The authors thank Dr. P.L. Hordijk for critically reading the manuscript. AED is supported by a Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR) fellowship (grant #1028). JK is supported by the Dutch Heart Foundation (2005T3901). JDvB is a NHS Dekker fellow (grant #2005T039).

Los neutrófilos se aislaron a partir de voluntarios sanos que han firmado un consentimiento informado. La investigación ha sido realizada de acuerdo con las directrices institucionales y nacionales para el bienestar humano. 1. Plating y mantenimiento de umbilical humana células endoteliales de vena <ol><li> Células de cultivo endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) según las instrucciones del fabricante. Grow HUVECs en fibronectina (FN) presenta el revestimiento platos (10 g / ml, disueltos en agua desmineralizada) usando los medios de comunicación (medio basal endotelial (EBM-2) medio suplementado con medio de crecimiento endotelial (EGM-2) SingleQuots). Utilice cultivo celular entre 4-8 pasajes para los experimentos. </li><li> Día 1: Escudo de flujo cámaras con 100 l de fibronectina (10 g / ml en PBS) durante al menos 2 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Día 2: Cuando las células alcanzan 80-90% de confluencia, las células trypsinize después de un lavado cuidadoso con solución salina tamponada con fosfato RT (PBS) pH 7,4, centrifugar a 800 xg y resuspender a 800.000 células / ml utilizando los medios de comunicación. Placa de 80.000 células en cada canal de flujo de las cámaras recubiertas con FN y suavemente pipeta la suspensión celular arriba y abajo. Cultura O / N en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Día 3: Actualiza los medios de comunicación en la diapositiva flujo cámaras inclinando suavemente el portaobjetos en un ángulo de 45 °. (Véase la Figura 1A). NOTA: Se recomienda para eliminar sólo los medios de comunicación en los embalses y no en el propio canal. La eliminación de los medios de comunicación en los canales puede resultar en la pérdida de células endoteliales y la muerte debido a la fuerza de arrastre de los medios de comunicación causados ​​por pipeteo. </li><li> Compruebe por microscopía de contraste de fase si las células endoteliales se han formado una monocapa (es decir, 100% de confluencia). Si las células no son 100% confluentes, cambiar los medios de comunicación dos veces al día hasta que alcanzan el 100% de confluencia. </li><li> Una vez que las células han alcanzado la confluencia, estimular las células con los medios de comunicación (véase el paso1,1) que contiene mediador inflamatorio (TNF-α (10 ng / ml)). Estimular HUVECs O / N (es decir, 12 horas) con resultados TNF-α en un fenotipo inflamatorio del endotelio, es decir., Sobre regulación de moléculas de adhesión celular tales como ICAM-1 y VCAM-1 13. </li></ol> 2. leucocitos polimorfonucleares Aislamiento uso de gradientes de Percoll <ol><li> Preparar N-2-hidroxietilpiperazina-N&#39;-2-etanosulfónico (HEPES) -buffer (en adelante denominado: flujo-buffer) antes de aislar los leucocitos polimorfonucleares (PMN). Flow-tampón se utiliza para lavar PMNs aislados y como tampón en el ensayo de flujo. Para preparar flujo-buffer: diluir 7,72 g NaCl (132 mM), 4,76 g de HEPES (20 mM), 0,45 g KCl (6 mM), 0,25 g MgSO 4 • 7H 2 O (1 mM), K 2 HPO 4 • 3H 2 O (1,2 mM) en 1 L de agua desmineralizada y se ajusta a pH 7,4 (esta población puede mantenerse a 4 ° C durante varias semanas). </li><li> Añadir frescos 100 l 1 M CaCl 2 y #160; (1 mM), 2,5 ml de albúmina humana a partir de una concentración de 200 g / L de stock (0,5% v / v) y 0,1 g de glucosa a 100 ml (0,1% w / v) de tampón de flujo. A continuación, un filtrado del búfer de flujo utilizando un filtro de 0,45 micras. NOTA: Este-buffer de flujo tiene que estar preparado fresco para cada experimento. </li><li> Antes de aislamiento de PMN, preparar la solución de 10% de citrato trisódico (TNC) en PBS, pH 7,4. </li><li> Recoger 20 ml de sangre total en vacuettes heparina de sodio de un voluntario sano. Diluir la sangre completa 1: 1 con 10% de PBS / TNC en tubos de 50 ml y 20 ml de pipeta sangre diluida cuidadosamente en 12,5 ml de Percoll (un 23% (w / w) solución coloidal en agua con una densidad de 1,130 g / ml) en un nuevo tubo de 50 ml. Con cuidado, coloque los tubos en la centrífuga y centrifugar durante 20 min a 800 xg con baja aceleración y ninguna rotura puesta a RT. NOTA: Cuando la adición de la sangre diluida a la Percoll, inclinar el tubo de Percoll que contiene en un ángulo de 45 ° y la pipeta suavemente la sangre diluida en el ingenio del tuboh el ajuste más lento pipeta chico. </li><li> Eliminar todo el líquido y posteriormente llenar el tubo con eritrocitos buffer de lisis enfriado con hielo (4,15 g NH 4 Cl [0,155 M], 0,5 g de KHCO3 [0,01 M] y 18,5 mg de EDTA (Triplex III) [0,1 mM] a 500 ml de helado H 2 O) para lisar los eritrocitos. Deje el tubo en hielo, de vez en cuando invirtiendo el tubo, hasta que la suspensión se vuelve rojo oscuro, seguido de centrifugación 500 xg durante 5 min a 4 ° C con descansos habilitados. NOTA: La fracción de sedimento contiene los PMN (neutrófilos, eosinófilos, basófilos) junto con los eritrocitos. </li><li> Aspirar el sobrenadante y lavar pellet dos veces en buffer de lisis enfriado con hielo a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Resuspender el sedimento con tampón de flujo a temperatura ambiente y determinar la concentración de PMNs utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado. Suspender los PMNs en el flujo-tampón a 1 x 10 6 células / ml y mantenerla en RT. </li></ol> 3. Etiquetado de Endotelial Junctional VE-cadherina y PECAM-1 <ol><li> Añadir el anticuerpo 647 PECAM Alexa Fluor (clon WM59) a una dilución 1: 100 y el anticuerpo VE-cadherina-FITC independiente de calcio (clon 55-7H1) en un medio de cultivo 1:50 dilución a HUVEC (ver paso 1.1), e incubar durante 30 min antes de iniciar el experimento de flujo de visualizar la dinámica de unión de células endoteliales durante la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo fisiológicas. NOTA: Antes de añadir los anticuerpos directamente etiquetados a los flujos de cámaras, asegúrese de que el volumen de cada canal no exceda de 100 l. Esto ayuda a mantener los gastos de anticuerpo tan bajo como sea posible. </li></ol> 4. PMN TEM Ensayo de Flujo Bajo <ol><li> Coloque los PMNs en un baño de agua durante 15 min a 37 ° C antes de su inyección en el sistema de flujo. </li><li> Conecte el tubo a un flujo-cámara vacía y llénela con agua caliente (por ejemplo, 37 ° C) Caudal-buffer (véase el paso 4.3) para evitar la formación de burbujas de aire al configurar ªsistema de flujo e. </li><li> Conectar un lado de una cámara vacía de flujo para el sistema de flujo de la bomba de jeringa mediante el uso de tubo de silicona que contiene una jeringa de 20 ml, y poner la cámara de flujo en la platina del microscopio. </li><li> Conectar el otro lado de un flujo de la cámara de vacío al matraz depósito lleno de 37 ° C-tampón de flujo (Figura 1B) y comenzar la bomba de jeringa con el fin de llenar todo el tubo con tampón de flujo. La bomba se tire el flujo de tampón desde el depósito a través de la cámara de flujo dentro de la jeringa. NOTA: Este tubo también contiene un puerto de inyección en línea Luer, que permite a los PMNs a inyectar con una aguja en un experimento de funcionamiento sin detener el flujo y la creación de burbujas de aire. </li><li> Vuelva a colocar el flujo de la cámara de vacío con la cámara de flujo que contiene las HUVEC tratadas con TNF-α, conecte el tubo que contiene el flujo-buffer-y colocarla en la platina del microscopio (Figura 1C). Pellizque de los tubos antes de desconectar y volver a conectar elm a las cámaras que contienen el HUVECs, ya que no pellizcando puede resultar en la formación de burbujas de aire dentro de la tubería y / o de flujo cámaras. </li><li> Ajustar la velocidad de flujo a 1 dyn / cm 2, de acuerdo con la velocidad de flujo fisiológico en vénulas capilares enviar (1-5 dyn / cm 2). </li><li> Registro de contraste de interferencia diferencial (DIC), FITC (488 nm) y Alexa Fluor 647 (647 nm) simultáneamente usando un microscopio de escaneo láser confocal. </li><li> Inyectar los PMNs (paso 4.1) lentamente en el sistema de flujo a través de la in-line Luer puerto de inyección (Figura 1D) utilizando jeringuillas de 1 ml. </li><li> Después de unos minutos, aparecen los leucocitos, se adhieren, y transmigrar. Pare el experimento en cualquier momento deseado desconectando el tubo de la cámara de flujo y fijador de pipeteado (3,7% de formaldehído en PBS) en la cámara de flujo-. Permitir la fijación durante 10 min, seguido de lavado con PBS. Los datos se analizan usando el software de formación de imágenes (ver materiales y equipos de mesa). NOTA: Realice la que experimento usando un microscopio de barrido de láser confocal equipado con una cámara climática con una temperatura constante a 37 ° C, 5% de CO 2, y un objetivo 63X de aceite. </li></ol>

<ol>
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Cell Biol. 8, 113-123 (2006).</li><li>Schulte, D., Kuppers, V., Dartsch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+the+VE-cadherin-catenin+complex+blocks+leukocyte+extravasation+and+vascular+permeability.">Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability.</a> EMBO J. 30, 4157-4170 (2011).</li><li>Buul, J. D., Mul, F. P., van der Schoot, C. E., Hordijk, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-3+activation+modulates+cell-cell+contacts+of+human+bone+marrow+endothelial+cells.">ICAM-3 activation modulates cell-cell contacts of human bone marrow endothelial cells.</a> J. Vasc. Res. 41, 28-37 (2004).</li><li>Shaw, S. K., Bamba, P. S., Perkins, B. N., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+vascular+endothelial-cadherin+during+leukocyte+transmigration+across+endothelium.">Real-time imaging of vascular endothelial-cadherin during leukocyte transmigration across endothelium.</a> J. Immunol. 167, 2323-2330 (2001).</li><li>Su, W. H., Chen, H., Jen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+movements+of+VE-cadherin+and+PECAM-1+during+transmigration+of+polymorphonuclear+leukocytes+through+human+umbilical+vein+endothelium.">Differential movements of VE-cadherin and PECAM-1 during transmigration of polymorphonuclear leukocytes through human umbilical vein endothelium.</a> Blood. 100, 3597-3603 (2002).</li><li>Paulsson, J. M., Jacobson, S. H., Lundahl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+activation+during+transmigration+in+vivo+and+in+vitro:+A+translational+study+using+the+skin+chamber+model.">Neutrophil activation during transmigration in vivo and in vitro: A translational study using the skin chamber model.</a> J. Immunol. Methods. 361, 82-88 (2010).</li><li>Williams, M. R., Azcutia, V., Newton, G., Alcaide, P., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+mechanisms+of+neutrophil+recruitment+across+endothelium.">Emerging mechanisms of neutrophil recruitment across endothelium.</a> Trends Immunol. 32, 461-469 (2011).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

Para este protocolo, es crítico para evitar la formación de burbujas de aire en el flujo de cámaras, ya que esto dará como resultado la apoptosis celular y una monocapa interrumpido. Para evitar esto, queremos destacar que prestar especial interés a las medidas 4.2 y 4.5, donde los tubos están conectadas al flujo de cámaras. Otro paso crítico en el protocolo es el cebado de los PMNs que se mantienen a temperatura ambiente, mediante su incubación durante 15-30 min a 37 ° C antes de la inyección a la cámara de flujo (paso 4.1). Esto resulta en el cebado de las integrinas de leucocitos, lo que les permite adherirse a las moléculas de adhesión tales como ICAM-1 o VCAM-1 en el endotelio. Este protocolo no se limita a estudiar la transmigración de neutrófilos. Se pueden usar también otros tipos de leucocitos tales como monocitos o linfocitos. Tenga en cuenta que el paso 4.1, es decir, cebar los leucocitos pueden diferir entre los tipos de leucocitos. También, se pueden utilizar otros tipos de células endoteliales. Para ello, sigue siendo críticapara estimular las células endoteliales con estímulos inflamatorios adecuados, tales como TNF-α o IL-1β. Si los neutrófilos no responden de transmigración, se puede considerar el tratamiento de la brevemente los neutrófilos (5 min) con N-formil-L-metionil-L-leucil-L-fenilalanina (fMLP) péptido 16. Esto estimulará los neutrófilos, en particular, sus integrinas, aún más, haciéndolos más propensos a adherirse al endotelio. Por lo general se usa 1 dyn / cm 2 velocidad de flujo. Esta velocidad de flujo se mide en vénulas post-capilares, sitios donde se produce más migración transendotelial de leucocitos 17. Uso de las cámaras de flujo descritos, es posible aumentar el flujo de velocidad de hasta 10 dyn / cm 2. Sin embargo, no se recomienda aumentar la cizalla más. Puede dar lugar a fugas no deseadas de la tubería y el desprendimiento de las células del flujo-cámara. Los resultados descritos en la Figura 3 indican que estosanticuerpos se pueden usar para visualizar y estudiar la dinámica de endoteliales uniones célula-célula durante la diapedesis de leucocitos. En particular, además de los ensayos de transmigración existentes este protocolo permite discriminar paracelular de la migración transcelular en condiciones de flujo fisiológicas en tiempo real. Dado que los anticuerpos se tiñen las uniones célula-célula, se puede marcar el número de leucocitos que cruzan VE-cadherina / uniones PECAM-1-positivas frente no positiva VE-cadherina / PECAM-1 sitios. De esta manera, la migración transcelular puede ser discriminado de la migración paracelular. Es importante destacar que estos anticuerpos no interfieren con la función de las proteínas que se unen a: el anticuerpo PECAM-1 utilizado en este estudio está dirigido contra el segundo dominio extracelular. Las células endoteliales que se colocaron en placas en presencia del anticuerpo no mostró defectos en la propagación o la formación de una monocapa, lo que sugiere que el anticuerpo, al menos, no lo hizointerferir con las interacciones entre las células endoteliales homotípicos. Además de eso, ambos anticuerpos no afectan a la capacidad de los neutrófilos para migrar a través de la monocapa endotelial. Además, el número de neutrófilos que transmigrar través de la monocapa endotelial en la ausencia o presencia de los anticuerpos no se altera (datos no mostrados). Es importante destacar que, microscopía confocal de barrido láser nos da la posibilidad de grabar diferentes canales fluorescentes y DIC simultáneamente. Por lo tanto, este ensayo permite estudiar la dinámica de VE-cadherina y PECAM-1 al mismo tiempo cuando una de neutrófilos cruza la unión célula-célula endotelial y ayudará a entender por qué los leucocitos eligen una ruta sobre la otra, es decir, paracelular frente transcelular.

Eficiente y muy controlado migración transendotelial de leucocitos (TEM) es de vital importancia en los procesos fisiológicos tales como la vigilancia inmune y la inflamación aguda. Sin embargo, bajo ciertas condiciones fisiopatológicas, TEM descontrolado y excesivo se observó resultando en enfermedades inflamatorias crónicas (por ejemplo, artritis reumatoide, aterosclerosis, asma). También durante la metástasis de células tumorales, el proceso de migración transendotelial es instrumental para las células tumorales para dejar la circulación de metástasis 1-3. Con el fin de interferir específicamente con leucocitos excesivo o TEM de células tumorales, se requiere un conocimiento detallado de la regulación de este proceso. Se cree que el proceso de TEM se produce a través de diferentes pasos. Estudios seminales, crítica hace dos décadas por Butcher y Springer, llevaron al modelo de múltiples pasos que describe el proceso de TEM 4,5. Este modelo sigue siendo válida, aunque algunos adpasos tradicionales se han incluido 6. Alon et al. Describe la necesidad de la presencia de quimiocinas inmovilizadas sobre la superficie del endotelio 7. Recientemente, se demostró que el propio endotelio genera quimiocinas que se presentan en la superficie apical endotelial 8. Por otra parte, el mismo grupo planteó la importancia de las condiciones de flujo durante TEM 7. Recientemente, varias publicaciones centradas en las dos rutas diferentes leucocitos pueden tomar en la etapa de diapedesis final del TEM. Ellos pueden ir a través de las uniones célula-célula, es decir, la ruta de migración paracelular, o cruzar a través del cuerpo de la célula endotelial, conocida como la ruta de migración transcelular 9. Carman y sus colegas estudiaron estas vías en detalle y llegó a la conclusión de que los leucocitos preferentemente eligen la ruta de migración paracelular (90%) sobre la ruta transcelular (10%) al cruzar una monocapa endotelial de la vena umbilical 10.Sin embargo, cuando se utilizaron células endoteliales de otros orígenes, por ejemplo, el cerebro o la microvasculatura, más leucocitos utilizan la ruta transcelular (30%) 11. El grupo Vestweber mostró recientemente que cuando las uniones célula-célula fueron incapaces de disociar el uno del otro mediante el uso de un knock-in modelo animal, en sustitución endógena VE-cadherina para un VE-cadherina-alfa-catenina quimera, TEM de leucocitos fue bloqueada completamente 12 . Sorprendentemente, los autores notaron que TEM se bloqueó en varios, pero no todos, los tejidos. En general, estos elegantes experimentos indicaron que los leucocitos prefieren la ruta paracelular sobre la ruta transcelular, aunque las señales reguladoras que activan esta decisión aún no se conocen. A pesar de que la mayoría de los leucocitos prefieren la ruta de migración paracelular, todavía es difícil discriminar entre ambas vías. Además de que, a pesar de varios estudios que se centran en el papel de la JUNCT célula-célula endotelialiones, la dinámica de estas uniones, en particular, las proteínas de unión VE-cadherina y PECAM-1, durante el cruce de leucocitos sigue siendo objeto de debate. Hemos desarrollado un ensayo relativamente simple en el que estas moléculas de unión se pueden monitorizar en tiempo real durante la diapedesis de leucocitos en condiciones de flujo fisiológicas usando anticuerpos marcados con fluorescencia. Estos anticuerpos no interfirieron con o bloquean la integridad de la unión o de la movilidad de las proteínas específicas. Este ensayo nos permite seguir la dinámica de las proteínas de unión durante el proceso de TEM paracelular. Además, este ensayo también permite discriminar entre las rutas de migración de parámetros y transcelulares.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1251">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:471px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:365px;">Company</td>
			<td style="width:184px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#956;-Slide VI</td>
			<td style="width:365px;">IBIDI</td>
			<td style="width:184px;">80606</td>
			<td>Flow-chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.45 &#956;m filter&#160;</td>
			<td>Whatman/GE Lifesciences</td>
			<td style="width:184px;">10462100</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">1 mL syringe&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:184px;">300013</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">20 mL syringe&#160;</td>
			<td>BD Discardit II</td>
			<td style="width:184px;">366296</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">21G needle&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Microlance</td>
			<td style="width:184px;">301155</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Albumin&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Sanquin</td>
			<td style="width:184px;">15522644</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Ammunium chloride (NH4Cl)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1009245000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">449709</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:471px;">EBM-2 Basal medium + EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. &#38; Growth Factors</td>
			<td style="width:365px;">Lonza</td>
			<td style="width:184px;">CC-3156 + CC-4176</td>
			<td>media</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">EDTA (Titriplex III)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1370041000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon tubes&#160;</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:184px;">352096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">F1141-2MG</td>
			<td>FN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Glucose</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">G7528</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">HEPES</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">H3375</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">In-line Luer Injection port&#160;</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td style="width:184px;">10820</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">105886</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PECAM-1-ALEXA-647&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:184px;">561654</td>
			<td>clone WM59 
			stock concentration 0.1mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Percoll&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:184px;">17-0891-09</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:365px;">Fresenius Kabi&#160; Nederland</td>
			<td style="width:184px;">M090001/01NL</td>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Potassium chloride (KCl)</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">P9541</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Potassium hydrogen carbonate (KHCO3)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1048540500</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Potassium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4)</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">P5504</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Silicone Tygon 3350 tubing</td>
			<td style="width:365px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">228-4331</td>
			<td>tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:365px;">Calbiochem (Millipore)</td>
			<td style="width:184px;">567441</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe pump&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>model number 55-5920</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TNF&#945;&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Peprotech</td>
			<td style="width:184px;">300-01A</td>
			<td>tumor necrosis factor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">trisodium citrate&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1.06447.5000</td>
			<td>TNC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vacuettes</td>
			<td style="width:365px;">Greiner, Germany</td>
			<td style="width:184px;">980044</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VE-Cadherin-FITC&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:184px;">560411</td>
			<td>clone 55-7H1</td>
			<td>stock concentration 0.5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zeiss LSM510 META&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Zen Software 2008</td>
			<td style="width:365px;">Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of endothelial cell-cell junctions during neutrophil transmigration under physiological flow

Durante la inflamación, los leucocitos abandonan la circulación y cruzan el endotelio para luchar contra los patógenos invasores en los tejidos subyacentes. Este proceso se conoce como migración transendotelial de leucocitos. Dos rutas para leucocitos para cruzar la monocapa endotelial se han descrito: la ruta paracelular, es decir, a través de las uniones célula-célula y la ruta transcelular, es decir, a través del cuerpo de la célula endotelial. Sin embargo, ha sido técnicamente difícil discriminar entre el párrafo y la ruta transcelular. Hemos desarrollado un sencillo ensayo in vitro para estudiar la distribución de endógeno VE-cadherina y PECAM-1 durante la migración transendotelial de neutrófilos bajo condiciones de flujo fisiológicas. Antes de la perfusión de los neutrófilos, las células endoteliales se trataron brevemente con anticuerpos marcados con fluorescencia contra VE-cadherina y PECAM-1. Estos anticuerpos no interfieren con la función de ambas proteínas, como se determinó por la célula-Substra eléctricade detección de impedancia TE y FRAP mediciones. Utilizando este ensayo, hemos sido capaces de seguir la distribución de los endógena VE-cadherina y PECAM-1 durante la migración transendotelial bajo condiciones de flujo y discrimina entre los parámetros y migración transcelular rutas de los leucocitos a través del endotelio.

Primero probamos si los anticuerpos no interfieren con la función de barrera del endotelio. Se midió la resistencia de monocapas endoteliales mediante el uso de detector de impedancia de la célula-sustrato eléctrica (ECIS). Para más detalles, véase Van Buul et al. 13 se observó ningún cambio en la resistencia cuando se añadió el anticuerpo anti-VE-cadherina marcado con fluorescencia de las células (Figura 2A). Un anticuerpo anti-VE-cadherina que está bien reconocida para bloquear VE-cadherina función reduce drásticamente la resistencia (Figura 2A). Además, los anticuerpos utilizados para la formación de imágenes no alteran la dinámica de la VE-cadherina, como se evaluó mediante la medición de la recuperación de fluorescencia después de la foto-blanqueamiento (FRAP) de VE-cadherina-GFP (Figura 2B). Después de 1-2 minutos, los neutrófilos se adhirieron a la monocapa endotelial activada como podría ser visualizado en el canal de DIC (Figura 3A). Después de arrastrarse por 5-30 en síc, la gran mayoría de los neutrófilos transmigrado través de la monocapa endotelial a través de las uniones célula-célula que se marcaron con los anticuerpos dirigidos contra PECAM-1 y VE-cadherina. Durante el proceso de diapedesis, la distribución de la VE-cadherina y PECAM-1 se siguió en tiempo real (Figura 3B). En los sitios de diapedesis de neutrófilos, VE-cadherina fue interrumpida localmente y PECAM-1 mostró una estructura más similar a un anillo. Después de la terminación de diapedesis, las uniones estrechas y VE-cadherina y PECAM-1 claramente reubicados en los sitios de diapedesis (Figura 3C). Tenga en cuenta que las partes del anticuerpo anti-PECAM-1 se detectaron en la superficie del neutrófilo una vez que el de neutrófilos alcanza el lado basolateral del endotelio. Sin embargo, esto no impidió que los neutrófilos de cruzar el endotelio. La dinámica observada de VE-cadherina en tiempo real durante la migración transendotelial de neutrófilos estaban de acuerdo con la obra de Shaw y colegas quemostró, mediante microscopía confocal y la VE-cadherina-GFP-transfectadas las células endoteliales, que VE-cadherina-GFP difundido lateralmente cuando leucocitos cruzaron las uniones entre células endoteliales 14. También trabajar por Su y compañeros de trabajo subrayaron nuestras observaciones de PECAM-1. Ellos mostraron difusión que, junto al lateral VE-cadherina tras el paso de leucocitos, PECAM-1 se redistribuyó localmente en un anillo alrededor de la transmigración de neutrófilos 15. <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig1highres.jpg" width="400" /> Figura 1 En la cámara de flujo vitro. (A) La flecha indica el depósito de la que el medio tiene que ser renovado. (B) Tubo de silicona que conecta la cámara de flujo con la in-line puerto de inyección Luer utilizado para inyectar PMN sin desconectar el tubo (punta de flecha). (C) Conexiónreflejo de un flujo-cámara vacía al matraz depósito lleno de 37 ° C el flujo-buffer (punta de flecha). (D) La conexión de la cámara de flujo con las HUVECs TNF-α-tratado a la tubería de flujo que contiene-buffer-y se coloca en la platina del microscopio (punta de flecha). <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. VE-cadherina anticuerpos no interfieren con la dinámica o la función de unión. (A) Impedancia de monocapa de células endoteliales se mide usando ECIS. Eje Y se expresa en ohmios de impedancia y el eje x representa el tiempo en horas. VE-cadherina anticuerpo clon 55-7H1, marcado con Alexa647 (línea azul) o isotipo IgG control-Alexa647 (línea roja) no alteran la impedancia monocapa de células endoteliales, mientras que la VE-cadherina bloqueando CL75 anticuerpo (línea de color negro) se reduce la impedancia . (B </strong&gt;) VE-cadherina-GFP se expresó en HUVEC y análisis FRAP usando microscopía confocal reveló ningún cambio en la recuperación de la fluorescencia en presencia o ausencia de la VE-cadherina 55-7H1 anticuerpo. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. VE-cadherina y PECAM-1 de distribución durante TEM de neutrófilos en tiempo real. (A) Neutrófilos (marcado con la línea blanca) que se adhiere sobre el endotelio y el cruce de la unión célula-célula sin afectar a la distribución de la VE-cadherina y PECAM -1. (B) de neutrófilos cruzar la monocapa endotelial a través de las uniones célula-célula. Una dispersión local de la VE-cadherina y PECAM-1 se pueden observar cuando una de neutrófilos sobresale a través de las uniones célula-célula. Línea blanca ilustra presencia de neutrófilos todavía en la parte superior del endotelio. La línea amarilla muestra Tha membrana de neutrófilost ya está por debajo del endotelio. (C) de neutrófilos ha cruzado completamente la monocapa endotelial. VE-cadherina y PECAM-1 son reubicados en sitios de diapedesis. Línea amarilla ilustra las fronteras de los neutrófilos transmigrado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Los leucocitos atraviesan la monocapa endotelial usando el paracelular o la ruta transcelular. Hemos desarrollado un ensayo sencillo para seguir la distribución de la unión endógena VE-cadherina y PECAM-1 durante la migración de leucocitos transendotelial bajo flujo fisiológico de discriminar entre las dos vías de transmigración.

Imágenes en tiempo real de la célula-célula cruces endoteliales Durante neutrófilos Transmigración Bajo Flujo Fisiológica

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

real-time-imaging-endothelial-cell-cell-junctions-during-neutrophil

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

Cell-Cell Interactions

SCIENTISTS IN ACTION

19.4K vistas.  Sanquin Research and Landsteiner Laboratory, AMC at University of Amsterdam.  Los leucocitos atraviesan la monocapa endotelial usando el paracelular o la ruta transcelular. Hemos desarrollado un ensayo sencillo para seguir la distribución de la unión endógena VE-cadherina y PECAM-1 durante la migración de leucocitos transendotelial bajo flujo fisiológico de discriminar entre las dos vías de transmigración. 

Video: Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to intracellular responses. GPCRs control diverse biological functions such as chemotaxis, intracellular calcium release, gene regulation in a ligand dependent manner via heterotrimeric G-proteins1-2. Ligand binding induces a series of conformational changes leading to activation of heterotrimeric G-proteins that modulate levels of second messengers such as cyclic adenosine monophosphate (cAMP), inositol triphosphate (IP3) and diacyl glycerol (DG). Concomitant with activation of the receptor ligand binding also initiates a series of events to attenuate the receptor signaling via desensitization, sequestration and/or internalization. The desensitization process of GPCRs occurs via receptor phosphorylation by G-protein receptor kinases (GRKs) and subsequent binding of &beta;-arrestins3. &beta;-arrestins are cytosolic proteins and translocate to membrane upon GPCR activation, binding to phosphorylated receptors (most cases) there by facilitating receptor internalization 4-6.
Leukotriene B4 (LTB4) is a pro-inflammatory lipid molecule derived from arachidonic acid pathway and mediates its actions via GPCRs, LTB4 receptor 1 (BLT1; a high affinity receptor) and LTB4 receptor 2 (BLT2; a low affinity receptor)7-9. The LTB4-BLT1 pathway has been shown to be critical in several inflammatory diseases including, asthma, arthritis and atherosclerosis10-17. The current paper describes the methodologies developed to monitor LTB4-induced leukocyte migration and the interactions of BLT1 with &beta;-arrestin and , receptor translocation in live cells using microscopy imaging techniques18-19.
Bone marrow derived dendritic cells from C57BL/6 mice were isolated and cultured as previously described 20-21. These cells were tested in live cell imaging methods to demonstrate LTB4 induced cell migration. The human BLT1 was tagged with red fluorescent protein (BLT1-RFP) at C-terminus and &beta;-arrestin1 tagged with green fluorescent protein (&beta;-arr-GFP) and transfected the both plasmids into Rat Basophilic Leukomia (RBL-2H3) cell lines18-19. The kinetics of interaction between these proteins and localization were monitored using live cell video microscopy. The methodologies in the current paper describe the use of microscopic techniques to investigate the functional responses of G-protein coupled receptors in live cells. The current paper also describes the use of Metamorph software to quantify the fluorescence intensities to determine the kinetics of receptor and cytosolic protein interactions.

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &amp;#946;-arrestin

This paper describes the methodology to determine the chemotactic response of leukocytes to specific ligands and identify interactions between the cell surface receptors and cytosolic proteins using live cell imaging techniques.

Imágenes en tiempo real de los leucotrienos B 4 La migración mediada por células y BLT1 interacciones con β-arrestina

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Investigación

Inmunología e Infección

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Aislamiento de células endoteliales de vena umbilical y su uso en el Estudio de la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many diseases associated with neuroinflammation such as multiple sclerosis (MS)2. Microglia in a normal CNS express macrophage marker CD11b and exhibit a resting phenotype by expressing low levels of activation markers such as CD45. During pathological events in the CNS, microglia become activated as determined by upregulation of CD45 and other markers3. The factors that affect microglia phenotype and functions in the CNS are not well studied. MicroRNAs (miRNAs) are a growing family of conserved molecules (~22 nucleotides long) that are involved in many normal physiological processes such as cell growth and differentiation4 and pathologies such as inflammation5. MiRNAs downregulate the expression of certain target genes by binding complementary sequences of their mRNAs and play an important role in the activation of innate immune cells including macrophages6 and microglia7. In order to investigate miRNA-mediated pathways that define the microglial phenotype, biological function, and to distinguish microglia from other types of macrophages, it is important to quantitatively assess the expression of particular microRNAs in distinct subsets of CNS-resident microglia. Common methods for measuring the expression of miRNAs in the CNS include quantitative PCR from whole neuronal tissue and in situ hybridization. However, quantitative PCR from whole tissue homogenate does not allow the assessment of the expression of miRNA in microglia, which represent only 5-15% of the cells of neuronal tissue. Hybridization in situ allows the assessment of the expression of microRNA in specific cell types in the tissue sections, but this method is not entirely quantitative. In this report we describe a quantitative and sensitive method for the detection of miRNA by real-time PCR in microglia isolated from normal CNS or during neuroinflammation using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mouse model for MS. The described method will be useful to measure the level of expression of microRNAs in microglia in normal CNS or during neuroinflammation associated with various pathologies including MS, stroke, traumatic injury, Alzheimer's disease and brain tumors.

Microglia are resident macrophages that provide the first line of defense and immune surveillance of the central nervous system. MicroRNAs are regulatory molecules that play an important role in many physiological processes including activation and differentiation of macrophages. In this article, we describe the method for measurement of microRNAs in microglia.

La detección de microARNs en la microglía por PCR en tiempo real en el SNC normal y durante la neuroinflamación

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

En tiempo real de imágenes en vivo de las células T de señalización Formación de complejos

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

Imágenes en tiempo real de heterotypic plaquetas neutrófilos Interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Cuantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensayo para medir la adhesión de neutrófilos al Activado Primaria células endoteliales microvasculares humanas en condiciones estáticas

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

Ensayo de adhesión de neutrófilos Cámara de flujo humano

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

Imágenes en tiempo real de las células mieloides en Dinámica<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Intestinal Tumores de Spinning disco microscopía confocal

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor response to insulin, local hypoxia, and inflammation. By stimulating the differentiation of functional white adipocytes from progenitors, radical hypertrophy of the adipocyte population can be prevented and, consequently, the metabolic health of adipose tissue can be improved along with a reduction of inflammation. Also, by stimulating a differentiation of beige/brown adipocytes, the total body energy expenditure can be increased, resulting in weight loss. This approach could prevent the development of obesity co-morbidities such as type 2 diabetes and cardiovascular disease.
This paper describes the isolation, expansion, and differentiation of white and beige adipocytes from a subset of human adipose tissue endothelial cells that co-express the CD31 and CD34 markers. The method is relatively cheap and is not labor-intensive. It requires access to human adipose tissue and the subcutaneous depot is suitable for sampling. For this protocol, fresh adipose tissue samples from morbidly obese subjects [body mass index (BMI) &#62;35] are collected during bariatric surgery procedures. Using a sequential immunoseparation from the stromal vascular fraction, enough cells are produced from as little as 2&#8211;3 g of fat. These cells can be expanded in culture over 10&#8211;14 days, can be cryopreserved, and retain their adipogenic properties with passaging up to passage 5&#8211;6. The cells are treated for 14 days with an adipogenic cocktail using a combination of human insulin and the PPAR&#947; agonist-rosiglitazone.
This methodology can be used for obtaining proof of concept experiments on molecular mechanisms that drive adipogenic responses in adipose endothelial cells, or for screening new drugs that can enhance the adipogenic response directed either towards white or beige/brown adipocyte differentiation. Using small subcutaneous biopsies, this methodology can be used to screen out non-responder subjects for clinical trials aimed to stimulate beige/brown and white adipocytes for the treatment of obesity and co-morbidities.

The differentiation of white and beige adipocytes from adipose tissue vascular progenitors bears potential for metabolic improvement in obesity. We describe protocols for a CD34+CD31+ endothelial cell isolation from human fat and for a subsequent in vitro expansion and differentiation into white and beige adipocytes. Several downstream applications are discussed.

Aislamiento, expansión y Adipogenic inducción de CD31 + CD34 + células endoteliales del humano omentales y subcutáneos de tejido adiposo

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

Imagen en tiempo real y cuantificación del desarrollo de biopelículas fúngicas mediante un sistema recirculación de flujo bifásico

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...