Ce travail a été soutenu par des fonds du National Institutes of Health et l&#39;Institut de recherche Beckman de la ville de Hope. Nous tenons à remercier les réviseurs pour leurs commentaires constructifs qui ont ajouté la clarté du manuscrit.

1. Fréquences translocation HO-stimulé <ol><li> Inoculer 10-20 indépendante cultures de 1 ml de YPGly / Lac moyenne (1% extrait de levure, peptone à 2%, glycérol 3% et 3% de lactate) avec des colonies isolées du génotype désiré. Incuber les cultures de la nuit, ou pendant une durée suffisante pour atteindre une densité cellulaire d&#39;environ 5x10 7-1x10 8 cellules / ml, à 30 ° C sur un agitateur, ou avec une légère agitation. </li><li> Ajouter galactose à la culture à une concentration finale de 2% pour induire HO endonucléase dirigée CDB à l&#39;his3-Δ3 »(chromosome III) et his3-Δ5» (chromosome XV) substrats de translocation. </li><li> Incuber pendant 4 h à 30 ° C sur un agitateur, ou avec une légère agitation. </li><li> Après 4 h, les dilutions plaque appropriée des cultures sur YPD (extrait de levure 1%, 2% de peptone, 2% de dextrose) pour donner environ 100 à 200 colonies par plaque, et un nombre suffisant de cellules sur milieu dépourvu d&#39;histidine à céder une observable nombre de ses colonies + recombinant. Incuber les plaques à 30 ° C pendant deux à trois jours. </li></ol> REMARQUE: Etape 1.4 décrit la détermination des fréquences de la translocation dans des conditions sélectives en étalant les cultures sur l&#39;histidine manquent moyenne. Ce test peut également être menée sous conditions non sélectives en étalant sur des cultures YPD, puis réplique-placage des colonies qui se posent sur-Sa plaques deux à trois jours plus tard. Ces méthodes produisent des fréquences similaires de translocation (figure 2C). <ol start="5"><li> Déterminer la fréquence de translocation en divisant le nombre de colonies prototrophes histidine par le nombre total de cellules viables plaqués (déterminé par dilutions placage sur YPD). Déterminer la fréquence médiane et la translocation 95% intervalle de confiance 15. </li></ol> 2. Efficacités Placage <ol><li> Retirer une aliquote de cellules de chaque culture de la nuit, et de déterminer le nombre de cellules par hématimètre count (Baxter Healthcare Corporation Catolog #:. B3178-1). </li><li> Plaque d&#39;environ 100 à 200 cellules en utilisant une dilution appropriée sur YPD. Incuber pendant deux à trois jours à 30 ° C (par exemple pour une culture avec une densité cellulaire de 1x10 8 cellules / ml, on devrait plaque de 100 à 200 pi d&#39;une dilution 10-5 par plaque). </li><li> Ajouter galactose à 20% pour les cultures à une concentration finale de 2%. </li><li> Après 4 h, enlever une partie aliquote de cellules de chaque culture, de déterminer le nombre de cellules par comptage hématimètre, et la plaque d&#39;environ 100 à 200 cellules en utilisant une dilution appropriée sur YPD. Incuber pendant deux à trois jours à 30 ° C. </li><li> Déterminer l&#39;efficacité plaquage en divisant le nombre de colonies apparaissant sur YPD par le nombre de cellules étalées, et en multipliant ce quotient par 100. Déterminer le pourcentage médian avec un intervalle de confiance à 95%. </li></ol> 3. Genomic analyse par Southern blot <ol><li> Sélectionnez une seule colonie de Sa + recombinantes à partir de chaque essai indépendant et préparer l&#39;ADN génomique 16. </li><li> Recueil d&#39;environ 4 pg d&#39;ADN par l&#39;endonucléase de restriction BamHI. </li><li> Séparée digéré par BamHI de fragments sur un gel d&#39;agarose 0,7%, et le transfert d&#39;une membrane de nylon chargée positivement (Hybond N +, GE Healthcare Product Code:. RPN303B) 17. </li><li> S&#39;hybrider avec une 32 P-sonde marquée obtenus par amorçage aléatoire (Amersham Biosciences Code du produit:. RPN1604) avec un 1,8 kb BamHI / BamHI clone génomique contenant le gène HIS3. </li><li> Visualisez les fragments d&#39;ADN par autoradiographie ou phosphorimaging. </li></ol> 4. Une analyse par transfert de chromosomes en utilisant des chromosomes séparés dans un contour serré homogène du champ électrique (CHEF): <ol><li> Préparer les chromosomes de ses recombinants sélectionnés + dans les bouchons d&#39;agarose 18: <ul><li> Cultiver une culture liquide de Son candidat + TXV:: III chromosome recombinant contenant dans 5 ml de YPD à environ 1-2 x 10 8 cellules / ml. </li><li> Isoler et laver les cellules deux fois avec 50 mM d&#39;EDTA. </li><li> Resuspendre les cellules dans environ 200 pi d&#39;EDTA 50 mM, et chaude à 50 ° C. </li><li> Ajouter un volume égal de liquide de 2% (p / v) faible fondre agarose portée à 50 ° C, bien mélanger. </li><li> Répartir environ 80 aliquotes dans des moules fiche, et les laisser refroidir pendant 30 min à 4 ° C. </li><li> Extruder les bouchons du moule dans un plat de 12 puits. Jusqu&#39;à cinq fiches peuvent être placés dans chaque puits. </li><li> Ajouter 3 ml de solution sphéroplastes fraîchement préparés (14 mM de 2-β-mercaptoéthanol, 20 mM d&#39;EDTA, 0,5 mg / ml Zymolyase 20T, 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1 M sorbitol) à chaque puits. Incuber à 37 ° C pendant 4 heures avec une agitation douce. </li><li> Retirer et remplacer la solution sphéroplastes avec 3 ml de solution de LDS (10 mM Tris-HCI, pH 8,0, 100 mM d&#39;EDTA, 1% (p / v) de dodécylsulfate de lithium, adjuspH à 8,0 t). Incuber à 37 ° C pendant 15 min avec agitation douce. </li><li> Retirer solution de LDS et le remplacer par une autre partie aliquote de 3 ml de LDS. Incuber à 37 ° C pendant une nuit sous agitation douce. </li><li> Retirer et remplacer LDS avec 3 ml de 0,2 X NDS (0,6 g de Tris base, 93 g EDTA disodique dihydraté, 5 g de N-lauroyl sarcosine, ajuster le pH à 8,0, porté à 500 ml avec dH 2 O). Incuber à température ambiante pendant 30 min avec agitation douce. Retirer NDS, et répéter 2 fois. </li><li> Retirer et remplacer NDS avec 3 ml de TE. Laver avec une légère agitation pendant 30 min à température ambiante. Répétez 4 fois. </li><li> Magasin de bouchons à 4 ° C dans 2 ml de TE. Bouchons peut se conserver jusqu&#39;à un an. </li></ul></li><li> Chromosomes distincts sur un gel à 1% d&#39;agarose en utilisant un Bio-Rad CHEF-DRII appareil à 14 ° C (Catalogue #: 170-3612). </li></ol> Paramètres: 1 Bloc er: changer l&#39;heure 70, 15h à 6V/cm. 2 ème bloc: changer l&#39;heure 120s, 11h au 6V/cm <ol start="3"><li> Visualisez les chromosomes par coloration au bromure d&#39;éthidium 1μg/ml pendant 30 min, irradiant avec 60 mJ d&#39;UV dans un Stratalinker UV (Stratagene), et de-coloration pendant 30 min dans dH 2 O. Irradiant de bromure d&#39;éthidium chromosomes colorés entailles de l&#39;ADN pour permettre le transfert efficace de la membrane. </li><li> Transfert des chromosomes à une membrane chargée positivement (Hybond N +, GE Healthcare Product Code:. RPN303B) par capillarité dans les conditions dénaturantes (NaOH 0,4 N, 1,5 M de NaCl). </li><li> S&#39;hybrider avec une 32 P-sonde marquée obtenus par amorçage aléatoire (Amersham Biosciences Code du produit:. RPN1604) avec un clone génomique de 1,8 kb BamHI / BamHI contenant le gène HIS3 17. </li><li> Visualisez les chromosomes par autoradiographie ou phosphorimaging. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Une représentation graphique de l&#39;essai de translocation est représenté au niveau chromosomique (Figure 1). Un schéma de la procédure expérimentale est également affichée (figure 2A). Les deux pré-et efficacités plaquage post-induction sont déterminés en divisant le nombre total de cellules viables colonie, formant par le nombre total de corps cellulaires dans la culture déterminée par hématimètre comptage (figure 4B). Pré-et de l&#39;efficacité plaquage post-induction ne sont pas significativement différentes pour les cellules de type sauvage (valeur p = 0,1400) (tableau 1). <img src="/files/ftp_upload/3150/3150table1.jpg" alt="Tableau 1" /> Tableau 1. Pré-et de l&#39;efficacité plaquage post-induction dans les cellules de type sauvage. a Le nombre de corps cellulaires par millilitre sont déterminées par comptage hématimètre. b Le nombre de cellules viables par millilitre sont déterminées par étalement des dilutions appropriées sur milieu non sélectif pour produire ~ 100-200 colonies. c Les pré-et efficacités plaquage post-induction sont déterminés en divisant le nombre total d&#39;entreprises viables, formant colonie, les cellules par le nombre total de corps cellulaires dans la culture, déterminée par le nombre hématimètre. Cela suggère que la présence ou l&#39;absence d&#39;une translocation chromosomique soit n&#39;affecte pas la capacité de survivre à la formation de l&#39;ORD. La fréquence des translocations chromosomiques peuvent être calculés en divisant le nombre de colonies prototrophes histidine par le nombre total de cellules viables déterminé par étalement sur ​​YPD (figure 2B). Ce test peut être effectué en utilisant des souches de génotype différent de déterminer comment la perte de la fonction des protéines affecte l&#39;Afrique subsaharienne (soit rad51Δ - / -). Fréquences de recombinaison déterminée dans différentes souches peuvent alors être représentées graphiquement pour comparer les différences dans la capacité de ces souches pour réparer les CDB endonucléase HO-induite par l&#39;ASS (figure 2C). Translocation fréquences obtenues avec la souche diploïde sauvage de type en vertu sélective (2.2x10 -2) et non sélectif (2.17x10 -2) les conditions n&#39;étaient pas statistiquement différents les uns des autres (valeur p = 0,9131), tandis que les fréquences obtenues translocation sélective (6.0x10 -2) et non sélective (11.9x10 -2) avec le rad51Δ - / - homozygotes étaient similaires, mais statistiquement différentes (valeur p = 0,0089). Les fréquences obtenues à la fois sélective (valeur p = 0,0001) et non sélective (valeur p = 0,0002) avec le ¨ Rad51 - / - homozygotes étaient statistiquement différents de ceux obtenus en utilisant les conditions correspondant à la souche de type sauvage. Putatifs translocation portant des clones peut être encore examiné par Southern blot génomiques et les analyses chromosomiques (figure 3). Pour une analyse de Southern, l&#39;ADN génomique est digéré par une endonucléase BamHI avant électrophorèse sur gel, buvard et d&#39;hybridation pour une 32P-étiquetés 1.8kb HIS3 sonde pour visualiser le diagnostic de 0,8 kb his3Δ200, 1,7 kb his3-Δ3 &#39;, 4 ko TIII:: XV, 5 ko TXV:: III, et 8 ko his3-Δ5 «fragments (figure 3B.1) . Chromosomes intacts peuvent être préparés, séparés par le chef (figure 3B.2), effacés au nylon et hybrides avec le P-32 étiqueté 1,8 kb HIS3 sonde pour visualiser les chromosomes intacts 1.1 Mo XV, 0,8 Mb TXV: chromosome translocation III, 0.6 Mo TIII: chromosome translocation XV, et de 0,3 Mb du chromosome III intacte (figure 3B.3). Une carte graphique illustrant devrait BamHI endonucléase digérée fragments d&#39;ADN génomique, et les parents et les chromosomes recombinants, est représenté (figure 3A). <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Formation des chromosomes par translocation simple brin recuit (ASS). 1) CDB sont créés à l&#39;his3-Δ3 et his3-Δ5 «substrats (chromosomes XV et III, respectivement) par endonucléase HO suite à l&#39;ajout de galactose à la culture. 2) CDB sont traitées pour produire 3 &#39;simple-brins aux extrémités des chromosomes cassés. 3) recuits machines ASS 311 nucléotides complémentaires ou 60 simple brin HIS3 séquences formées à chacun des substrats de recombinaison. Non homologue queues formées lors de recuit sont éliminés par digestion par des endonucléases. Complémentaire quatre surplombe pb sur les fragments restants chromosomiques formé par la digestion d&#39;endonucléase HO-peut aussi recuit. 4) La ligature conclut la création d&#39;un gène HIS3 intacte et TXV:: chromosome translocation III par l&#39;ASS. Cellules porteuses du chromosome présent peuvent être sélectionnées par leur capacité à croître sur l&#39;histidine manquent moyenne. La ligature peut aussi générer la réciproque TIII:: chromosome translocation XV par un mécanisme de NHEJ-like. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Essai pour déterminer la fréquence de la translocation par le SSA. A) Un ml YPGly / Lac cultures sont inoculées avec des colonies de cellules unique d&#39;un génotype de sélectionner et s&#39;est développée à une densité appropriée d&#39;environ 5x10 7-1x10 8 cellules / ml. Le galactose est ajouté à une concentration finale de 2% pour créer des CDBs dans les substrats de recombinaison des chromosomes III et XV. Pour effectuer le test dans des conditions sélectives, des dilutions appropriées sont faites de telle sorte que d&#39;environ 100 à 200 cellules sont étalées sur YPD et un nombre suffisant de cellules sont étalées sur l&#39;histidine manquent moyenne pour produire un certain nombre de ses colonies observables + recombinant. Pour effectuer le test sans sélection, environ 100 à 200 cellules sont étalées sur YPD, cultivées pendant deux à trois jours pour des colonies isolées puis réplique plaquée sur l&#39;histidine milieu dépourvu. B) la fréquence de translocation peut être déterminé en divisant le nombre de colonies qui poussent sur-Sa plaques par la fraction qui poussent sur YPD. C) Les fréquences translocation des souches de génotype différent (c&#39;est à dire de type sauvage et rad51Δ - / -) peuvent être représentées graphiquement pour comparer les différences dans la capacité de ces souches pour réparer les CDB en Afrique subsaharienne. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Déterminer l&#39;efficacité de placage. (A) Une aliquote de cellules est tirée de la culture de la nuit avant et après l&#39;induction ORD, des dilutions appropriées sont prises, suivie par un nombre de hématimètre pour déterminer le nombre total de corps cellulaires par ml de culture. Des dilutions appropriées sont étalées sur un milieu non sélectif pour déterminer le nombre total de cellules viables par ml, en comptant les colonies qui apparaissent sur YPD. (B) L&#39;efficacité d&#39;étalement est alors déterminé en divisant le nombre total de cellules viables par le nombre total de corps cellulaires, et en multipliant ce quotient par 100. <img src="/files/ftp_upload/3150/3150fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Détection des événements translocation chromosomique par Southern blot génomiques et analyses par transfert de chromosomes. A) Représentation graphique des chromosomes concernés avant (à gauche) et après la formation de translocation (à droite). Tailles des parents et des chromosomes recombinés sont énumérés dans mégabase paires (Mo). Tailles des fragments de restriction contenant des séquences pertinentes générées par digestion BamHI de l&#39;ADN génomique de parent et les souches recombinantes, et a révélé sur des transferts par hybridation avec un clone de 1,8 kb BamHI HIS3 génomique, sont énumérés dans kilobase-paires (ko). Les chromosomes ne sont pas dessinés à l&#39;échelle. B) Analyse physique de putatifs translocation portant des clones. (1) L&#39;analyse génomique par Southern blot - ADN génomique a été recueilli et digéré par l&#39;endonucléase de restriction BamHI, fractionné par électrophorèse sur gel, blotted au nylon, et hybridé à un P-32 étiqueté 1,8 kb HIS3 sonde pour visualiser les fragments suivants: 0,8 kb his3Δ200, 1,7 kb his3-Δ3 &#39;, 4 ko TIII:: XV, 5 ko TXV:: III, et 8 ko his3-Δ5 ». Lanes: un parent diploïde), b) Son + non réciproques translocation recombinantes, c) Sa translocation réciproque + recombinant. (2) CHEF gels - chromosomes intacts ont été préparées dans les bouchons d&#39;agarose, séparés par le chef, coloré avec du bromure d&#39;éthidium et visualisé sous lumière UV. Lanes: Comme ci-dessus. (3) efface chromosomes - chromosomes séparés ont été effacés au nylon et hybrides avec le P-32 étiqueté 1,8 kb HIS3 sonde pour visualiser les chromosomes suivants: 1.1 Mo chromosomes intacts XV, 0,8 Mb TXV: chromosome translocation III, 0,6 Mb TIII: translocation XV chromosome, et de 0,3 Mb du chromosome III intacte. Lanes: Comme ci-dessus.

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L., Sperle, K., Sternberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+for+homologous+recombination+during+transfer+of+DNA+into+mouse+L+cells:+role+of+DNA+ends+in+the+recombination+process.">Model for homologous recombination during transfer of DNA into mouse L cells: role of DNA ends in the recombination process.</a> Mol. Cell. Biol. 4, 1020-1034 (1984).</li><li>Ivanov, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Requirements+for+the+single-strand+annealing+pathway+of+double-strand+break+repair+in+Saccharyomyces+cerevisiae.">Genetic Requirements for the single-strand annealing pathway of double-strand break repair in Saccharyomyces cerevisiae.</a> Genetics. 142, 693-704 (1996).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Des doses élevées de rayonnements ionisants présentent un risque inhérent d&#39;instabilité du génome à travers la génération d&#39;un grand nombre de CDB 19. Les génomes eucaryotes sont remplis de séquences répétitives qui sont d&#39;excellents substrats pour générer des translocations et des réarrangements génomiques d&#39;autres 20,21. Translocations chromosomiques par les RH sont fréquemment observés lorsque CDB sont introduits entre les séquences répétitives 12,21,22. Des preuves irréfutables indiquent qu&#39;une grande partie de l&#39;instabilité génomique associée aux leucémies et les lymphomes peuvent être attribués à des translocations chromosomiques, en soulignant l&#39;importance de comprendre comment ce mécanisme se produit chez les eucaryotes 22,23. Nous avons développé un système de levure bourgeonnante pour examiner la formation de chromosomes translocation induite par l&#39;ORD RH entre les régions d&#39;homologie courts sur différents chromosomes qui sont similaires en taille aux éléments répétitifs dispersés à travers la levure et le génome humain. Dans le dosage, la translocation du substrat his3-Δ3 &#39;est situé sur une copie du chromosome XV. L&#39;autre allèle his3 (his3-Δ200) a une suppression ~ 1kb du promoteur HIS3 et séquence codante qui empêche cette séquence d&#39;être utilisé comme un modèle pour la réparation 24. Le substrat his3-Δ5 &#39;est situé sur le locus LEU2 sur une copie du chromosome III, avec l&#39;autre copie du chromosome III contenant une inaltéré LEU2 allèle (figure 1). Une cassette de galactose-inductible HO expression endonucléase marqués par KAN-MX a été insérée dans le locus du chromosome IV TRP1 (trp1:: GAL-HO-KAN-MX). Chaque substrat de translocation est flanqué d&#39;une séquence de reconnaissance endonucléase HO-qui peuvent être ciblés pour un clivage en induisant l&#39;expression du gène HO par l&#39;ajout de galactose dans le milieu. Après clivage de l&#39;endonucléase HO-induites à l&#39;his3-Δ3 et his3-Δ5 «substrats, les cellules peuvent utiliser efficacement les voies partagées courts de HIS3 homologie de séquence (311 pb ou 60 pb) pour réparer les chromosomes brisés par les RH, générant un chromosome translocation avec une intacte HIS3 allèle 12-14,25. Parce que les cellules-mères n&#39;ont pas une copie intacte du gène HIS3, ils sont incapables de croître sur son support. Seules les cellules qui ont subi l&#39;événement de translocation peut être sélectionnée pour le manque de moyens histidine. Par conséquent, la fréquence des translocations chromosomiques peuvent être calculés en divisant le nombre de colonies prototrophes histidine par le nombre total de cellules viables plaqué, déterminé par étalement sur YPD. L&#39;ADN génomique et les chromosomes intacts peut alors être isolé du représentant de ses colonies +, et la présence d&#39;un chromosome translocation vérifiées par la génomique du Sud et analyses par transfert de chromosomes. Une analyse minutieuse nous a permis de recueillir d&#39;autres informations importantes sur le dosage de 12. Genomic analyse de Southern a fourni la preuve qu&#39;il ya la coupe quasi complète des chromosomes XV et III, après 30 minutes de l&#39;endonucléase HO-induction, et donc il n&#39;ya pas de fond important des substrats bruts chromosomiques dans la population (G. &amp; A. Manthey Bailis, résultats non publiés). Genomic analyses par Southern blot et le chromosome de Sa - survivants indiquent que les cellules perdent souvent un, l&#39;autre, ou les deux chromosomes couper et rester viable (L. Liddell &amp; A. Bailis, résultats non publiés). Surtout, l&#39;efficacité plaquage près équivalente sur un milieu non sélectif avant et après l&#39;induction de l&#39;expression de HO-endonucléase indique que ni le défaut de réparation de chromosomes cassés, ni l&#39;incapacité à retenir les chromosomes translocation affecte la capacité de survivre à la formation de l&#39;ORD. Conformément à cela, le TXV: chromosome translocation III a été montré à être instable dans les cellules mitotiques en l&#39;absence de sélection. Cela a été démontré par la croissance TXV:: III contenant ses recombinants + nuit non sélective, le placage des colonies isolées sur des plaques non-sélectif, et le placage réplique sur un milieu sélectif manque histidine. Dix à 70% des colonies résultant de ces plaques avaient perdu la TXV:: chromosome translocation III (N. Pannunzio &amp; A. Bailis, résultats non publiés). La translocation des chromosomes générés par l&#39;exposition IR chez les humains présentent une instabilité similaire 26. Cela suggère que la formation de la translocation peut contribuer à des événements précoces dans la tumorigenèse en favorisant la perte d&#39;hétérozygotie. Deuxièmement, de nombreuses analyses génétiques et moléculaires suggèrent que l&#39;Afrique subsaharienne, un mécanisme efficace et obligatoirement non-conservatrice de ressources humaines, est le principal mécanisme de formation de la translocation par HR suite à la création simultanée de CDB sur les deux chromosomes 12,27,28. Ceci est la consistent avec la constatation que de fortes doses de résultat IR dans une densité de CDB suffisante pour créer des sauts de côté de multiples séquences répétitives dans le génome de la levure, et une fréquence élevée de la formation de la translocation par les RH. Ensemble, ces observations suggèrent que l&#39;effet oncogène de l&#39;exposition chez les humains IR peut, en partie, le résultat de la réparation des CDB par un mécanisme efficace de ressources humaines qui génère des translocations qui, par leur instabilité inhérente, de promouvoir des changements génétiques qui tumorigenèse lancement. Parce que le rayonnement est souvent utilisé pour traiter le cancer des réarrangements du génome, qui résultent de la réparation des CDB radio-induites peuvent contribuer à la génération des cancers secondaires qui surviennent fréquemment chez les patients. Ainsi, ce modèle peut nous aider à acquérir une meilleure compréhension des bases génétiques et moléculaires d&#39;une réponse clinique importante à un traitement IR.

quantitation and analysis of the formation of ho-endonuclease stimulated chromosomal translocations by single-strand annealing in saccharomyces cerevisiae

La variation génétique est souvent médiatisée par des réarrangements génomiques qui surgissent à travers l&#39;interaction entre les éléments dispersés répétitifs présents dans chaque génome eucaryote. Ce processus est un mécanisme important pour générer la diversité entre et au sein des organismes 1-3. Le génome humain est constitué d&#39;environ 40% des séquences répétitives d&#39;origine rétrotransposon, y compris une variété de lignes et Sines 4. Des événements de change entre ces éléments répétitifs peuvent conduire à des réarrangements génomiques, y compris les translocations, qui peuvent perturber le dosage génique et d&#39;expression qui peut entraîner des maladies auto-immunes et les maladies cardiovasculaires 5, ainsi que le cancer chez les humains 6-9. Échange entre les éléments répétitifs survient dans une variété de façons. Échange entre les séquences qui partagent parfaite (ou presque parfaite) homologie produit par un processus appelé recombinaison homologue (RH). En revanche, non homologue fin (NHEJ) utilise peu-ou-pas d&#39;homologie de séquence pour l&#39;échange de 10,11. Le but principal des ressources humaines, dans les cellules en mitose, est de réparer des cassures double brin (CDB) a généré de façon endogène par réplication de l&#39;ADN et les lésions oxydatives aberrants, ou par exposition aux rayonnements ionisants (RI), et d&#39;autres agents endommageant l&#39;ADN exogène. Dans l&#39;essai décrit ici, CSD sont simultanément créés en bordure substrats recombinaison à deux différents loci chromosomiques dans les cellules diploïdes par un galactose-inductible HO-endonucléase (figure 1). La réparation des chromosomes cassés génère des translocations chromosomiques par simple-brin de recuit (ASS), un processus où des séquences homologues adjacentes aux extrémités des chromosomes sont joint de manière covalente à la suite de recuit. L&#39;un des substrats, his3-Δ3 », contient un 3 &#39;tronquée HIS3 allèle et est situé sur une copie du chromosome XV au locus HIS3 natif. Le deuxième substrat, his3-Δ5 », est situé au niveau du locus LEU2 sur une copie du chromosome III, et contient un 5 &#39;tronquée HIS3 allèle. Les deux substrats sont flanqués d&#39;un site de reconnaissance endonucléase HO qui peuvent être ciblés pour l&#39;incision par HO-endonucléase. Les sites de reconnaissance endonucléase HO natif au locus MAT, sur les deux copies du chromosome III, ont été supprimés dans toutes les souches. Cela empêche l&#39;interaction entre les substrats de la recombinaison et d&#39;autres extrémités des chromosomes cassés d&#39;interférer dans le dosage. La KAN-MX-marqués galactose-inductible cassettes d&#39;expression HO endonucléase est introduite au niveau du locus TRP1 sur le chromosome IV. Les substrats part 311 pb ou 60 pb de la séquence de codage HIS3 qui peuvent être utilisées par la machine pour réparation par HR ASS. Les cellules qui utilisent ces supports à la réparation des chromosomes cassés par les RH constituent une intacte et un allèle HIS3 TXV:: III translocation chromosomique qui peut être sélectionné par la capacité à croître sur milieu dépourvu d&#39;histidine (figure 2A). La fréquence de translocation par HR est calculé en divisant le nombre de colonies prototrophes histidine qui se posent sur ​​le milieu sélectif par le nombre total de cellules viables qui surviennent après étalement des dilutions appropriées sur milieu non sélectif (figure 2B). Une variété de mutants de réparation d&#39;ADN ont été utilisés pour étudier le contrôle génétique de la formation de la translocation par SSA en utilisant ce système 12-14.

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Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae

Le dosage de la translocation HO-stimulé surveille simple brin recuit après la création de l&#39;ADN des cassures double brin à des loci multiples diploïde<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Ce mécanisme peut modèle de réarrangements génomiques dans les cellules somatiques des eucaryotes supérieurs après une exposition à des doses élevées de rayonnements ionisants.

La quantification et l&#39;analyse de la formation de HO-endonucléase Stimulé par les translocations chromosomiques simple brin recuit dans Saccharomyces cerevisiae</em

Genetic variation is frequently mediated by genomic rearrangements that arise through interaction between dispersed repetitive elements present in every ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Quantitation and Analysis of the Formation of HO-Endonuclease Stimulated Chromosomal Translocations by Single-Strand Annealing in Saccharomyces cerevisiae

14.6K vues.  Irell & Manella Graduate School of Biological Sciences. Le dosage de la translocation HO-stimulé surveille simple brin recuit après la création de l'ADN des cassures double brin à des loci multiples diploïde Saccharomyces cerevisiae. Ce mécanisme peut modèle de réarrangements génomiques dans les cellules somatiques des eucaryotes supérieurs après une exposition à des doses élevées de rayonnements ionisants.

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Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Dissection de Saccharomyces cerevisiae Asques

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Recherche

Biologie

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoprotéomique quantitatives en acide gras Stimulé Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Analyse de Microarray pour Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Un test microscopie de fluorescence pour Mitophagy surveillance dans la levure<em&gt; Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Expression et purification de la protéine transmembranaire de la fibrose kystique conductance Regulator dans Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisation et d&#39;analyse de molécules d&#39;ARNm par fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Les analyses couplées pour la surveillance protéines repliement<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Purification de la fibrose kystique régulateur de la conductance transmembranaire protéine exprimée dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to identify and quantify the cofactors in their detectable redox state.
The technique is complementary to direct electrochemistry (voltammetry) approaches, as it does not offer information on electron transfer rates, but does establish the identity and redox state of the cofactors in the protein under study. The technique is widely applicable to any protein containing an electron paramagnetic resonance (EPR) detectable cofactor.
A typical titration requires 2 ml protein with a cofactor concentration in the range of 1-100 &#181;M. The protein is titrated with a chemical reductant (sodium dithionite) or oxidant (potassium ferricyanide) in order to poise the sample at a certain potential. A platinum wire and a Ag/AgCl reference electrode are connected to a voltmeter to measure the potential of the protein solution. A set of 13 different redox mediators is used to equilibrate between the redox cofactors of the protein and the electrodes. Samples are drawn at different potentials and the Electron Paramagnetic Resonance spectra, characteristic for the different redox cofactors in the protein, are measured. The plot of the signal intensity versus the sample potential is analyzed using the Nernst equation in order to determine the midpoint potential of the cofactor.

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

EPR surveillé Redox titrage des cofacteurs de<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

Mesure de la dégradation de l&#39;ARNm Tarifs en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Utilisation<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Les souches

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...