상동를 사용하지 않습니다. HR의 주요 목적은, mitotic 세포에서 더블 스트랜드 탈선 DNA 복제와 산화 병변에 의해 endogenously 생성 휴식 (DSBs) 또는 이온화 방사선 (IR​​) 및 기타 외인성 DNA 손상 에이전트에 노출로를 복구하는 것입니다. 분석이 여기에 설명된에서 DSBs 동시에 갈락토 - inducible 호 - endonuclease (그림 1)에 의해 diploid 세포에 두 개의 서로 다른 염색체 loci에서 재조합 기판을 경계 만들어집니다. 깨진 염색체의 복구 (특수 요원) 어닐링 단일 가닥에 의해 염색체 translocations를 생성, 동종 염색체 종료에 인접한 시퀀스 과정은 covalently 어닐링에 후속 참가하고 있습니다. 기판 중 하나, his3 - Δ3는 HIS3 allele를 잘린 &#39;3 포함&#39;하고 기본 HIS3의 현장에서 염색체 XV 중 하나를 복사에 있습니다. 두 번째 기판, his3 - Δ5 &#39;는, 염색체 III 중 하나를 복사에 LEU2 현장에 위치하고 있으며, 5 들어 있습니다&#39;HIS3 allele을 잘립니다합니다. 두 기판은 HO - endonuclease에 의해 절개를 대상으로 할 수있는 매춘부 endonuclease 인식 사이트 둘러싸인 있습니다. 매트 현장에 기본 호 endonuclease 인식 사이트는, 염색체 III의 두 복사본에 대한 모든 변종에 삭제되었습니다. 이것은 재조합 기판과 분석의 간섭에서 다른 깨진 염색체 끝이 간의 상호 작용을 방지할 수 있습니다. KAN - MX - 갈락토 오스 표시 - inducible 호 endonuclease 표현 카세트가 염색체 IV에 TRP1 현장에 삽입됩니다. 기판 주 311 BP이나 특수 요원으로 복구에 대한 HR 기계에서 사용할 수있는 HIS3 코딩 순서의 60 BP. HR로 깨진 염색체를 복구하는 이러한 기판을 사용하여 세포가 손상 HIS3 allele과 tXV를 형성 : 중간 부족한 히스티딘 (그림 2A)에서 성장하는 능력에 의해 선택하실 수 있습니다 III 염색체 translocation합니다. HR로 Translocation 주파수가 아닌 선택적 매체 (그림 2B)에 해당 dilutions을 도금 후 발생 가능한 세포의 총 숫자로 선발 매체에 발생 히스티딘 prototrophic 식민지의 수를 나누어 계산됩니다. DNA의 복구 돌연변이 다양한이 시스템은 12-14을 사용하여 특수 요원 translocation 형성의 유전자 조절을 연구하는 데 사용되었습니다.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae at 

Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae

HO - 자극 translocation 분석은 단일 가닥 diploid에서 여러 loci에서 DNA 이중 가닥 나누기의 창조 다음 풀림 모니터<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. 이 메커니즘은 이온화 방사선의 다량으로 복용에 노출 다음 높은 eukaryotes의 체세포의 게놈 rearrangements을 모델 수 있습니다.

HO - Endonuclease의 형성의 Quantitation과 분석에서 어닐링 단일 스트랜드에 의해 염색체 Translocations을 자극 Saccharomyces cerevisiae</em

Genetic variation is frequently mediated by genomic rearrangements that arise through interaction between dispersed repetitive elements present in every ...

quantitation-analysis-formation-ho-endonuclease-stimulated

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae

14.6K 조회수.  Irell & Manella Graduate School of Biological Sciences. HO - 자극 translocation 분석은 단일 가닥 diploid에서 여러 loci에서 DNA 이중 가닥 나누기의 창조 다음 풀림 모니터 Saccharomyces cerevisiae. 이 메커니즘은 이온화 방사선의 다량으로 복용에 노출 다음 높은 eukaryotes의 체세포의 게놈 rearrangements을 모델 수 있습니다.

비디오: Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

의 해부 Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

연구

생물학

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

지방산의 정량 Phosphoproteomics은 자극 Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

조직 샘플에서 γH2AX Foci의 Quantitation

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray 분석을위한 Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

효모에서 모니터링 Mitophagy을위한 형광 현미경 분석 Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

의 낭성 섬유증의 Transmembrane의 전도성 조절 단백질의 표현과 정제 Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

의 모니터링 단백질 접힘에 대한 결합 분석 실험<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

로 표현 낭포 성 섬유증 막 횡단 전도력 규칙 단백질의 정제<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비시 애</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to identify and quantify the cofactors in their detectable redox state.
The technique is complementary to direct electrochemistry (voltammetry) approaches, as it does not offer information on electron transfer rates, but does establish the identity and redox state of the cofactors in the protein under study. The technique is widely applicable to any protein containing an electron paramagnetic resonance (EPR) detectable cofactor.
A typical titration requires 2 ml protein with a cofactor concentration in the range of 1-100 &#181;M. The protein is titrated with a chemical reductant (sodium dithionite) or oxidant (potassium ferricyanide) in order to poise the sample at a certain potential. A platinum wire and a Ag/AgCl reference electrode are connected to a voltmeter to measure the potential of the protein solution. A set of 13 different redox mediators is used to equilibrate between the redox cofactors of the protein and the electrodes. Samples are drawn at different potentials and the Electron Paramagnetic Resonance spectra, characteristic for the different redox cofactors in the protein, are measured. The plot of the signal intensity versus the sample potential is analyzed using the Nernst equation in order to determine the midpoint potential of the cofactor.

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

EPR은의 보조 인자 (cofactor)의 산화 환원 적정​​을 모니터링<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...