Este trabajo fue apoyado por una beca de investigación de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR, MOP-86749). L. Liu es un recipiente del Premio de CIHR Nueva Investigador (MSH-95374).

1. Preparación de quimioatrayente en gel de agarosa <ol><li> Pipeta de 10 ml de 2 × PBS en un tubo cónico de 50 ml, y calentar el tubo por ponerlo en un recipiente que contiene agua caliente. </li><li> Pipeta de 10 ml de agua destilada y añadir 0,4 g de polvo de agarosa en otro tubo cónico de 50 ml (con la tapa ligeramente floja) y calentar la mezcla hasta que esté hirviendo en un horno de microondas (para ~ 1 min en un horno microondas de 700 vatios) . </li><li> Agregue el calentado de 2 × PBS a la solución de agarosa al tubo, agitar la solución mixta y mantenerlo caliente en el vaso de agua caliente. </li><li> Micropipeta solución quimiotáctica (por ejemplo, 10 l de 0,5 mg de quimiocinas CXC MIP-2 y 12 l de WKYMVm 1 mM) en la tapa de un tubo de 1,5 ml Eppendorf que contiene 3 l tinta china y mezclar bien mediante aspiración con una micropipeta (evitar burbuja de aire). </li><li> Cortar el extremo de la punta de una punta de pipeta de 200 l 110 l y micropipeta de agarosa solución (42 ° C) en la tapa e inmediatamente mezclar bien con otro punta de la pipeta (evite burbujas de aire). </li><li> Guarde el gel quimioatrayente que contienen a + 4 ° C. </li></ol> 2. Preparación de músculo Cremaster de microscopía intravital (Figura 1) <ol><li> Anestesiar a un ratón macho adulto con una inyección ip de una mezcla de 10 mg / kg de xilazina y 200 mg / kg de clorhidrato de ketamina. </li><li> Afeitar el área de más de vena yugular externa derecha y la cara anterior del escroto con una maquinilla de afeitar eléctrica. Después de la anestesia, es importante prestar especial atención y cuidado para el ratón anestesiado. Una lámpara de calor se puede utilizar para evitar que el ratón de la hipotermia. El ratón debe estar libre de dolor reflejo. </li><li> Se practica una incisión horizontal, encontrar y cateterizar la vena yugular con una tubería de PE-10 lleno de solución salina con heparina 100 U / mL. La cateterización de la vena yugular que se necesita para la administración de anestésicos y medicamentos adicionales cuando sea necesario. </li><li> Fijar las patas traseras del ratón con una cinta umbilical con el ratón boca arriba sobre una placa de fabricación casera músculo cremáster (Figura 1). </li><li> Conecte la tarjeta a un 37 ° C de recirculación de agua para mantener el músculo cremáster y el cuerpo del ratón caliente. </li></ol> Nota: Todos los procedimientos de 2,6 a 2,14 se debe realizar con mucho cuidado 5. <ol start="6"><li> Hacer una incisión en la piel del escroto para exponer el músculo cremáster izquierda. Diseccionar cuidadosamente el músculo de la fascia asociada. </li><li> Superfuse el músculo cremáster con 37 ° C, calentado bicarbonato de solución salina tamponada (131,9 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgSO 4, 20 NaHCO 3, en mM, pH 7,4) usando una bomba peristáltica. </li><li> Atar una sutura 4-0 al extremo distal del músculo cremáster que se mantenga en el pedestal de visualización de cristal transparente de la junta directiva del músculo cremáster. </li><li> Cauterizar el músculo cremáster longitudinalmente. Con sutura 4-0, mantenga el plano muscular y seguro que a lo largo de los bordes en el pedestal. Separar el testículo y el epidídimo del músculo subyacente y los trasladan a la cavidad abdominal. </li><li> Superfuse el músculo en 22 ~ 0,6 ml / min con el tampón de 37 ° C-perfusión caliente y cubrir el músculo expuesto con un 22 × cubreobjetos mm. </li><li> Coloque la tarjeta de músculo cremáster en la platina del microscopio, examina el músculo bajo el microscopio, encontrar una vénula adecuado postcapilares (Seleccione la vénula que es recto y no ramificado y tiene una tasa de corte normal y un diámetro de 25-40 micras) y ajustar la cámara de vídeo para permitir la vénula para ser visualizados en una posición vertical en los extremos izquierdo o derecho de la pantalla del televisor. </li><li> Después de equilibrio de 30 min, grabar las imágenes de vídeo de la vénula seleccionado postcapilares durante 5 minutos como datos de referencia utilizando una grabadora de video. </li><li> Detener la superfusión y quitar el cubreobjetos sobre el músculo. </li><li> Un lugar ~ 1-3 mm de tamaño quimioatrayente que contienen gel en la superficie del músculo cremáster en un área preseleccionada 350 micras y paralelo a la vénula postcapilares observado, añadir cubreobjetos para mantener el gel en su lugar y superfuse el tejido muscular en un momento muy ritmo lento (≤ 10 l / min) para permitir el establecimiento de un gradiente de quimioatrayente que se libera lentamente y formado a partir del gel. </li><li> Grabar la imagen de vídeo de 90 minutos después de la adición del gel que contiene chemoattractant. Durante la grabación, ajustar y mantener el enfoque en el microscopio de la adhesión, gatear, transmigración y chemotaxing leucocitos en el interior de la vénula y en el tejido muscular. </li><li> Después del experimento, importar el archivo de vídeo a un ordenador para su análisis. </li></ol> 3. Celular seguimiento mediante ImageJ <ol><li> En un equipo, extraer y convertir el vídeo a formato AVI (por ejemplo, el uso de software libre bitRipper equipo para convertir el vídeo de DVD a formato AVI). </li><li> Utilice el software de edición de vídeo para generar la película el tiempo transcurrido. Por ejemplo, utilizar Windows Movie Maker para hacer una película de tiempo transcurrido (a 1 / 512 o 1 / 1024 de lapso de tiempo unt 30 fps velocidad) de la original, vídeo en tiempo real. Convertir y guardar el tiempo transcurrido sin comprimir películas a formato DV-AVI. </li><li> Grabar las imágenes del micrómetro de calibración en el ajuste mismo microscopio, importar imágenes a la computadora, abrir las imágenes con ImageJ. En ImageJ, el total de píxeles aparecen en la parte superior izquierda de la pantalla (por ejemplo, 720 × 480 píxeles). Medir el tamaño de la pantalla en ambos ejes X e Y (por ejemplo, 200 x 150 mm). De esto, calcular el número de píxeles por micras (por ejemplo, x = 720/200 = 3,6 píxeles / m, y = 480/150 = 3,2 píxeles / mm). </li><li> Para importar la película, abre ImageJ nuevo, haga clic en &quot;Archivo-Importar-Uso de películas de QuickTime Plug-in&quot;, seleccionar la película a analizar y haga clic en &quot;OK&quot; en la interfaz de &quot;Abridor de la película de QT&quot;. </li><li> Haga clic en &quot;Plugins-Manual de seguimiento&quot; para rastrear las células. Llene la información relevante en los campos de la base antes de comenzar el seguimiento. En pocas palabras, <ol><li> Intervalo de tiempo (en segundos) = fold-time-lapse/30 (Por ejemplo, un 1020 × lapso de tiempo sería 1020/30 = 34 seg / marco de intervalo). </li><li> x / y calibración de la medición = m / pixel con la calibración de la imagen del micrómetro. </li><li> z de calibración = 0 (ya que el músculo cremáster de ratón es una capa muy delgada de arrastre de tejidos y células y la migración son aproximadamente 2D en campo brillante transiluminación). </li><li> Buscar tamaño cuadrados para centrar = 1. </li><li> Tamaño de punto / Ancho de línea / Tamaño de fuente: se puede ajustar si es necesario. </li></ol></li><li> Seleccione un punto estable y claro como punto de referencia. Este punto de referencia puede ser cualquier punto estructural claro y pequeño que se mantiene sin cambios y estables a lo largo de todo el experimento. Haga clic en &quot;Añadir pista&quot; para realizar el seguimiento del punto de referencia desde el primero hasta el último fotograma y haga clic en &quot;Track End&quot;. Los datos aparecen en la tabla de resultados de forma automática. </li><li> Seguimiento de rastreo y la migración de neutrófilos, uno por uno: haga clic en &quot;Añadir pista&quot; para hacer un seguimiento de la célula desde su aparición en el tejido a su desaparición en cada fotograma y haga clic en &quot;Track End&quot; para finalizar y guardar los resultados en Microsoft Excel. </li></ol> 4. Análisis de los parámetros de reclutamiento de neutrófilos <ol><li> Abra el archivo de resultados en Microsoft Excel, y analizar los datos (toma los cambios de punto de referencia en el análisis). </li><li> Gatear intraluminal <ol><li> Rastreo distancia: la distancia total de la célula se arrastra en el lumen del sitio adherentes iniciales a la transmigración sitio óptimo (m). </li><li> Rastreo de velocidad: el rastreo a distancia / tiempo (m / min). </li></ol></li><li> Migración transendotelial <ol><li> Tiempo de la transmigración: desde el momento en la célula comienza a transmigrar a través del endotelio a la época en que el cuerpo de célula entera está a las afueras de la vénula y no del cuerpo celular puede ser observado en la luz (minutos o segundos). </li><li> Tiempo de separación: desde el momento en que el cuerpo de célula entera está a las afueras de la vénula (inmediatamente después de la transmigración) hasta el punto de tiempo cuando la célula pierde el contacto con la vénula (se retrae la cola) (min o seg). </li></ol></li><li> Quimiotaxis en el tejido <ol><li> La distancia de migración: la suma de la distancia de la celda se mueve desde el punto de inicio hasta el punto final de la migración en el tejido (m). </li><li> La velocidad de la migración: la migración en el tejido de distancia / tiempo (m / min). </li><li> Distancia de la quimiotaxis: la suma de la distancia de la célula migra en el eje x en el tejido (m). </li><li> La velocidad de la quimiotaxis: quimiotaxis de distancia / tiempo (m / min). </li><li> Quimiotaxis índice: el coeficiente de dividir la distancia de la quimiotaxis de la distancia de migración en el tejido. </li></ol></li></ol> 5. Los resultados representativos: Aunque bightfield microscopía intravital se utiliza para el estudio de las interacciones leucocito-endotelial y pueden no ser necesariamente de los neutrófilos, que confirmó que, por nuestros estudios de histología, más del 95% de las células reclutadas en los neutrófilos tratados quimioatrayente los músculos cremáster eran de hecho los neutrófilos . En este informe, el uso selectivo de neutrófilos quimiotácticos, se presentan los procedimientos de seguimiento del reclutamiento de neutrófilos en vivo. En concreto, se describe un protocolo de seguimiento de rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración transendotelial, y la quimiotaxis en el tejido músculo cremáster en ratones anestesiados utilizando time-lapse video microscopía intravital y ImageJ. El gel de agarosa que contienen chemoattractant en el músculo cremáster libera lentamente quimioatrayente y permite un gradiente quimiotáctico que se establezca en el tejido. Quimiotáctica de neutrófilos induce neutrófilos interacciones célula endotelial en cremastérico vénulas post-capilares en ratones. El experimento se visualiza con un microscopio de campo claro en posición vertical intravital con imágenes de video proyectadas por una cámara de vídeo en color de un monitor de televisión y grabado por una grabadora de vídeo. Se determinó el recuento de neutrófilosgatear intraluminal, la migración y la migración transendotelial y la quimiotaxis en el tejido muscular en respuesta a los neutrófilos chemoattractant MIP-2 y WKYMVm preparados en gel de agarosa (Figura 2). Se encontró que el MIP-2 (a 0,5 M) y WKYMVm (a 0,1 mM) provocó el rastreo intraluminal de neutrófilos a una velocidad similar, la migración de neutrófilos transendotelial y el desprendimiento de la vénula para la longitud de tiempo comparable de la migración de neutrófilos y quimiotaxis en el tejido muscular a casi la misma velocidad y con similares índices de quimiotaxis de neutrófilos (P&gt; 0,05, prueba t de Student). <img src="/files/ftp_upload/3296/3296fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. La representación esquemática de un sistema de microscopía intravital. El músculo cremáster de ratón se exterioriza en el pedestal de una visión clara de la junta del músculo cremáster en platina del microscopio y superfused con 37 ° C, calentado bicarbonato de solución salina tamponada. El microscopio vertical se conecta con una cámara de vídeo CCD color de campo claro microscopía intravital. Un blanco y negro profundo enfriado cámara CCD digital también está conectado al puerto de microscopio de fluorescencia microscopia intravital, las imágenes de las cuales están directamente procesados ​​por un ordenador. <img src="/files/ftp_upload/3296/3296fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Neutrófilos parámetros de contratación de la microscopía de campo claro intravital. El reclutamiento de neutrófilos fue inducida por la liberación gradual de quimioatrayente de neutrófilos MIP-2 o WKYMVm en la preparación de un gel de agarosa 350 micras colocado junto a la vénula postcapilares. El tiempo transcurrido de datos de vídeo fueron analizados por ImageJ después de procesar la grabación de vídeo en tiempo real del experimento. Rastreo de neutrófilos intraluminal (A), el tiempo de la transmigración y el tiempo de separación (B), la velocidad de la migración y la velocidad de la quimiotaxis de los tejidos (C), y el índice de quimiotaxis en el músculo cremáster (D) se determinaron después de la administración de MIP-2 o WKYMVm en gel de agarosa en cremáster muscular en ratones C57BL / 6 (n = 3, N º de células seguimiento = 22 (en A y B) y 27 (en C y D), respectivamente, para MIP-2, y 26 = (en A y B) y 44 ( en C y D), respectivamente, para WKYMVm).

<ol>
	<li>Liu, L., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+leukocyte+recruitment:+organ-specific+mechanisms+of+action.">Molecular mechanisms of leukocyte recruitment: organ-specific mechanisms of action.</a> Thromb. Haemost. 89, 213-220 (2003).</li><li>Petri, B., Phillipson, M., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+leukocyte+recruitment:+an+in+vivo+perspective.">The physiology of leukocyte recruitment: an in vivo perspective.</a> J. Immunol. 180, 6439-6446 (2008).</li><li>Phillipson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraluminal+crawling+of+neutrophils+to+emigration+sites:+a+molecularly+distinct+process+from+adhesion+in+the+recruitment+cascade.">Intraluminal crawling of neutrophils to emigration sites: a molecularly distinct process from adhesion in the recruitment cascade.</a> J. Exp. Med. 203, 2569-2575 (2006).</li><li>Wong, C. H., Heit, B., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulators+of+leucocyte+chemotaxis+during+inflammation.">Molecular regulators of leucocyte chemotaxis during inflammation.</a> Cardiovasc. Res. 86, 183-191 (2010).</li><li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research:+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations.">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li><li>Bullen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+imaging+techniques+for+drug+discovery.">Microscopic imaging techniques for drug discovery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).</li><li>Hazelwood, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entering+the+Portal:+Understanding+the+Digital+Image+Recorded+Through+a+Microscope.">Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope.</a> Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).</li><li>Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-selectin+facilitates+emigration+and+extravascular+locomotion+of+leukocytes+during+acute+inflammatory+responses+in+vivo.">L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo.</a> J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).</li><li>Cara, D. C., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+as+a+tool+for+studying+recruitment+and+chemotaxis.">Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).</li><li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSP1+is+an+endothelial+gatekeeper+of+leukocyte+transendothelial+migration.">LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration.</a> J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).</li><li>Heit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+accelerates,+but+is+not+required+for,+neutrophil+chemotaxis+to+fMLP.">PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP.</a> J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Microscopia intravital es la herramienta esencial para revelar los mecanismos celulares y moleculares de reclutamiento de leucocitos durante la inflamación. Visualización para la determinación cuantitativa de las interacciones leucocito-endotelial en la microvasculatura de los tejidos translúcidos como el músculo cremáster y mesenterio sigue siendo el estándar de oro para la aplicación de la técnica de 1,5. La microscopía de campo claro intravital convencional tiene muchas características técnicas...

Tabla: Materiales, reactivos y equipos específicos <table border="1"><tr><td> Nombre del reactivo / equipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Tubo de polietileno, PE10 </td><td> Becton Dickinson </td><td> 427401 </td><td> ID 0.28mm x 0.61mm OD </td></tr><tr><td> Tinta china </td><td> Speedball Arte </td><td> Super Negro </td><td> 100% de pigmento negro de humo no colorantes </td></tr><tr><td> Cauterización </td><td> Aaron Médico </td><td> AA03 </td><td></td></tr><tr><td> Xilazina </td><td> Bayer HealthCare, Bayer Inc. </td><td> DIN 02169592 </td><td></td></tr><tr><td> El clorhidrato de ketamina </td><td> Bioniche Animal Health Canada, Inc. </td><td> DIN 01989529 </td><td></td></tr><tr><td> MIP-2 recombinante murino </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 452-M2 </td><td></td></tr><tr><td> WKYMVm </td><td> Phoenix Pharmaceuticals, Inc. </td><td> 072-12 </td><td></td></tr><tr><td> Agarosa </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-027 </td><td> Ultrapura </td></tr><tr><td> Heparina </td><td> Sigma </td><td> H-3393 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio vertical </td><td> Olimpo </td><td> BX61WI </td><td></td></tr><tr><td> Color 3CCD cámara de vídeo </td><td> SONY </td><td> DXC-990 </td><td></td></tr><tr><td> HD-DVD grabador de vídeo </td><td> LG Electronics Inc. </td><td> RH398H-M </td><td></td></tr><tr><td> Monitor de TV </td><td> LG Electronics Inc. </td><td> 22LG30 </td><td></td></tr><tr><td> Agua circulante </td><td> Thermo Scientific </td><td> HAAKE DC10 </td><td></td></tr><tr><td> Bomba peristáltica </td><td> Gilson, Pharmacia </td><td> Gilson MINIPULS 3; Pharmacia P-3 </td><td></td></tr><tr><td> Cremaster bordo del músculo </td><td> Universidad de Saskatchewan </td><td></td><td> Hecho en casa </td></tr></table>

tracking neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in tissue by intravital video microscopy

El reclutamiento de leucocitos circulantes del torrente sanguíneo al tejido inflamado es un proceso crucial y compleja de 1,2 inflamación. En las vénulas postcapilares de tejido inflamado, leucocitos inicialmente cuerda y rodar sobre la superficie luminal de la pared venular. Rolling arresto leucocitos en el endotelio y se someten a la adhesión firme en respuesta a quimioquinas o quimiotácticos otros en la superficie venular. Muchos leucocitos adherentes trasladarse desde el sitio inicial de la adhesión al lugar de la extravasación de la unión en el endotelio, un proceso denominado intraluminal arrastrándose 3. Después de gatear, los leucocitos se mueven a través del endotelio (transmigración) y migran en el tejido extravascular hacia la fuente de quimioatrayente (quimiotaxis) 4. Microscopia intravital es una poderosa herramienta para la visualización de las interacciones leucocito-endotelial de células in vivo y revelar los mecanismos celulares y moleculares de reclutamiento de leucocitos 2,5. En este informe, se presenta una descripción completa de la utilización de la microscopía intravital campo claro para visualizar y determinar los procesos detallados de reclutamiento de neutrófilos en el ratón músculo cremáster en respuesta a la pendiente de un quimioatrayente de neutrófilos. Para inducir el reclutamiento de neutrófilos, un pequeño trozo de gel de agarosa (~ 1 mm de tamaño 3) con recuento de neutrófilos chemoattractant MIP-2 (CXCL2, una quimiocina CXC) o WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, un análogo sintético del péptido bacteriano) se coloca en el tejido muscular adyacente a la vénula postcapilares observado. Con el tiempo transcurrido fotografía de vídeo y el ordenador el software ImageJ, el rastreo de neutrófilos intraluminal en el endotelio, la migración de neutrófilos y transendotelial la migración y la quimiotaxis de los tejidos se visualizan y seguimiento. Este protocolo permite a los análisis cuantitativos y fiables de muchos parámetros de reclutamiento de neutrófilos, tales como la velocidad de rastreo intraluminal, el tiempo de la transmigración, el tiempo de separación, la velocidad de la migración, la velocidad de la quimiotaxis y el índice de quimiotaxis en el tejido. Se demuestra que el uso de este protocolo, estos parámetros el reclutamiento de neutrófilos puede ser estable y determinado la locomoción sola célula convenientemente seguimiento en vivo.

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Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

Se describe un protocolo de la microscopía de campo claro intravital para medir la dinámica de los neutrófilos interacciones célula endotelial durante el reclutamiento de neutrófilos en respuesta a la fuente de un quimioatrayente de neutrófilos en vivo. Rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración y la quimiotaxis transendotelial en tejido de ratón músculo cremáster se visualizan con la fotografía de vídeo de tiempo transcurrido y el seguimiento con ImageJ.

Seguimiento de Rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración transendotelial y la quimiotaxis de los tejidos por microscopía de vídeo intravital

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

tracking-neutrophil-intraluminal-crawling-transendothelial-migration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.5K vistas.  University of Saskatchewan. Se describe un protocolo de la microscopía de campo claro intravital para medir la dinámica de los neutrófilos interacciones célula endotelial durante el reclutamiento de neutrófilos en respuesta a la fuente de un quimioatrayente de neutrófilos en vivo. Rastreo de neutrófilos intraluminal, la migración y la quimiotaxis transendotelial en tejido de ratón músculo cremáster se visualizan con la fotografía de vídeo de tiempo transcurrido y el seguimiento con Imag...

Video: Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them intracellularly when their antimicrobial granules fuse with the phagosome. We found that neutrophils have an additional way of killing microorganisms: upon activation, they release granule proteins and chromatin that together form extracellular fibers that bind pathogens. These novel structures, or Neutrophil Extracellular Traps (NETs), degrade virulence factors and kill bacteria1, fungi2 and parasites3. The structural backbone of NETs is DNA, and they are quickly degraded in the presence of DNases. Thus, bacteria expressing DNases are more virulent4. Using correlative microscopy combining TEM, SEM, immunofluorescence and live cell imaging techniques, we could show that upon stimulation, the nuclei of neutrophils lose their shape and the eu- and heterochromatin homogenize. Later, the nuclear envelope and the granule membranes disintegrate allowing the mixing of NET components. Finally, the NETs are released as the cell membrane breaks. This cell death program (NETosis) is distinct from apoptosis and necrosis and depends on the generation of Reactive Oxygen Species by NADPH oxidase5. 
Neutrophil extracellular traps are abundant at sites of acute inflammation. NETs appear to be a form of innate immune response that bind microorganisms, prevent them from spreading, and ensure a high local concentration of antimicrobial agents to degrade virulence factors and kill pathogens thus allowing neutrophils to fulfill their antimicrobial function even beyond their life span. There is increasing evidence, however, that NETs are also involved in diseases that range from auto-immune syndromes to infertility6.
We describe methods to isolate Neutrophil Granulocytes from peripheral human blood7 and stimulate them to form NETs. Also we include protocols to visualize the NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are an important innate immune mechanism to fight pathogenic bacteria, fungi and parasites. Here we describe methods to isolate neutrophil granulocytes from human blood and to activate them to form NETs. We present preparation techniques to visualize NETs in light and electron microscopy.

Las trampas de neutrófilos extracelular: Cómo generar y visualizarlas

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Investigación

Inmunología e Infección

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

Microscopia intravital de los ganglios linfáticos inguinales

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

In vitro Ensayo de cocultivo para evaluar la migración transepitelial de neutrófilos inducida por patógenos

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. During infection of the urinary bladder, polymorphonuclear leukocytes (PMN; neutrophils) migrate from the bloodstream and traverse the bladder epithelium. Failure to resolve infection in the absence of a neutrophilic response demonstrates the importance of PMN in bladder defense. To facilitate colonization of the bladder epithelium, uropathogenic Escherichia coli (UPEC), the causative agent of the majority of urinary tract infections (UTIs), dampen the acute inflammatory response using a variety of partially defined mechanisms. To further investigate the interplay between host and bacterial pathogen, we developed an in vitro model of this aspect of the innate immune response to UPEC. In the transuroepithelial neutrophil migration assay, a variation on the Boyden chamber, cultured bladder epithelial cells are grown to confluence on the underside of a permeable support. PMN are isolated from human venous blood and are applied to the basolateral side of the bladder epithelial cell layers. PMN migration representing the physiologically relevant basolateral-to-apical direction in response to bacterial infection or chemoattractant molecules is enumerated using a hemocytometer. This model can be used to investigate interactions between UPEC and eukaryotic cells as well as to interrogate the molecular requirements for the traversal of bladder epithelia by PMN. The transuroepithelial neutrophil migration model will further our understanding of the initial inflammatory response to UPEC in the bladder.

We developed an in vitro model that mimics an important component of the acute inflammatory response during infection of the bladder with uropathogenic Escherichia coli. The transuroepithelial neutrophil migration assay enables quantitative assessment of human neutrophil migration across bladder epithelia, cultured on permeable supports, in response to bacterial infection or chemoattractant substances.

Evaluación cuantitativa de neutrófilo humano migración a través de una vejiga cultivada Epitelio

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Muy resuelto Microscopía intravital rayas-iluminación de centros germinales

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Imaging neutrófilos y monocitos en mesentérica venas por Microscopia intravital en ratones anestesiados en Tiempo Real

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that enhances the phagocytic functionality of neutrophils. Although extensive studies have unveiled the existence and importance of neutrophil priming during infection and injury, means of visualizing this process in vivo have been unavailable. The protocol provided enables monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals by combining three methodologies: 1) DsRed reporter signal &#8212; used as a measure of priming 2) in vivo neutrophil labeling &#8212; achieved by injection of fluorescence-conjugated anti-lymphocyte antigen 6G (Ly6G) monoclonal antibody (mAb) and 3) intravital confocal imaging. Several critical steps are involved in this protocol: oxazolone-induced mouse ear skin inflammation, appropriate sedation of animals, repeated injections of anti-Ly6G mAb, and prevention of focus drift during imaging. Although a few limitations have been observed, such as the limit of continuous imaging time (~ 8 hr) in one mouse and the leakage of fluorescein isothiocyanate-dextran from blood vessels in the inflammatory state, this protocol provides a fundamental framework for intravital imaging of primed neutrophil behavior and function, which can easily be expanded to examination of other immune cells in mouse inflammation models.

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&amp;#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

Imaging intravital de neutrófilos Cebado El uso de IL-1 promotor impulsado reportero ratones DsRed

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil migration and chemotaxis owing to their advantages in real-time visualization, precise control of chemical concentration gradient generation, and reduced reagent and sample consumption. Recently, a growing effort has been made by the microfluidic researchers toward developing integrated and easily operated microfluidic chemotaxis analysis systems, directly from whole blood. In this direction, the first all-on-chip method was developed for integrating the magnetic negative purification of neutrophils and the chemotaxis assay from small blood volume samples. This new method permits a rapid sample-to-result neutrophil chemotaxis test in 25 min. In this paper, we provide detailed construction, operation and data analysis method for this all-on-chip chemotaxis assay with a discussion on troubleshooting strategies, limitations and future directions. Representative results of the neutrophil chemotaxis assay testing a defined chemoattractant, N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), and sputum from a chronic obstructive pulmonary disease (COPD) patient, using this all-on-chip method are shown. This method is applicable to many cell migration-related investigations and clinical applications.

This article provides the detailed method of performing a rapid neutrophil chemotaxis assay by integrating the on-chip neutrophil isolation from whole blood and the chemotaxis test on a single microfluidic chip.

Un método todo-en-chip para el análisis rápido de la quimiotaxis de neutrófilos directamente de una gota de sangre

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with histones and antimicrobial proteins. Excessive NET formation (NETosis) and citH3 release during sepsis is associated with multiple organ dysfunction and mortality in mice and humans but its implications in dogs are unknown. Herein, we describe a technique to isolate canine neutrophils from whole blood for observation and quantification of NETosis. Leukocyte-rich plasma, generated by dextran sedimentation, is separated by commercially available density gradient separation media and granulocytes collected for cell count and viability testing. To observe real-time NETosis in live neutrophils, cell permeant and cell impermeant fluorescent nucleic acid stains are added to neutrophils activated either by lipopolysaccharide (LPS) or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Changes in nuclear morphology and NET formation are observed over time by fluorescence microscopy. In vitro NETosis is further characterized by co-colocalization of cell-free DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) and citrullinated histone H3 (citH3) using a modified double-immunolabelling protocol. To objectively quantify NET formation and citH3 expression using fluorescence microscopy, NETs and citH3-positive cells are quantified in a blinded manner using available software. This technique is a specific assay to evaluate the in vitro capacity of canine neutrophils to undergo NETosis.

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

We describe methods to isolate canine neutrophils from whole blood and visualize NET formation in live neutrophils using fluorescence microscopy. Also described are protocols to quantify NET formation and citrullinated histone H3 (citH3) expression using immunofluorescence microscopy.

In Vitro Formación de la trampa extracelular neutrófilo canino: Análisis dinámico y cuantitativo por microscopía de fluorescencia

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

Proyección de imagen de interacción de células en Mucosa traqueal durante la infección del Virus de la Influenza usando microscopia Intravital de dos fotones

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...