Tradicionalmente, los macrófagos han sido difíciles de estudiar en ensayos de quimiotaxis en tiempo real porque las células se mueven lentamente. Este protocolo proporciona un medio para imaginar macrofagos migrando en un gradiente quimiotáctico durante un máximo de seis horas o más. En comparación con los ensayos de implantes como los ensayos de transferencia, esta técnica tiene las ventajas de que se puede observar la morfología de los macrófagos, y se pueden medir parámetros como la velocidad celular y la eficiencia quimiotáctica.
Los macrófagos están involucrados en muchas enfermedades inflamatorias, y esta técnica puede ser útil para estudiar fármacos diseñados para inhibir la quimiotaxis. También se puede aplicar a otros tipos de células como monocitos humanos. Al intentar esta técnica por primera vez, es mejor practicar el llenado de las cámaras de quimiotaxis antes de trabajar con las células.
Uno de los aspectos más importantes de la técnica es evitar burbujas de aire. Comience rellenando previamente los canales de conexión de una o dos diapositivas de quimiotaxis con RPMI 1640 HEPES Medium modificado preparados según las instrucciones del manuscrito. Coloque un portaobjetos en un plato de cultivo celular y coloque el plato en un bloque de aluminio calentado a 37 grados centígrados.
A continuación, inserte los enchufes en los puertos uno y cuatro. Utilice una punta de tubo biselado de 200 microlitros para depositar 15 microlitros del rpmI 1640 HEPES Medium modificado en el puerto de llenado tres. A continuación, inserte la punta de la tubería en el puerto dos y aspire 15 microlitros a una velocidad moderadamente rápida, que precarreará el canal de conexión, así como los dos canales de suministro de flanqueo.
Cubra los puertos de llenado dos y tres con tapas y coloque el portaobjetos de quimiotaxis en un bastidor en una cámara de humedad cerrada dentro de una incubadora seca y libre de dióxido de carbono a 37 grados centígrados. Para aislar los macrófagos, inserte un catéter plástico de calibre 24 en la cavidad peritoneal de un ratón sacrificado de tres a cuatro meses de edad, y use una jeringa de plástico de cinco mililitros para la lavado de la cavidad con la solución de sal amortiguada de Hank fría sin calcio ni magnesio. Después de recoger el medio lavado en un tubo, centrifugarlo a 300 veces G durante 6,5 minutos.
Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 200 microlitros de RPMI 1640 medio modificado. Diluir una alícuota de las células suspensión de uno a 20. A continuación, utilice un dispositivo de conteo para contar las celdas.
Diluir las células a una concentración final de 10 veces 10 a las seis células por mililitro, y mantenerlas a 37 grados Celsius en un bloque de aluminio calentado. Pipetee la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo cinco veces para reducir el aglutinamiento, y deposite suavemente 10 microlitros en el puerto tres de la cámara de quimiotaxis. Coloque la punta de la tubería en el puerto dos y dibuje lentamente la suspensión de la celda en el canal de conexión.
Tan pronto como se haya introducido la suspensión celular, retire los enchufes en los puertos uno y cuatro para detener el flujo y coloque las tapas en los cuatro puertos de llenado. A continuación, coloque los toboganes de quimiotaxis en la cámara de humedad de 37 grados Celsius durante dos a tres horas. Inspeccione el área de observación con un microscopio invertido.
A continuación, coloque los enchufes en los puertos de llenado uno y dos, y compruebe si el puerto de llenado tres se llena en la parte superior con medio y libre de burbujas de aire. Si es necesario, utilice una aguja de jeringa estéril de calibre 27 para desalojar las burbujas de aire. A continuación, aspirar 60 microlitros de medio con una pipeta mecánica de 100 microlitros, y colocar la punta en el puerto de llenado tres.
Utilice el anillo de ajuste de volumen para inyectar lenta y constantemente el medio en el depósito hasta que llegue a la parte superior del puerto de llenado cuatro después de uno a dos minutos. Para llenar el segundo depósito, mueva el enchufe desde el puerto uno e insértelo lentamente en el puerto tres. Aspirar 50 microlitros de medio, y colocar la punta de la tubería en el puerto cuatro, e inyectar lentamente el medio en el segundo depósito para que llegue a la parte superior del puerto de llenado uno después de uno a dos minutos.
Agregue 495 microlitros de tubo de micro centrífuga de medio a dos mililitros, y agregue cinco microlitros de patente azul cinco. Vórtice brevemente la mezcla, luego agregue 5,4 microlitros de ratón recombinante Complement C5a y vórtice de nuevo para mezclar. Asegúrese de que la depresión poco profunda en la parte superior del puerto uno es medio-libre, y depositar 15 microlitros del medio azul suplemento C5a que contiene.
A continuación, inserte una punta de pipeta de 200 microlitros en el puerto de llenado cuatro, y gire lentamente el anillo de ajuste de volumen para dibujar el medio en el depósito opuesto. Dibuje aire en la columna vertical corta del puerto de llenado uno hasta que la interfaz fluido-aire esté a mitad de camino en la columna. A continuación, conecte el puerto uno antes de levantar suavemente la tubería del puerto cuatro, asegurándose de que la corredera permanezca en su lugar y conecte lentamente el puerto cuatro.
Para realizar imágenes de lapso de tiempo, coloque el deslizamiento de quimiotaxis en el escenario de un microscopio invertido equipado con una incubadora de etapas e imagine el área de observación con una lente objetivo de contraste de fase 10X, centrándose en la lamellipodia macrófago. La diapositiva de quimiotaxis utilizada para la microscopía de vídeo de lapso de tiempo de los macrófagos peritoneales de ratón tiene tres cámaras de quimiotaxis, cada una de las cuales tiene cuatro puertos de llenado. Las células fueron sembradas en el área de observación de cada cámara.
Y después de una incubación de dos a tres horas, las cámaras se llenaron lentamente de medio. Cuando las células en el área de observación fueron inspeccionadas, hasta dos tercios de las células habían sido arrastradas. Generalmente, se lavaron las células B-1 débilmente adherentes, y las células restantes eran predominantemente macrófagos.
Para distinguir los macrófagos de las células B, las células recién aisladas fueron etiquetadas con anticuerpos específicos. Los macrófagos fueron etiquetados con fluorescencia verde, las células B con rojo, y los núcleos celulares con azul. La migración de macrófagos se investigó introduciendo el Complemento C5a, un quimioatractant, en uno de los dos embalses.
Se registraron las pistas de migración de macrófagos que migraban en un gradiente de Complemento C5. El punto inicial de cada pista de migración se normalizó a X es igual a cero e Y es igual a cero para crear una gráfica de migración. Luego, se calcularon la velocidad celular y la eficiencia quimiotáctica de los macrófagos individuales.
Esta técnica ha sido útil para estudiar las funciones de las subunidades de proteína G, y Rho GTPases, y la motilidad de los macrófagos en la quimiotaxis.
