Bu çalışma, Sağlık ve City of Hope Beckman Araştırma Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri fonları tarafından desteklenmiştir. Değerlendirenler yazının netlik eklendi yapıcı yorumlar için teşekkür etmek istiyorum.

1. HO-uyarılmış translokasyon frekansları <ol><li> Istenilen genotip tek koloniler YPGly / Lac orta (% 1 maya özü,% 2 pepton,% 3 gliserol ve% 3 laktat) 10-20 bağımsız 1 ml kültürleri inoküle edin. 30 ° C rotator, ya da yavaşça sallanarak, yaklaşık 5x10 7-1x10 8 hücre / ml bir hücre yoğunluğu ulaşmak için yeterli bir süre için, bir gecede veya kültürler inkübe edin . </li><li> His3 Δ3 &#39;(kromozom III) ve his3 Δ5&#39; (kromozom XV) translokasyon substratlar HO endonükleaz-yönettiği DSBs ikna etmek için son konsantrasyonu% 2 kültürlere galaktoz ekle. </li><li> 4 saat boyunca inkübe 30 ° C rotator veya yavaşça sallanarak. </li><li> 4 saat sonra, uygun dilüsyonları YPD üzerine kültürleri (% 1 maya özü,% 2 pepton, 2% dekstroz) plaka gözlemlenebilir verim yaklaşık 100 ila 200 plaka başına koloniler ve hücrelerin yeterli sayıda orta eksik histidin üzerine verim Onun + rekombinant kolonilerin sayısı. 30 plaka inkübe ° C&#39;de 2-3 gün. </li></ol> NOT: Adım 1.4 orta eksik histidin üzerine kültürler kaplama translokasyon frekanslarının belirlenmesi seçici koşullar altında açıklanmıştır. Bu testte de 2-3 gün sonra tabak-Onun üzerine ortaya çıkan koloniler sonra çoğaltma kaplama kaplama kültürleri üzerine YPD seçici olmayan koşullar altında yapılan ve olabilir. Bu yöntemler translokasyon benzer frekansları (Şekil 2C) üretir. <ol start="5"><li> Kaplama canlı hücrelerinin toplam sayısı (YPD kaplama dilüsyonları tarafından belirlenir) histidin prototrophic kolonilerin sayısı bölerek translokasyon sıklığını belirlemek. Medyan translokasyon sıklığı ve% 95 güven aralığı 15 belirleyin. </li></ol> 2. Kaplama verimliliği <ol><li> Her gecede kültür hücreleri bir kısım çıkarın ve hemasitometre sayımı (Baxter Healthcare Corporation Katalog #: B3178-1) hücre sayısını belirlemek. </li><li> Plaka yaklaşık 100 200 hücre YPD üzerine uygun bir seyreltme kullanarak. 2-3 gün boyunca 30 ° C&#39;de (örneğin, bir hücre yoğunluğu 1x10 8 hücre / ml ile bir kültür, bir plaka, plaka başına 10-5 seyreltme ul 100-200) . </li><li> ,% 2 final konsantrasyon kültürleri ila% 20 galaktoz ekleyin. </li><li> 4 saat sonra, her kültürden bir kısım hücreler kaldırmak hemasitometre sayısına göre hücre sayısını belirlemek ve YPD üzerine uygun bir seyreltme plaka yaklaşık 100 ila 200 hücre. 2-3 gün süreyle inkübe 30 ° C. </li><li> YPD kaplama hücrelerinin sayısına göre görünen ve 100 ile bu katsayı ile çarpımı kolonilerin sayısı bölerek kaplama etkinliğini belirlemek. % 95 güven aralığı ile medyan yüzdesi belirleyin. </li></ol> 3. Genomik Southern blot analizi <ol><li> Her bir bağımsız deneme bir tek Onun + rekombinant koloni seçin ve genomik DNA 16 hazırlamak. </li><li> BamHI kısıtlama endonükleaz ile DNA yaklaşık 4 mg Digest. </li><li> Ayrı BamHI% 0.7 agaroz jel üzerinde parçaları sindirilir ve pozitif yüklü bir naylon membran (Hybond N +, GE Healthcare Ürün Kodu: RPN303B) transfer 17 . </li><li> HIS3 gen içeren 1.8 kb BamHI / BamHI genomik klon: random priming (RPN1604 Amersham Biosciences Ürün Kodu) tarafından elde edilen 32 P-işaretli prob ile melezleşme. </li><li> Otoradyografi veya phosphorimaging DNA parçaları gözünüzde canlandırın. </li></ol> 4. Kromozom blot analizi ayrılmış kromozom kullanılarak bir kontur kenetli homojen elektrik alan (CHEF): <ol><li> Agaroz fişler 18 seçilen Onun + rekombinantlar kromozom hazırlayın: <ul><li> + Aday tXV bir sıvı kültür büyütün: III yaklaşık 1-2 x YPD 5 ml rekombinant kromozom içeren 10 8 hücre / ml. </li><li> Spin ve hücreler 50 mM EDTA ile 2 kez yıkayın. </li><li> Süspanse edin hücreleri ve 50 mM EDTA yaklaşık 200 ul ° C - 50 sıcak </li><li> Düşük erime agaroz 50 ° C, iyice karıştırın getirdi% 2 erimiş eşit hacmi (w / v) ekleyin. </li><li> Fiş kalıplar içine yaklaşık 80 ul alikotları koyun ve onlara 4 30 dakika soğumasını bekleyin ° C. </li><li> Extrude 12-iyi bir çanak içine kalıp takılır. En fazla beş fişler her bir kuyunun içine yerleştirilebilir. </li><li> Her iyi 3 ml taze hazırlanmış spheroplasting çözüm (2 β-mercaptoethanol 14 mM, 20 mM EDTA, 0.5 mg / ml Zymolyase 20T, 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 M Sorbitol) ekleyin. Yavaşça sallanarak ile 37 ° C&#39;de 4 saat inkübe edin. </li><li> Spheroplasting çözüm çıkarın ve LDS çözümü (3 ml yerine 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM EDTA,% 1 (w / v) Lityum Dodesil Sülfat, adjus8.0 t pH). 37 ° C&#39;de 15 dakika yavaşça sallanarak inkübe. </li><li> LDS çözüm çıkarın ve 3 ml LDS başka bir kısım ile değiştirin. Yavaşça sallanarak ° C gecede 37 inkübe edin. </li><li> LDS çıkarın ve 0,2 X NDS (0.6 g Tris Baz, 93 g disodyum EDTA Dihidrat, 5 g N-Lauroyl sarkozin, 8.0 pH ayarı dH 2 O ile 500 ml) 3 ml ile değiştirin. Yavaşça sallanarak 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. NDS çıkarın ve 2 kez tekrarlayın. </li><li> NDS çıkarın ve 3 ml TE ile değiştirin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yavaşça sallanarak ile yıkayınız. 4 kez tekrarlayın. </li><li> Mağaza 4 fişler ° C TE 2 ml. Fiş bir yıl kadar tutabilirsiniz. </li></ul></li><li> 14 yaşında bir Bio-Rad CHEF-DRII aparatı kullanarak% 1 agaroz jel üzerinde ayrı kromozom ° C (Katalog no: 170-3612). </li></ol> Parametreler: 1. Blok: 70s geçiş süresi 6V/cm az 15 saat. 2. Blok: 120s geçiş süresi, 6V/cm az 11h <ol start="3"><li> 30 dakika 1μg/ml etidyum bromür ile boyanarak UV Stratalinker (Stratagene) UV 60 mJ ile aydınlatarak, kromozom görselleştirmek, ve 30 dakika dH 2 O için de boyama Membran verimli transferi için izin etidyum bromür boyanmış kromozom nickler DNA aydınlatarak. </li><li> Denatüre koşulları kılcal eylem (0.4N NaOH, 1,5 M NaCl) pozitif yüklü bir membran (RPN303B. Hybond N +, GE Healthcare Ürün Kodu) kromozom aktarın. </li><li> HIS3 gen 17 içeren bir 1.8 kb BamHI / BamHI genomik klon: random priming (RPN1604 Amersham Biosciences Ürün Kodu) tarafından elde edilen 32 P-işaretli prob ile melezleşme. </li><li> Otoradyografi veya phosphorimaging kromozom gözünüzde canlandırın. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Translokasyon testinin grafiksel gösterimi kromozom (Şekil 1) tasvir edilmiştir. Deneysel işlemin şematik (Şekil 2A) görüntülenir. Her iki indüksiyon öncesi ve sonrası kaplama verimliliği yaşayabilir, koloni oluşturan hücrelerin hücre gövdeleri kültür hemasitometre sayımı (Şekil 4B) tarafından belirlenen toplam sayısı toplam sayısına bölünmesiyle belirlenir. Indüksiyon öncesi ve sonrası kaplama verimliliği yabani tip hücrelerin (p-değeri = 0,1400) (Tablo 1) anlamlı derecede farklı değildi. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150table1.jpg" alt="Tablo 1" /> Tablo 1. Ön ve yabani tip hücrelerin sonrası indüksiyon kaplama verimliliği. hemasitometre sayısı mililitrede hücre gövdeleri bir numara tarafından belirlenir. b sayısı mililitrede canlı hücreler non-selektif ortam üzerine uygun seyreltiler kaplama ~ 100-200 koloniler tarafından belirlenir. c pre-ve post-indüksiyon kaplama verimleri toplam sayısına bölünmesiyle belirlenir yaşayabilir, koloni oluşturan, hemasitometre sayısı tarafından belirlenen hücre kültür kuruluşları, toplam sayısına göre hücreler. Bu yeteneği DSB oluşumu hayatta kalmak için her iki translokasyon kromozom varlığı ya da yokluğu etkilemez göstermektedir. Kromozomal translokasyonların frekans YPD üzerine kaplama (Şekil 2B) tarafından belirlenen toplam sayısına göre canlı hücreler histidin prototrophic kolonilerin sayısına bölünmesiyle hesaplanır. (- / - Yani rad51Δ) Bu testte protein fonksiyon kaybı SSA nasıl etkilediğini belirlemek için farklı genotip suşu kullanılarak yapılan olabilir. Farklı türlerin tespit Rekombinasyon frekansları sonra SSA (Şekil 2C) ve HO-endonükleaz indüklenen DSBs onarmak için bu suşların yeteneği farklılıkları karşılaştırmak için grafikle gösterilebilir. Translokasyon frekansları seçici seçici altında yabani tip diploid suşu (2.2x10 -2) ve koşulları (2.17x10 -2), non-selektif ile elde Translokasyon frekansları elde ederken, birbirlerinin (p-değeri = 0,9131) istatistiksel olarak farklı değildi (6.0x10 -2) ve non-seçici (11.9x10 -2) rad51Δ - / - homozigot benzer ancak istatistiksel olarak anlamlı fark vardı (p-değeri = 0,0089). / - Rad51 ° ile frekansları seçici hem de (p-değeri = 0.0001) ve seçici olmayan (p-değeri = 0.0002) elde edilen homozigot yabani tip suşu ile ilgili koşullar kullanılarak elde edilen istatistiksel olarak farklı idi. Olası translokasyon taşıyan klonların daha genomik Southern blot ve kromozomal leke analizleri (Şekil 3) tarafından incelenebilir. Güney analizi için, genomik DNA, agaroz jel elektroforezi önce BamHI endonükleaz ile 32 blot ve hibridizasyon sindirilirParçaları (Şekil 3B.1) 1.8kb HIS3 prob tanı 0,8 kb his3Δ200, 1,7 kb his3-Δ3 &#39;:: XV, 5 kb tXV: III, 8 kb his3-Δ5, 4 kb tIII görselleştirmek için P-etiketli . P-CHEF (Şekil 3B.2) ile ayrılmış, sağlam kromozomlar hazırlanan naylon için, lekelenen ve 32 melezleşmiştir olabilir etiketli 1,8 kb HIS3 prob görselleştirmek için 1.1 Mb sağlam kromozom XV, 0.8 Mb tXV: III translokasyon kromozom, 0.6 Mb tIII: XV translokasyon kromozom ve 0.3 Mb sağlam kromozom III (Şekil 3B.3). Bir grafik harita BamHI endonükleaz sindirilir genomik DNA parçaları, ve ebeveyn ve rekombinant kromozomlar, (Şekil 3A) tasvir edilmiştir bekleniyor tasvir. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Tek iplikli translokasyon kromozom Oluşumu (SSA) tavlama 1) DSBs kültürlere galaktoz Ayrıca aşağıdaki his3 Δ3 ve his3-Δ5 &#39;yüzeyler (sırasıyla kromozom XV ve III) HO endonükleaz tarafından oluşturulur. 2) DSBs kırık kromozomların ucunda 3 &#39;tek-ipliklerini oluşturmak için işlenir. 3) SSA makine tavlarıdır 311 tamamlayıcı veya rekombinasyon yüzeylerin her birinde oluşan 60 nükleotid tek telli HIS3 dizileri. Endonükleaz sindirim tavlama üzerine oluşmuş homolog olmayan kuyrukları tarafından kaldırılır. HO-endonükleaz sindirim oluşturduğu kalan kromozom parçaları üzerinde Tamamlayıcı dört bp çıkıntılar da tavlama. SSA tarafından III translokasyon kromozom: 4) ligasyon sağlam bir HIS3 gen ve tXV oluşturulması sonucuna varmıştır. Bu kromozom taşıyan hücreler orta eksik histidin büyümeye yeteneklerine göre seçilebilir. NHEJ-benzeri bir mekanizma ile XV translokasyon kromozom: ligasyonu da karşılıklı tIII oluşturabilir. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. SSA tarafından translokasyon sıklığı belirlemek için Testi A) Bir ml YPGly / Lac kültürlerin seçkin bir genotip hücreleri tek koloniler ile aşılanmış ve yaklaşık 5x10 7-1x10 8 hücre / ml uygun bir yoğunluk büyüdü. Galaktoz, kromozomları III ve XV rekombinasyon substratlar DSBs oluşturmak için son konsantrasyonu% 2 eklenir. Seçici koşullar altında tahlil yapmak, uygun dilüsyonları yaklaşık 100 ila 200 hücre YPD üzerine kaplama olduğu gibi yapılır ve yeterli sayıda hücre Onun + rekombinant koloniler gözlemlenebilir bir verim orta eksik histidin üzerine kaplanmıştır. Seçim olmadan tahlil yapmak, yaklaşık 100 ila 200 hücre YPD üzerine kaplamalı orta yoksun histidin üzerine kaplama tek koloniler ve sonra çoğaltma 2-3 gün için yetiştirilir. B) Translokasyon frekans YPD yetişen fraksiyonu Onun plakalar büyüyecek kolonilerin sayısına bölünmesiyle belirlenir. C) farklı genotip (yani Wild-tip ve rad51Δ suşlarının translokasyon Frekanslar - / -) SSA DSBs onarmak için bu suşların yeteneği farklılıkları karşılaştırmak için grafikle gösterilebilir. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Kaplama verimliliği belirlenmesi. (A) hücrelerin bir kısım gecede önce kültür ve sonrası DSB indüksiyon alınır, uygun dilüsyonları kültür ml başına hücre gövdeleri toplam sayısını belirlemek için bir hemasitometre sayı ile takip yapılır. Uygun dilüsyonları YPD görünen koloniler sayma, canlı hücreler ml başına toplam sayısı belirlemek için non-selektif ortam üzerine kaplanmıştır. (B) kaplama verimliliği sonra canlı hücreleri hücre gövdeleri toplam sayısına göre toplam sayısına bölünmesiyle ve bu sayının 100 ile çarpılarak belirlenir. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. Genomik Southern blot ve kromozom leke analizleri kromozomal translokasyon olayların tespiti. A) Grafik önce ilgili kromozom temsili (solda) ve (sağda) translokasyon oluşumundan sonra. Üst ve rekombinant kromozomlar Büyüklükleri megabase-çift (Mb) yer almaktadır. , Genomik DNA BamHI sindirim ebeveyn ve rekombinant suşlar tarafından oluşturulan ilgili dizilerini içeren kısıtlama parçalarının boyutları ve 1.8 kb BamHI HIS3 genomik klon hibridizasyon tarafından lekeler ortaya, kilobaz-çift (kb) yer almaktadır . Kromozomlar ölçekli çizilmiş değildir. B) Fiziksel varsayılan translokasyon taşıyan klonların analizi. (1) Genomik Southern blot analizi - Genomik DNA, jel elektroforezi, blo tarafından fraksiyone, BamHI restriksiyon endonükleaz ile toplanır ve sindirilmiş oldunaylon tted, aşağıdaki parçaları görselleştirmek için bir 32 P etiketli 1.8 kb HIS3 prob melezleşmiştir: 0,8 kb his3Δ200, 1,7 kb his3-Δ3 &#39;, 4 kb tIII: XV, 5 kb tXV: III ve 8 kb his3-Δ5 &#39;. Lanes: rekombinant bir) ana diploid, b) Onun rekombinant + olmayan resiprokal translokasyon, c) Onun + karşılıklı translokasyon. (2) CHEF jeli - Bozulmamış kromozom etidyum bromür ile boyanmış, CHEF ayrılmış, agaroz fişleri hazırlanmış ve UV ışık altında görüntülendi. Lanes: Yukarıdaki gibi. (3) Kromozom leke - Ayrı kromozom naylon, lekelenen ve 32 P etiketli 1.8 kb HIS3 probu ile aşağıdaki kromozom görselleştirmek için melezleşmiştir: 1.1 Mb sağlam kromozom XV, 0.8 Mb tXV: III translokasyon kromozom, 0.6 Mb tIII: XV translokasyon kromozom ve 0.3 Mb sağlam kromozom III. Lanes: Yukarıdaki gibi.

<ol>
	<li>Sen, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+genomic+deletions+mediated+by+recombination+between+Alu+elements.">Human genomic deletions mediated by recombination between Alu elements.</a> The American Journal of Human Genetics. 79, 41-53 (2006).</li><li>Han, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alu+recombination-mediated+structural+deletions+in+the+chimpanzee+genome.">Alu recombination-mediated structural deletions in the chimpanzee genome.</a> Plos Genetics. 3, 1939-1949 (2007).</li><li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+variation+in+human+health,+disease,+and+evolution.">Copy number variation in human health, disease, and evolution.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 10, 451-481 (2009).</li><li>Goodier, J. L., Kazazian, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrotransposons+revisited:+The+restraint+and+rehabilitation+of+parasites.">Retrotransposons revisited: The restraint and rehabilitation of parasites.</a> Cell. 135, 23-35 (2008).</li><li>Lanktree, M., Hegele, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+variation+in+metabolic+phenotypes.">Copy number variation in metabolic phenotypes.</a> Cytogenet Genome Res. 123, 169-175 (2008).</li><li>Mullighan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+genetic+alterations+in+acute+lymphoblastic+leukaemia.">Genome-wide analysis of genetic alterations in acute lymphoblastic leukaemia.</a> Nature. 446, 758-764 (2007).</li><li>Mattarucchi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microhomologies+and+interspersed+repeat+elements+at+genomic+breakpoints+in+chronic+myeloid+leukemia.">Microhomologies and interspersed repeat elements at genomic breakpoints in chronic myeloid leukemia.</a> Genes Chromosomes Cancer. 47, 625-632 (2008).</li><li>Stenger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biased+distribution+of+inverted+and+direct+Alus+in+the+human+genome:+implications+for+insertion,+exclusion,+and+genome+stability.">Biased distribution of inverted and direct Alus in the human genome: implications for insertion, exclusion, and genome stability.</a> Genome Res. 11, 12-27 (2001).</li><li>Hedges, D., Deininger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inviting+instability:+Transposable+elements,+double-strand+breaks,+and+the+maintenance+of+genome+integrity.">Inviting instability: Transposable elements, double-strand breaks, and the maintenance of genome integrity.</a> Mutat Res. 616, 46-59 (2007).</li><li>Symington, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+RAD52+epistasis+group+genes+in+homologous+recombination+and+double-strand+break+repair.">Role of RAD52 epistasis group genes in homologous recombination and double-strand break repair.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 66, 630-670 (2002).</li><li>Lewis, L., Resnick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tying+up+loose+ends:+nonhomologous+end-joining+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Tying up loose ends: nonhomologous end-joining in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mutat Res. 451, 71-89 (2000).</li><li>Pannunzio, N. R., Manthey, G. M., Bailis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAD59+is+required+for+efficient+repair+of+simultaneous+double-strand+breaks+resulting+in+translocations+in+Saccharomyces+cerevisiae.">RAD59 is required for efficient repair of simultaneous double-strand breaks resulting in translocations in Saccharomyces cerevisiae.</a> DNA Repair (Amst). 7, 788-800 (2008).</li><li>Nicholas, R., Pannunzio, G. M. M., Bailis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAD59+and+RAD1+cooperate+in+translocation+formation+by+single-strand+annealing+in+Saccharomyces+cerevisiae.">RAD59 and RAD1 cooperate in translocation formation by single-strand annealing in Saccharomyces cerevisiae.</a> Curr Genet. 56, 87-100 (2010).</li><li>Manthey, G. M., Bailis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad51+Inhibits+Translocation+Formation+by+Non-Conservative+Homologous+Recombination+in+Saccharyomyces+cerevisiae.">Rad51 Inhibits Translocation Formation by Non-Conservative Homologous Recombination in Saccharyomyces cerevisiae.</a> Plos One. 5, (2010).</li><li>Hoffman, C. S., Winston, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ten-minute+DNA+preparation+from+yeast+efficiently+releases+autonomous+plasmids+for+transformation+of+Escherichia+coli.">A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli.</a> Gene. 57, 267-272 (1987).</li><li>Sambrook, J., MacCallum, P., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2001).</li><li>Iadonato, S. P., Gnirke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RARE-cleavage+analysis+of+YACs.">RARE-cleavage analysis of YACs.</a> Methods Mol. Biol. , 75-85 (1999).</li><li>Argueso, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double-strand+breaks+associated+with+repetitive+DNA+can+reshape+the+genome.">Double-strand breaks associated with repetitive DNA can reshape the genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 11845-11850 (2008).</li><li>Batzer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alu+repeats+and+human+disease.">Alu repeats and human disease.</a> Molecular Genetic Metabolism. 67, 183-193 (1999).</li><li>Fasullo, M., Dave, P., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-damaging+agents+stimulate+the+formation+of+directed+reciprocal+translocations+in+Saccharomyces+cerevisiae.">DNA-damaging agents stimulate the formation of directed reciprocal translocations in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mutat. Res. 314, 121-133 (1994).</li><li>Richardson, C., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+chromosomal+translocations+induced+by+DNA+double-strand+breaks.">Frequent chromosomal translocations induced by DNA double-strand breaks.</a> Nature. 405, 697-700 (2000).</li><li>Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+altered+by+chromosomal+translocations+in+leukemias+and+lymphomas.">Genes altered by chromosomal translocations in leukemias and lymphomas.</a> The Genetic Basis of Human Cancer. , (2002).</li><li>Fasullo, M. T., Davis, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direction+of+chromosome+rearrangements+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+use+of+his3+recombinational+substrates.">Direction of chromosome rearrangements in Saccharomyces cerevisiae by use of his3 recombinational substrates.</a> Mol. Cell. Biol. 8, 4370-4380 (1988).</li><li>Manthey, G. M., Naik, N., Bailis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Msh2+Blocks+an+Alternative+Mechanism+for+Non-Homologous+Tail+Removal+during+Single-Strand+Annealing+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Msh2 Blocks an Alternative Mechanism for Non-Homologous Tail Removal during Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae.</a> PLoS One. 4, e7488-e7488 (2009).</li><li>Muller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-course+of+radiation-induced+chromosomal+aberrations+in+tumor+patients+after+radiotherapy.">Time-course of radiation-induced chromosomal aberrations in tumor patients after radiotherapy.</a> Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 63, 1214-1220 (2005).</li><li>Lin, F. L., Sperle, K., Sternberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+for+homologous+recombination+during+transfer+of+DNA+into+mouse+L+cells:+role+of+DNA+ends+in+the+recombination+process.">Model for homologous recombination during transfer of DNA into mouse L cells: role of DNA ends in the recombination process.</a> Mol. Cell. Biol. 4, 1020-1034 (1984).</li><li>Ivanov, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Requirements+for+the+single-strand+annealing+pathway+of+double-strand+break+repair+in+Saccharyomyces+cerevisiae.">Genetic Requirements for the single-strand annealing pathway of double-strand break repair in Saccharyomyces cerevisiae.</a> Genetics. 142, 693-704 (1996).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Yüksek dozda iyonize radyasyon, DSBs 19 çok sayıda üretimi ile genom istikrarsızlık içsel bir risk mevcut . Ökaryotik genomların translokasyonlar ve diğer genomik düzenlenmeleri 20,21 üretmek için mükemmel yüzeyler tekrarlanan dizileri ile doludur. DSBs tekrarlayan dizileri arasında 12,21,22 sunulduğunda İK tarafından kromozomal translokasyonlar sık görülmektedir. Ezici bir delil anlayışının önemini vurgulayan, bu mekanizmanın ökaryotlar 22,23 nasıl oluşur, lösemiler ve lenfomalar kromozom translokasyonları isnat edilebilir ile ilişkili genomik instabilite bu kadar göstermektedir . Biz tomurcuklanan maya maya ve insan genomları boyunca dağınık tekrarlayan elemanlarla boyutu benzer farklı kromozomlar üzerinde homoloji kısa bölgeler arasında DSB-indüklenen İK translokasyon kromozom oluşumunu incelemek için bir sistem geliştirdik. Tayininde, his3-Δ3 &#39;translokasyon substrat kromozom XV bir kopyası yer alıyor. Diğer his3 allel (his3 Δ200) 24 onarım için bir şablon olarak kullanılan bu sıra engeller HIS3 organizatörü ve kodlama sırası ~ 1KB silme vardır. His3 Δ5 &#39;substrat, kromozom III diğer kopyası ile değiştirilmemiş LEU2 allel (Şekil 1) içeren, kromozom III bir kopyasını LEU2 lokusu yer almaktadır . KAN-MX ile işaretlenmiş bir galaktoz-indüklenebilir HO endonükleaz ifade kaset kromozom IV (: GAL-HO-KAN-MX trp1) TRP1 lokus içine yerleştirildi. Her translokasyon Yüzey galaktoz eklenmesiyle orta HO gen ekspresyonu uyararak bölünme için hedef olabilir HO-endonükleaz tanıma sırası ile çevrili. His3 Δ3 ve his3 Δ5 &#39;substratlar HO-endonükleaz indüklenen bölünme sonra, hücreleri verimli bir translokasyon kromozomu üreten İK kırık kromozom onarmak için HIS3 dizi homoloji paylaşılan kısa yolu (311 baz puan (bp) ya da 60 baz puan (bp)) kullanabilirsiniz sağlam bir HIS3 allel 12-14,25. Ana hücreleri HIS3 geni bozulmamış bir kopyasını eksikliği nedeniyle, orta His-büyümek mümkün değildir. Translokasyon olayı geçiren hücreler orta eksik histidin için seçilebilir. Bu nedenle, kromozomal translokasyonların frekans histidin prototrophic kolonilerin sayısı YPD üzerine kaplama tarafından belirlenir kaplama canlı hücreler, toplam sayısına bölünmesiyle hesaplanır. Genomik DNA ve sağlam kromozomlar sonra temsili Onun + koloniler ve genomik Güney ve kromozom blot analizleri ile doğrulanır translokasyon kromozom varlığı izole edilebilir. Dikkatli analiz testinin yaklaşık 12 ek önemli bilgiler toplamak için bize izin verdi. Genomik Southern blot analizi HO-endonükleaz indüksiyon 30 dakika sonra XV ve III kromozom neredeyse tam bir kesim var olduğunu kanıtlar sunmuştur ve böylece kesilmemiş kromozom substratların anlamlı bir arka plan (G. Manthey &amp; A. Bailis, nüfus yayınlanmamış sonuçlar). Onun Genomik Güney ve kromozom leke analizleri - kurtulanların hücreleri sık sık, diğeri ya da her iki kesim kromozom kaybeder ve canlı kalır (L. Liddell &amp; A. Bailis, yayımlanmamış sonuçlar) gösterir . Önemlisi, non-selektif ortamda neredeyse eşdeğer kaplama verimleri HO-endonükleaz ifade indüksiyon öncesi ve sonrası translokasyon kromozom korumak için kırık kromozom onarım yetersizliği, ne de başarısızlık ne DSB oluşumunu hayatta kalmak için yeteneğini etkiler gösterir. Bununla uyumlu olarak, tXV: III translokasyon kromozom seçim olmaması mitotik hücrelerde istikrarsız olacağı gösterilmiştir. Bu tXV büyüyen gösterilmiştir: III-seçici olmayan bir gecede Onun + rekombinantlar içeren non-selektif plakalar üzerine tek koloniler kaplama ve histidin eksik seçici besiyeri üzerine çoğaltma kaplama. : III translokasyon kromozom (N. Pannunzio &amp; A. Bailis, yayımlanmamış sonuçlar): On% 70 bu levhaların kaynaklanan kolonilerin tXV kaybetmişti. Translokasyon kromozom insanlarda IR maruz tarafından oluşturulan benzer bir istikrarsızlık 26 sergilerler. Bu translokasyon oluşumu heterozigosite kaybı teşvik ederek erken tümörogenez olaylara katkıda bulunabilir göstermektedir. İkincisi, geniş genetik ve moleküler analizler SSA, HR verimli ve zorunlu olmayan muhafazakar bir mekanizma, iki kromozom 12,27,28 DSBs eş zamanlı oluşturulması aşağıdaki İK translokasyon oluşumunun birincil mekanizma olduğunu düşündürmektedir . Bu işbirliğibulgu ile nsistent IR HR maya genomu birden fazla tekrarlanan dizileri bitişik kesmeleri oluşturmak için yeterli DSBs bir yoğunluk ve yüksek frekans translokasyon oluşumu sonucu yüksek dozda. Birlikte, bu gözlemlerin öneririz onkojenik insanlarda IR maruz kalmanın etkisi, kısmen, kendi içsel istikrarsızlık ile, lansman tümörogenez genetik değişiklikler teşvik translokasyonlar oluşturduğu İnsan Kaynakları verimli bir mekanizma ile DSBs onarım sonucu. Radyasyon, radyasyona bağlı DSBs onarım sonucu hastaların sık sık ortaya çıkan ikincil kanserlerin nesil katkıda bulunabilir genellikle kanser, genom düzenlenmeleri tedavisinde kullanılan olduğundan. Böylece, bu model bize, IR tedavisi için önemli bir klinik yanıt, genetik ve moleküler temeli bir anlayışa yardımcı olabilir.

quantitation and analysis of the formation of ho-endonuclease stimulated chromosomal translocations by single-strand annealing in saccharomyces cerevisiae

Genetik çeşitlilik sık tekrarlayan elemanlarla her ökaryotik genom mevcut dağınık arasındaki etkileşim yoluyla ortaya çıkan genomik düzenlenmeleri tarafından aracılık eder. Bu süreç 1-3 arasında ve organizmalar içinde çeşitlilik oluşturmak için önemli bir mekanizma. Dahil olmak üzere bir çok çizgi ve Sines 4 retrotransposon kökenli yaklaşık% 40 tekrarlayan dizisi, insan genomu oluşur. Gen dozaj ve insanlar 6-9 otoimmün ve kardiyovasküler hastalıklar 5, yanı sıra kansere yol açabilir ifade bozabilir translokasyonlar dahil olmak üzere genom düzenlenmeleri, bu tekrarlanan elemanları arasında Alım Satım olayları neden olabilir. Alım Satım tekrarlanan elemanları arasında çeşitli şekillerde ortaya çıkar. Mükemmel (ya da mükemmele yakın) homoloji paylaşan dizileri arasında Exchange homolog rekombinasyon denilen bir süreç (İK) tarafından oluşur. Buna karşılık, homolog olmayan uç (NHEJ) katılmadan, döviz 10,11 için az ya da hiçbir dizisi homoloji kullanır. HR birincil amacı, mitotik hücrelerde çift iplikli endojen üretilen anormal DNA replikasyonu ve oksidatif lezyonlar sonları (DSBs) veya iyonize radyasyon (IR), ve diğer eksojen DNA zararlı maddeler maruz kalma tamir etmektir. Testin Burada anlatılan, DSBs galaktoz-indüklenebilir HO-endonükleaz (Şekil 1) diploid hücrelerinde iki farklı kromozom bölgeleri aynı anda rekombinasyon substratlar kıyısında oluşturulur . Kırık kromozom onarım tavlama (SSA), tek iplikli kromozom translokasyonları üretir, homolog kromozom uçları bitişik dizileri bir süreç kovalent tavlama için sonraki katıldı. Substratların his3-Δ3 HIS3 allel kesilir &#39;, 3 içerir ve yerli HIS3 lokus kromozom XV bir kopyasını yer almaktadır. His3-Δ5 &#39;, ikinci substrat kromozom III bir kopyasını LEU2 lokustaki bulunan ve 5 içeren&#39; HIS3 allel kesilir. Her iki substratlar HO-endonükleaz kesi için hedef olabilir HO endonükleaz tanıma sitesi tarafından çevrili. MAT lokus yerli HO endonükleaz tanıma siteleri, kromozom III hem kopya, tüm suşlarda silinmiş. Bu rekombinasyon yüzeyleri ve diğer tahlil müdahale kırık kromozom uçları arasındaki etkileşimi önler. KAN-MX işaretlenmiş galaktoz-indüklenebilir HO endonükleaz ifade kaset kromozom IV TRP1 lokustaki eklenir. Yüzeylerde payı 311 bp veya SSA tarafından onarım için İK makine tarafından kullanılabilir HIS3 kodlama dizisi 60 bp. İK kırık kromozom onarmak için bu yüzeylerin hücreler sağlam bir HIS3 allel ve tXV şekli: III kromozom translokasyonu orta eksik histidin (Şekil 2A) büyümeye yeteneği ile seçilebilir. İK tarafından Translokasyon frekans seçici besiyeri seçici olmayan, orta (Şekil 2B) üzerine uygun seyreltiler kaplama sonra ortaya çıkan canlı hücreler toplam sayısına göre ortaya çıkan histidin prototrophic kolonilerin sayısına bölünmesiyle hesaplanır . Bu sistemi kullanarak 12-14 SSA tarafından çeşitli DNA onarım mutantlar translokasyon oluşumunun genetik kontrol çalışması için kullanılır olmuştur.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae at 

Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae

HO-uyarılmış translokasyon tahlil tek iplikli DNA, çift iplikli tatili diploid birden fazla lokusların kurulmasından sonra tavlama izler<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Bu mekanizma, iyonlaştırıcı radyasyon yüksek dozlarda maruz kalma yüksek ökaryotlar somatik hücre genomu düzenlenmeleri model olabilir.

HO-Endonuclease Oluşum kantitasyonu ve Analiz Tavlama Tek-Strand kromozomal Translokasyonlar Uyarılmış Saccharomyces cerevisiae</em

Genetic variation is frequently mediated by genomic rearrangements that arise through interaction between dispersed repetitive elements present in every ...

quantitation-analysis-formation-ho-endonuclease-stimulated

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae

14.6K Görüntüleme.  Irell & Manella Graduate School of Biological Sciences. HO-uyarılmış translokasyon tahlil tek iplikli DNA, çift iplikli tatili diploid birden fazla lokusların kurulmasından sonra tavlama izler Saccharomyces cerevisiae. Bu mekanizma, iyonlaştırıcı radyasyon yüksek dozlarda maruz kalma yüksek ökaryotlar somatik hücre genomu düzenlenmeleri model olabilir.

Video: Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Diseksiyonu Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Biyoloji

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Yağ Asidi Kantitatif Phosphoproteomics Uyarılmış Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Mikroarray Analizi için Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Maya İzleme Mitophagy Floresan Mikroskopi Testi Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Yılında Kistik Fibrozis Transmembran İletkenlik Regülatörü Protein İfadesi ve Arıtma Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

İzlenmesi protein refolding için birleştiğinde Tahliller<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Olarak ifade edilmiştir kistik fibroz transmembran kondüktans regülatörü Protein Saflaştırılması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to identify and quantify the cofactors in their detectable redox state.
The technique is complementary to direct electrochemistry (voltammetry) approaches, as it does not offer information on electron transfer rates, but does establish the identity and redox state of the cofactors in the protein under study. The technique is widely applicable to any protein containing an electron paramagnetic resonance (EPR) detectable cofactor.
A typical titration requires 2 ml protein with a cofactor concentration in the range of 1-100 &#181;M. The protein is titrated with a chemical reductant (sodium dithionite) or oxidant (potassium ferricyanide) in order to poise the sample at a certain potential. A platinum wire and a Ag/AgCl reference electrode are connected to a voltmeter to measure the potential of the protein solution. A set of 13 different redox mediators is used to equilibrate between the redox cofactors of the protein and the electrodes. Samples are drawn at different potentials and the Electron Paramagnetic Resonance spectra, characteristic for the different redox cofactors in the protein, are measured. The plot of the signal intensity versus the sample potential is analyzed using the Nernst equation in order to determine the midpoint potential of the cofactor.

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

EPR kofaktörleridir Redox Titrasyonu İzlenen<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

MRNA Çürüme Oranlarının Ölçümü<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</emKullanma&gt;<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Suşlar

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...