Este trabalho foi financiado por uma bolsa de investigação da Canadian Institutes of Health Research (CIHR, MOP-86749). L. Liu é um receptor de CIHR New Investigator Award (MSH-95374).

1. Preparação de quimioatraente em gel de agarose <ol><li> Pipeta de 10 mL de 2 × PBS em um tubo cônico de 50 ml, e aquecer o tubo colocando-o em um copo contendo água quente. </li><li> Pipetar 10 mL de água destilada e adicionar 0,4 g de pó de agarose em outro tubo cônico de 50 mL (com a tampa ligeiramente soltos) e aquecer a mistura ferver até ficar em um forno de microondas (por 1 min ~ em um forno de microondas 700-watt) . </li><li> Adicione o aquecido 2 × PBS para a solução de agarose tubo, redemoinho solução mista e mantê-lo aquecido no copo de água quente. </li><li> Micropipeta solução chemoattractant (por exemplo, 10 ml de 0,5 mg de CXC quimiocinas MIP-2 ou 12 mL de uma WKYMVm mM) na tampa de um tubo Eppendorf de 1,5 mL contendo 3 mL de tinta da Índia e misture bem por aspiração utilizando uma micropipeta (evitar bolha de ar). </li><li> Corte a extremidade da ponta de uma pipeta de 200 mL e 110 mL micropipeta de agarose solução (42 ° C) na tampa e imediatamente misture bem utilizando outra ponta da pipeta (evitar bolhas de ar). </li><li> Armazenar o gel chemoattractant contendo a +4 ° C. </li></ol> 2. Preparação de músculo Cremaster para Microscopia intravital (Figura 1) <ol><li> Anestesiar um rato macho adulto por uma injeção ip de uma mistura de xilazina 10 mg / kg e 200 mg de cloridrato / kg cetamina. </li><li> Raspar a área ao longo da veia jugular externa direita e face anterior do escroto com um barbeador elétrico. Após a anestesia, é importante dar atenção e cuidados especiais para o rato anestesiado. A lâmpada de calor pode ser usado para impedir o mouse de hipotermia. O mouse deve estar livre de dor reflexa. </li><li> Faça uma incisão horizontal, encontrar e cateterização da veia jugular utilizando um tubo PE-10 preenchido com solução salina com heparina 100 U / mL. Cateterismo da veia jugular é necessário para a administração de anestésicos e medicamentos adicionais, quando necessário. </li><li> Fixar as pernas traseiras do mouse com fita umbilical com o mouse deitado de barriga para cima em um home-made bordo do músculo cremaster (Figura 1). </li><li> Conectar a placa para um circulador de água 37 ° C para manter o músculo cremaster eo corpo do mouse quente. </li></ol> Nota: Todos os procedimentos 2,6-2,14 deve ser realizada muito gentilmente 5. <ol start="6"><li> Faça uma incisão na pele escrotal para expor o músculo cremaster esquerda. Dissecar cuidadosamente o músculo da fáscia associados. </li><li> Superfuse o músculo cremaster com 37 ° C-aquecido bicarbonato-buffered saline (131,9 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgSO 4, 20 NaHCO 3, em mM, pH 7,4) usando uma bomba peristáltica. </li><li> Amarre uma sutura 4-0 para a extremidade distal do músculo cremaster para segurá-la para baixo sobre o pedestal de vidro clara visualização da placa do músculo cremaster. </li><li> Cauterizar o músculo cremaster longitudinalmente. Com sutura 4-0, mantenha o plano muscular e fixá-lo ao longo das bordas sobre o pedestal. Separar o testículo e epidídimo do músculo subjacente e movê-los para dentro da cavidade abdominal. </li><li> Superfuse o músculo em ~ 0,6 ml / min com o tampão de perfusão 37 ° C-aquecido e cobrir o músculo exposto com uma lamela de vidro 22 × 22 mm. </li><li> Coloque a placa do músculo cremaster no palco microscópio, examine o músculo sob o microscópio, encontrar uma vênula adequado postcapillary (Selecione a vênula que é reto e não ramificados e tem taxa de cisalhamento normal e um diâmetro de 25-40 mm) e ajustar a câmera de vídeo para permitir a vênula para ser visualizado em uma posição vertical em ambos os lados esquerdo ou direito do monitor de TV. </li><li> Após 30 min de equilíbrio, a gravar as imagens de vídeo da vênula selecionados postcapillary por 5 min como dados de base de controle utilizando um gravador de vídeo. </li><li> Parar o superfusão e retire a lamínula sobre o músculo. </li><li> Coloque um ~ 1-3 mm de tamanho gel chemoattractant contendo na superfície do músculo cremaster em uma área pré-selecionadas 350 mM de e paralela à vênula observado postcapillary, adicione lamela para segurar o gel no local e superfuse o tecido muscular em muito ritmo lento (≤ 10 mL / min) para permitir o estabelecimento de um gradiente de chemoattractant que é liberada lentamente e formado a partir do gel. </li><li> Gravar a imagem de vídeo de 90 min após a adição do gel contendo chemoattractant. Durante a gravação, ajustar e manter o foco microscópio sobre a aderir, rastejando, transmigrando e chemotaxing leucócitos dentro da vênula e no tecido muscular. </li><li> Após a experiência, importe o arquivo de vídeo para um computador para análise. </li></ol> 3. Rastreamento de células Usando ImageJ <ol><li> Em um computador, extrair e converter o vídeo para o formato AVI (por exemplo, use software livre bitRipper computador para converter vídeo de DVD para arquivos AVI). </li><li> Use software de edição de vídeo para gerar o filme tempo decorrido. Por exemplo, use o Windows Movie Maker para fazer um filme tempo decorrido (até 1 / 512 ou 1 / 1024 tempo-lapsot taxa de 30 fps) a partir do original, vídeo em tempo real. Converter e salvar o filme tempo decorrido sem compressão de DV-AVI formato. </li><li> Gravar as imagens de um micrômetro de calibração sob o microscópio mesma configuração, importar imagens para o computador, abra as imagens com ImageJ. No ImageJ, o total de pixels aparecem no canto superior esquerdo da tela (por exemplo, 720 × 480 pixels). Medir o tamanho da tela em ambos os eixos X e Y (por exemplo, 200 × 150 mm). A partir daí, calcular o número de pixels por M (por exemplo, x = 720 / 200 = 3,6 pixels / M, e y = 480 / 150 = 3,2 pixels / mm). </li><li> Para importar o filme, abra ImageJ novamente, clique em &quot;File-Import-Usando Movies Quicktime Plug-in&quot;, selecionar o filme a ser analisado e clique em &quot;OK&quot; na interface de &quot;abridor de Filme QT&quot;. </li><li> Clique em &quot;Rastreamento Plugins-Manual&quot; para rastrear células. Preencha as informações relevantes para os campos no fundo antes de iniciar o rastreamento. Brevemente, <ol><li> Intervalo de tempo (em seg) = fold-time-lapse/30 (Por exemplo, um 1020 × lapso de tempo seria 1020-1030 = 34 intervalo de seg / frame). </li><li> x / y = calibração da medição M / pixel usando a calibração da imagem do micrômetro. </li><li> z = 0 calibração (como o mouse músculo cremaster é uma camada extremamente fina de tecidos e células rastejando e migração são aproximadamente 2D sob brilhante-campo transiluminação). </li><li> Pesquisa tamanho quadrado para centrar = 1. </li><li> Dot size / Linha de largura / Tamanho da fonte: eles podem ser ajustados se necessário. </li></ol></li><li> Selecione um ponto estável e claro como um ponto de referência. Este ponto de referência pode ser qualquer ponto claro e pequenas estruturais que permanece inalterado e estável durante todo o experimento. Clique em &quot;Add Track&quot; para rastrear o ponto de referência do primeiro ao último frame e clique em &quot;Track End&quot;. Os dados aparecem na tabela de resultados automaticamente. </li><li> Acompanhar o rastreamento ea migração de neutrófilos, um por um: clique em &quot;Add Track&quot; para rastrear o celular de sua aparência no tecido ao seu desaparecimento em cada quadro e clique em &quot;Track End&quot; para finalizar e salvar os resultados no Microsoft Excel. </li></ol> 4. Análise dos Parâmetros recrutamento de neutrófilos <ol><li> Abra o arquivo de resultados no Microsoft Excel, e analisar os dados (se as mudanças de ponto de referência em análise). </li><li> Rastejando intraluminal <ol><li> Rastreamento de distância: a distância total da célula rasteja no lúmen do site inicial aderente ao site a transmigração ideal (m). </li><li> Crawling velocidade: rastreamento de distância / tempo (mM / min). </li></ol></li><li> Migração transendotelial <ol><li> Transmigração tempo: a partir do momento da célula começa a transmigrar através do endotélio ao tempo em que o corpo da célula toda é apenas fora da vênula e nenhum corpo celular pode ser visto no lúmen (min ou seg.) </li><li> Tempo de descolamento: a partir do momento em que o corpo da célula toda é apenas fora da vênula (imediatamente após a transmigração) para o ponto no tempo quando a célula perde o contato com a vênula (o retrai cauda) (min ou seg.) </li></ol></li><li> Quimiotaxia em tecido <ol><li> Distância de migração: a soma da distância da célula se move a partir do ponto inicial ao ponto final da migração no tecido (mm). </li><li> Velocidade de migração: a distância de migração no tecido / hora (mM / min). </li><li> Quimiotaxia distância: a soma de células a distância migra no eixo-x no tecido (mm). </li><li> Velocidade de quimiotaxia: quimiotaxia distância / tempo (mM / min). </li><li> Quimiotaxia índice: a taxa de dividir a distância quimiotaxia pela distância de migração no tecido. </li></ol></li></ol> 5. Resultados representativos: Embora bightfield microscopia intravital é utilizado para o estudo das interações leucócito-endotélio celular e não podem ser necessariamente para os neutrófilos, que confirmou que, por nossos estudos de histologia, mais de 95% das células recrutadas em neutrófilos tratados com músculos chemoattractant cremaster foram de fato neutrófilos . Neste relatório, usando neutrófilos seletivo quimioatrativos, apresentamos os procedimentos de monitoramento do recrutamento de neutrófilos in vivo. Especificamente, nós descrevemos um protocolo de rastreamento rastreamento de neutrófilos intraluminal, a migração transendotelial, e quimiotaxia em cremaster tecido muscular em ratos anestesiados com lapso de tempo de microscopia intravital de vídeo e ImageJ. O chemoattractant contendo gel agarose no músculo cremaster libera lentamente chemoattractant e permite um gradiente chemoattractant a ser estabelecida no tecido. Chemoattractant neutrófilos induz interações neutrófilos-célula endotelial em cremastérico vênulas pós-capilares em camundongos. Todo o experimento é visualizado sob um microscópio de campo claro vertical intravital com imagens de vídeo projetadas por uma câmera de vídeo de cor para um monitor de TV e gravado por um gravador de vídeo. Nós determinamos os neutrófilosrastejando intraluminal, a migração transendotelial e migração e quimiotaxia em tecido muscular em resposta à neutrófilos chemoattractant MIP-2 e WKYMVm preparada em gel de agarose (Figura 2). Descobrimos que MIP-2 (0,5 mM) e WKYMVm (0,1 mM) provocou rastejando intraluminal de neutrófilos em velocidade similar, a migração de neutrófilos transendotelial e desprendimento da vênula de comprimento comparável de tempo, a migração de neutrófilos e quimiotaxia no tecido muscular em quase a mesma velocidade e com índices similares quimiotaxia de neutrófilos (P&gt; 0,05, teste t de Student). <img src="/files/ftp_upload/3296/3296fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. A ilustração esquemática de um sistema de microscópio intravital. O mouse músculo cremaster é exteriorizado no pedestal visualização clara de cremaster bordo muscular no palco microscópio e superfused com 37 ° C-aquecido bicarbonato tampão salina. O microscópio na posição vertical é conectado com uma câmera de vídeo CCD de cor para brightfield microscopia intravital. A profunda monocromática CCD refrigerado a câmera digital também é conectado à porta microscópio de fluorescência para microscopia intravital, as imagens a partir do qual são diretamente processados ​​por um computador. <img src="/files/ftp_upload/3296/3296fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Neutrófilos parâmetros recrutamento de brightfield microscopia intravital. Recrutamento de neutrófilos foi induzida pela liberação gradual de chemoattractant neutrófilos MIP-2 ou WKYMVm na preparação gel agarose colocados 350 mM adjacente à vênula postcapillary. Tempo decorrido dados de vídeo foram analisadas pelo ImageJ após o processamento da gravação de vídeo em tempo real do experimento. Neutrófilos rastejando intraluminal (A), o tempo de transmigração e tempo de descolamento (B), velocidade de migração e velocidade de quimiotaxia em tecido (C), e índice de quimiotaxia em cremaster muscular (D) foram determinados após a administração de MIP-2 ou agarose gel em WKYMVm cremaster muscular em camundongos C57BL / 6 (n = 3, # de células rastreado = 22 (em A e B) e 27 (em C e D), respectivamente, para MIP-2, e = 26 (em A e B) e 44 ( em C e D), respectivamente, para WKYMVm).

<ol>
	<li>Liu, L., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+leukocyte+recruitment:+organ-specific+mechanisms+of+action.">Molecular mechanisms of leukocyte recruitment: organ-specific mechanisms of action.</a> Thromb. Haemost. 89, 213-220 (2003).</li><li>Petri, B., Phillipson, M., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+leukocyte+recruitment:+an+in+vivo+perspective.">The physiology of leukocyte recruitment: an in vivo perspective.</a> J. Immunol. 180, 6439-6446 (2008).</li><li>Phillipson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraluminal+crawling+of+neutrophils+to+emigration+sites:+a+molecularly+distinct+process+from+adhesion+in+the+recruitment+cascade.">Intraluminal crawling of neutrophils to emigration sites: a molecularly distinct process from adhesion in the recruitment cascade.</a> J. Exp. Med. 203, 2569-2575 (2006).</li><li>Wong, C. H., Heit, B., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulators+of+leucocyte+chemotaxis+during+inflammation.">Molecular regulators of leucocyte chemotaxis during inflammation.</a> Cardiovasc. Res. 86, 183-191 (2010).</li><li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research:+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations.">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li><li>Bullen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+imaging+techniques+for+drug+discovery.">Microscopic imaging techniques for drug discovery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).</li><li>Hazelwood, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entering+the+Portal:+Understanding+the+Digital+Image+Recorded+Through+a+Microscope.">Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope.</a> Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).</li><li>Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-selectin+facilitates+emigration+and+extravascular+locomotion+of+leukocytes+during+acute+inflammatory+responses+in+vivo.">L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo.</a> J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).</li><li>Cara, D. C., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+as+a+tool+for+studying+recruitment+and+chemotaxis.">Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).</li><li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSP1+is+an+endothelial+gatekeeper+of+leukocyte+transendothelial+migration.">LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration.</a> J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).</li><li>Heit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+accelerates,+but+is+not+required+for,+neutrophil+chemotaxis+to+fMLP.">PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP.</a> J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Microscopia intravital é a ferramenta essencial para revelar os mecanismos celulares e moleculares do recrutamento de leucócitos durante a inflamação. Visualização quantitativa para a determinação das interações leucócito-endotélio celular na microvasculatura de tecidos translúcido como o músculo cremaster e mesentério continua sendo o padrão ouro para a aplicação da técnica 1,5. A microscopia intravital convencionais brightfield tem muitas características únicas técnicas e os mecanismos...

Tabela: materiais, reagentes e equipamentos específicos <table border="1"><tr><td> Nome do reagente / equipamentos </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Tubos de polietileno, PI10 </td><td> Becton Dickinson </td><td> 427401 </td><td> ID 0,28 milímetros × 0,61 milímetros OD </td></tr><tr><td> Nanquim </td><td> Speedball Art </td><td> Super Preto </td><td> Pigmentos de carbono não 100% preto corantes </td></tr><tr><td> Cautério </td><td> Aaron Medical </td><td> AA03 </td><td></td></tr><tr><td> Xilazina </td><td> Bayer HealthCare, Bayer Inc. </td><td> DIN 02169592 </td><td></td></tr><tr><td> Cloridrato de cetamina </td><td> Bioniche Animal Health Canada, Inc. </td><td> DIN 01989529 </td><td></td></tr><tr><td> MIP-2 recombinante murino </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 452-M2 </td><td></td></tr><tr><td> WKYMVm </td><td> Phoenix Pharmaceuticals, Inc. </td><td> 072-12 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-027 </td><td> Ultrapura </td></tr><tr><td> Heparina </td><td> Sigma </td><td> H-3393 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio vertical </td><td> Olimpo </td><td> BX61WI </td><td></td></tr><tr><td> Câmera de vídeo 3CCD cor </td><td> SONY </td><td> DXC-990 </td><td></td></tr><tr><td> HD-DVD gravador de vídeo </td><td> LG Electronics Inc. </td><td> RH398H-M </td><td></td></tr><tr><td> Monitor de TV </td><td> LG Electronics Inc. </td><td> 22LG30 </td><td></td></tr><tr><td> Circulador de água </td><td> Thermo Scientific </td><td> DC10 HAAKE </td><td></td></tr><tr><td> Bomba peristáltica </td><td> Gilson; Pharmacia </td><td> Gilson MINIPULS 3; Pharmacia P-3 </td><td></td></tr><tr><td> Cremaster bordo muscular </td><td> Universidade de Saskatchewan </td><td></td><td> Home-made </td></tr></table>

tracking neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in tissue by intravital video microscopy

O recrutamento de leucócitos circulantes do fluxo de sangue para o tecido inflamado é um processo crucial e complexa de 1,2 inflamação. No vênulas pós-capilares do tecido inflamado, leucócitos inicialmente tether and roll na superfície luminal da parede venular. Rolando prisão leucócitos no endotélio e passam por adesão firme em resposta a quimiocina ou quimioatrativos outros na superfície venular. Muitos leucócitos aderentes mudar a partir do site inicial de adesão ao site extravasamento juncional no endotélio, um processo denominado intraluminal rastejando 3. Após rastreamento, os leucócitos movem-se através do endotélio (transmigração) e migrar no tecido extravascular em direção à fonte de chemoattractant (quimiotaxia) 4. Microscopia intravital é uma ferramenta poderosa para a visualização de interações leucócito-endotélio celular in vivo e revelando os mecanismos celulares e moleculares do recrutamento de leucócitos 2,5. Neste relatório, nós fornecemos uma descrição completa do uso de microscopia intravital brightfield de visualizar e determinar os processos detalhados de recrutamento de neutrófilos em camundongos músculo cremaster em resposta ao gradiente de uma chemoattractant neutrófilos. Para induzir o recrutamento de neutrófilos, um pequeno pedaço de gel de agarose (~ 1-3 mm de tamanho) contendo chemoattractant neutrófilos MIP-2 (CXCL2, uma quimiocina CXC) ou WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-Met-D, um análogo sintético de peptídeo bacteriana) é colocado no tecido muscular adjacente à vênula observado postcapillary. Com o tempo decorrido, fotografia, vídeo e computador software ImageJ, neutrófilos no endotélio rastejando intraluminal, a migração de neutrófilos e transendotelial a migração e quimiotaxia em tecido são visualizados e monitorados. Este protocolo permite a análise quantitativa confiável e de muitos parâmetros, tais como o recrutamento de neutrófilos velocidade rastejando intraluminal, o tempo de transmigração, tempo de descolamento, a velocidade de migração, a velocidade de quimiotaxia e índice de quimiotaxia em tecido. Nós demonstramos que a utilização deste protocolo, estes parâmetros recrutamento de neutrófilos pode ser determinado e de forma estável a locomoção única célula convenientemente monitorados in vivo.

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Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

Nós descrevemos um protocolo de brightfield microscopia intravital para medir a dinâmica interações neutrófilos-célula endotelial durante o recrutamento de neutrófilos em resposta à fonte de um chemoattractant neutrófilos in vivo. Neutrófilos rastejando intraluminal, a migração transendotelial e quimiotaxia em tecido muscular do rato cremaster são visualizados com o tempo decorrido, fotografia, vídeo e rastreados com ImageJ.

Rastreamento Crawling neutrófilos Intraluminal, migração transendotelial e Quimiotaxia em tecido por Microscopia intravital Vídeo

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

tracking-neutrophil-intraluminal-crawling-transendothelial-migration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.6K visualizações.  University of Saskatchewan. Nós descrevemos um protocolo de brightfield microscopia intravital para medir a dinâmica interações neutrófilos-célula endotelial durante o recrutamento de neutrófilos em resposta à fonte de um chemoattractant neutrófilos in vivo. Neutrófilos rastejando intraluminal, a migração transendotelial e quimiotaxia em tecido muscular do rato cremaster são visualizados com o tempo decorrido, fotografia, vídeo e rastreados com ImageJ.

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Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Não-invasiva por imagem do Homing leucócitos e Migração In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Imunologia e Infecção

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Isolamento de Células endoteliais da veia umbilical humana e sua utilização no estudo de transmigração de Neutrófilos sob condições de fluxo

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

In vitro Ensaio de cocultura para avaliar migração trans epitelial de neutrófilo induzida por patógenos

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. During infection of the urinary bladder, polymorphonuclear leukocytes (PMN; neutrophils) migrate from the bloodstream and traverse the bladder epithelium. Failure to resolve infection in the absence of a neutrophilic response demonstrates the importance of PMN in bladder defense. To facilitate colonization of the bladder epithelium, uropathogenic Escherichia coli (UPEC), the causative agent of the majority of urinary tract infections (UTIs), dampen the acute inflammatory response using a variety of partially defined mechanisms. To further investigate the interplay between host and bacterial pathogen, we developed an in vitro model of this aspect of the innate immune response to UPEC. In the transuroepithelial neutrophil migration assay, a variation on the Boyden chamber, cultured bladder epithelial cells are grown to confluence on the underside of a permeable support. PMN are isolated from human venous blood and are applied to the basolateral side of the bladder epithelial cell layers. PMN migration representing the physiologically relevant basolateral-to-apical direction in response to bacterial infection or chemoattractant molecules is enumerated using a hemocytometer. This model can be used to investigate interactions between UPEC and eukaryotic cells as well as to interrogate the molecular requirements for the traversal of bladder epithelia by PMN. The transuroepithelial neutrophil migration model will further our understanding of the initial inflammatory response to UPEC in the bladder.

We developed an in vitro model that mimics an important component of the acute inflammatory response during infection of the bladder with uropathogenic Escherichia coli. The transuroepithelial neutrophil migration assay enables quantitative assessment of human neutrophil migration across bladder epithelia, cultured on permeable supports, in response to bacterial infection or chemoattractant substances.

Avaliação quantitativa de neutrófilos humanos migração através de um Cultivadas bexiga Epitélio

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

Imagens em tempo real de endoteliais junções célula-célula durante Neutrophil Transmigração Sob Fisiológica Fluxo

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Imagiologia neutrófilos e monócitos em Mesenteric Veins por Microscopia intravital em ratos anestesiados em Tempo Real

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that enhances the phagocytic functionality of neutrophils. Although extensive studies have unveiled the existence and importance of neutrophil priming during infection and injury, means of visualizing this process in vivo have been unavailable. The protocol provided enables monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals by combining three methodologies: 1) DsRed reporter signal &#8212; used as a measure of priming 2) in vivo neutrophil labeling &#8212; achieved by injection of fluorescence-conjugated anti-lymphocyte antigen 6G (Ly6G) monoclonal antibody (mAb) and 3) intravital confocal imaging. Several critical steps are involved in this protocol: oxazolone-induced mouse ear skin inflammation, appropriate sedation of animals, repeated injections of anti-Ly6G mAb, and prevention of focus drift during imaging. Although a few limitations have been observed, such as the limit of continuous imaging time (~ 8 hr) in one mouse and the leakage of fluorescein isothiocyanate-dextran from blood vessels in the inflammatory state, this protocol provides a fundamental framework for intravital imaging of primed neutrophil behavior and function, which can easily be expanded to examination of other immune cells in mouse inflammation models.

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

Imagem intravital de neutrófilos Priming Usando IL-1-driven promotor DsRed Mice Reporter

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

Time-lapse Imaging of Mouse Macrophage Chemotaxis

Chemotaxis is receptor-mediated guidance of cells along a chemical gradient, whereas chemokinesis is the stimulation of random cell motility by a chemical. Chemokinesis and chemotaxis are fundamental for the mobilization and deployment of immune cells. For example, chemokines (chemotactic cytokines) can rapidly recruit circulating neutrophils and monocytes to extravascular sites of inflammation. Chemoattractant receptors belong to the large family of G protein-coupled receptors. How chemoattractant (i.e., ligand) gradients direct cell migration via G protein-coupled receptor signaling is not yet fully understood. In the field of immunology, neutrophils are popular model cells for studying chemotaxis in vitro. Here we describe a real-time two-dimensional (2D) chemotaxis assay tailored for mouse resident macrophages, which have traditionally been more difficult to study. Macrophages move at a slow pace of ~1 &#181;m/min on a 2D surface and are less well suited for point-source migration assays (e.g., migration towards the tip of a micropipette filled with chemoattractant) than neutrophils or Dictyostelium discoideum, which move an order of magnitude faster. Widely used Transwell assays are useful for studying the chemotactic activity of different substances, but do not provide information on cell morphology, velocity, or chemotactic navigation. Here we describe a time-lapse microscopy-based macrophage chemotaxis assay that allows quantification of cell velocity and chemotactic efficiency and provides a platform to delineate the transducers, signal pathways, and effectors of chemotaxis.

Here we describe methods using time-lapse, phase-contrast microscopy to image mouse resident peritoneal macrophages in a chemotactic complement C5a gradient. The protocols can be extended to other immune cells.

Imagem em lapso de tempo de Quimioterapia de Macrophage mouse

Chemotaxis is receptor-mediated guidance of cells along a chemical gradient, whereas chemokinesis is the stimulation of random cell motility by a ...

Elucidando a cinética das células T: métodos para análise de migração em tempo real

Real-Time In Vitro Migration Assay for Primary Murine CD8+ T Cells

The adaptive immune response is reliant on a T cell&#39;s ability to migrate through blood, lymph, and tissue&#160;in response to pathogens and foreign bodies. T cell migration is a complex process that requires the coordination of many signal inputs from the environment and local immune cells, including chemokines, chemokine receptors, and adhesion molecules. Furthermore, T cell motility is influenced by dynamic surrounding environmental cues, which can alter activation state, transcriptional landscape, adhesion molecule expression, and more. In vivo, the complexity of these seemingly intertwined factors makes it difficult to distinguish individual signals that contribute to T cell migration. This protocol provides a string of methods from T cell isolation to computer-aided analysis to assess T cell migration in real-time&#160;under highly specific environmental conditions.&#160;These conditions&#160;may help&#160;elucidate mechanisms that regulate migration, improving our&#160;understanding of T cell kinetics and providing&#160;strong mechanistic evidence that is difficult&#160;to attain through animal experiments. A deeper understanding of the&#160;molecular interactions that impact cell&#160;migration is important to develop improved therapeutics.

Autor em destaque: Compreendendo os mecanismos da doença por meio da análise em tempo real da migração de células T

This protocol providesa method of primary murine T cell isolation and time-lapse microscopy of T cell migration under specific environmental conditions with quantitative analysis.

Ensaio de migração in vitro em tempo real para células T CD8+ murinas primárias

The adaptive immune response is reliant on a T cell&#39;s ability to migrate through blood, lymph, and tissue&#160;in response to pathogens and foreign ...

Rastreamento Crawling neutrófilos Intraluminal, migração transendotelial e Quimiotaxia em tecido por Microscopia intravital Vídeo

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Não-invasiva por imagem do Homing leucócitos e Migração In vivo

Isolamento de Células endoteliais da veia umbilical humana e sua utilização no estudo de transmigração de Neutrófilos sob condições de fluxo

In vitro Ensaio de cocultura para avaliar migração trans epitelial de neutrófilo induzida por patógenos

Avaliação quantitativa de neutrófilos humanos migração através de um Cultivadas bexiga Epitélio

Imagens em tempo real de endoteliais junções célula-célula durante Neutrophil Transmigração Sob Fisiológica Fluxo

Imagiologia neutrófilos e monócitos em Mesenteric Veins por Microscopia intravital em ratos anestesiados em Tempo Real

Imagem intravital de neutrófilos Priming Usando IL-1-driven promotor DsRed Mice Reporter

Imagem em lapso de tempo de Quimioterapia de Macrophage mouse

Ensaio de migração in vitro em tempo real para células T CD8+ murinas primárias

Ensaio de migração in vitro em tempo real para células T CD8+ murinas primárias