עבודה זו נתמכה על ידי מענק מחקר קנדי ​​Institutes of Health Research (CIHR, MOP-86749). ל ליו הוא חתן פרס החוקר CIHR חדש (MSH-95374).

1. הכנת Chemoattractant ב agarose ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 10 מ&quot;ל של 2 × PBS בצינור 50 מ&quot;ל חרוטי, ואת לחמם את הצינור על ידי הכנסתו לתוך כוס המכילה מים חמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 10 מ&quot;ל של מים מזוקקים ולהוסיף 0.4 גרם אבקת agarose בצינור 50 מ&quot;ל אחר חרוטי (עם הכובע שלו קצת רופף) וחום את התערובת עד רתיחה רק במיקרוגל (דקות 1 ~ בתנור 700 וואט מיקרוגל) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את חימם 2 × PBS על צינור agarose פתרון פתרון, מערבולת מעורבת לשמור אותו חם בספל מים חמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micropipette פתרון chemoattractant (למשל, 10 μl של 0.5 מיקרוגרם של chemokine CXC MIP-2 או 12 μl של WKYMVm 1 mM) לתוך מכסה של שפופרת Eppendorf 1.5-מ&quot;ל המכיל 3 μl דיו הודו ומערבבים היטב על ידי שאיפה באמצעות micropipette (להימנע בועת אוויר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את קצה קצה קצה של 200 μl pipet ו micropipette 110 μl של agarose פתרון (42 ° C) לתוך המכסה ומיד ומערבבים היטב בעזרת פיפטה עוד טיפ (למנוע בועות אוויר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות chemoattractant ג&#39;ל המכילים בשעה 4 ° C. </li></ol> 2. הכנת שרירים Cremaster מיקרוסקופית Intravital (איור 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכבר זכר בוגר על ידי זריקה ip מתערובת של xylazine מ&quot;ג / ק&quot;ג 10 ו 200 מ&quot;ג / ק&quot;ג hydrochloride קטמין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את האזור על וריד הצוואר הימני חיצוני ההיבט הקדמי של כיס האשכים עם סכין גילוח חשמלי. לאחר הרדמה, חשוב לתת תשומת לב טיפול מיוחד לעכבר בהרדמה. מנורת החום עלול לשמש כדי למנוע את העכבר מן היפותרמיה. העכבר צריך להיות חופשי מן רפלקס הכאב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך אופקי, למצוא קטטר וריד הצוואר באמצעות צינורות PE-10 מלאים מלוחים U / ml 100 הפרין. צנתור של וריד הצוואר נדרש לניהול הרדמה ותרופות נוספות בעת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן הרגליים האחוריות עכבר עם הקלטת הטבור עם העכבר שוכב עם הפנים כלפי מעלה על לוח תוצרת בית cremaster השריר (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את הלוח ל circulator 37 מעלות צלזיוס מים כדי לשמור על השריר cremaster גוף העכבר חם. </li></ol> הערה: כל הנהלים 2.6-2.14 חייב להתבצע בעדינות רבה 5. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושים חתך בעור האשכים כדי לחשוף את השרירים cremaster שמאל. בזהירות לנתח את השרירים fascia המשויכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Superfuse השריר cremaster עם 37 ° C-חימם ביקרבונט שנאגרו מלוחים (131.9 NaCl, KCl 4.7, 1.2 MgSO 4, 20 NaHCO 3, מ&quot;מ, pH 7.4) באמצעות המשאבה peristaltic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עניבה תפר 4-0 לסוף הדיסטלי של שריר cremaster להחזיק אותו על בסיס זכוכית שקופה לצפייה של הלוח שריר cremaster. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצרוב את השריר cremaster longitudinally. עם תפר 4-0, להחזיק בדירה שרירים לאבטח אותו בשולי על הכן. הפרד את האשך ואת יותרת האשך של שריר הבסיס ולהעביר אותם לתוך חלל הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Superfuse השריר ב ~ 0.6 מ&quot;ל / דק &#39;עם החיץ 37 C-חימם זלוף ° ו לכסות את שריר חשוף עם 22 × coverslip 22 מ&quot;מ זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את לוח שריר cremaster על הבמה מיקרוסקופ, לבחון את השריר מתחת למיקרוסקופ, למצוא ורדיד postcapillary מתאים (בחר את ורדיד כי הוא ישר unbranched ויש לו קצב גזירה רגיל בקוטר של 25-40 מיקרומטר) ולהתאים את מצלמת הוידאו כדי לאפשר ורדיד להיות דמיינו במצב אנכי על צד ימין או שמאל של צג הטלוויזיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שיווי משקל של 30 דקות, שיא את תמונות הווידאו של ורדיד postcapillary נבחרו 5 דקות כמו בקרת נתונים בסיסית באמצעות וידיאו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את superfusion ולהסיר את coverslip על השריר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצב ~ 1-3 מ&quot;מ בגודל chemoattractant המכילים ג&#39;ל על פני השטח של שריר cremaster באזור שנבחרו מראש 350 מיקרומטר מן ובמקביל ורדיד postcapillary ציין, להוסיף coverslip להחזיק את הג&#39;ל במקום ו superfuse רקמת השריר בבית מאוד קצב איטי (≤ 10 μl / min), כדי לאפשר את הקמתה של שיפוע של chemoattractant כי הוא שוחרר לאט נוצר הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלט את תמונת וידאו של 90 דקות אחרי תוספת של ג&#39;ל המכיל chemoattractant. במהלך ההקלטה, לשנות ולשמור על המיקוד מיקרוסקופ על עמידה, זחילה, transmigrating ו chemotaxing leukocytes בתוך ורדיד ו ברקמת השריר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הניסוי, לייבא את קובץ הווידאו למחשב לניתוח. </li></ol> 3. Cell מעקב באמצעות ImageJ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במחשב, לחלץ להמיר וידאו בפורמט AVI (למשל, להשתמש bitRipper חינם תוכנת מחשב להמיר סרט DVD לקובץ AVI). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת עריכת וידאו כדי ליצור את הסרט בזמן שחלף. לדוגמה, השתמש ב-Windows Movie Maker לעשות סרט זמן בטלה (עד 1 / 512 או 1 / 1024 זמן לשגותלא שיעור של 30 fps) מן הווידאו המקורי בזמן אמת. המר ולשמור את הסרט לא דחוס בזמן שחלף לפורמט DV-AVI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלט את התמונות של מיקרומטר כיול תחת ההגדרה מיקרוסקופ עם זאת, לייבא תמונות למחשב, לפתוח את התמונות עם ImageJ. ב ImageJ, הפיקסלים הכולל להופיע בפינה השמאלית העליונה של המסך (למשל, 720 × 480 פיקסלים). מדוד את גודל המסך בשני צירי X ו-Y (למשל, 200 × 150 מיקרומטר). מכאן, לחשב את מספר פיקסלים לכל מיקרומטר (למשל x = 720/200 = 3.6 פיקסלים / מיקרומטר, ו-y = 480 / 150 = 3.2 פיקסלים / מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לייבא את הסרט, לפתוח ImageJ שוב, לחץ על &quot;קובץ, יבוא באמצעות QuickTime סרטים Plug-in&quot;, לבחור את הסרט כדי להיות מנותח ולחץ על &quot;אישור&quot; על הממשק של &quot;פותחן QT Movie&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;Plugins-Manual מעקב&quot; כדי לעקוב אחר תאים. מלא את הפרטים הרלוונטיים בשדות בתחתית לפני תחילת המעקב. בקצרה, <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרווח הזמן (sec) = fold-time-lapse/30 (לדוגמה, 1020 × זמן לשגות יהיה 1020/30 = 34 שניות / מסגרת אינטרוולים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> X / Y = כיול המדידה מיקרומטר / פיקסל באמצעות כיול התמונה של מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיול z = 0 (כמו שריר cremaster העכבר הוא שכבה דקה מאוד של זחילה רקמות תאים ההגירה 2D כ תחת שקוף בהיר שדה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיפוש מרובע בגודל של מרכוז = 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גודל נקודה / קו רוחב / גודל גופן: הם יכולים להיות מותאמים במידת הצורך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר נקודת יציב וברור כנקודת התייחסות. זו נקודת ההתייחסות יכולה להיות כל נקודה מבנית ברורה קטן נשאר ללא שינוי ויציבה לאורך הניסוי כולו. לחץ על &quot;הוסף מעקב&quot; כדי לעקוב אחר נקודת ההתייחסות של הראשונים המסגרת האחרונה ולחץ על &quot;סוף מסלול&quot;. הנתונים המופיעים בטבלת התוצאות באופן אוטומטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב אחר זחילה נודדות נויטרופילים אחד אחד: לחץ על &quot;הוסף מעקב&quot; כדי לעקוב אחר התא מן המראה שלה ברקמת להיעלמות שלה בכל מסגרת ולחץ על &quot;סוף מסלול&quot; לסיים ולשמור את התוצאות ב-Microsoft Excel. </li></ol> 4. ניתוח פרמטרים גיוס נויטרופילים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את קובץ התוצאות ב-Microsoft Excel, ולנתח את הנתונים (לקחת את השינויים של נקודת התייחסות אל ניתוח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Intraluminal זחילה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זחילה מרחק: את המרחק הכולל התא זוחל לומן מהאתר חסיד הראשונית לאתר גלגול אופטימלי (מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהירות זחילה: זחילה מרחק / זמן (מיקרומטר / min). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transendothelial הגירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זמן גלגול נשמות: מעת התא מתחיל מתגלגלות לאורך האנדותל לזמן שבו גוף התא כולו הוא מחוץ ורדיד ועל שום גוף התא ניתן לראות את לומן (דקות או שניות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זמן פלוגת: מרגע גוף התא כולו הוא מחוץ ורדיד (מיד לאחר גלגול) לנקודת הזמן שבו התא מאבד קשר עם ורדיד (חזר בו הזנב) (דקות או שניות). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Chemotaxis ברקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרחק הגירה: סכום של המרחק התא נע מנקודת ההתחלה לנקודת הסיום של הגירה ברקמות (מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהירות הנדידה: מרחק הגירה ברקמה / שעה (מיקרומטר / min). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרחק Chemotaxis: סכום של תא נודד למרחק של ציר ה-x ברקמות (מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהירות של chemotaxis: chemotaxis מרחק / זמן (מיקרומטר / min). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Chemotaxis אינדקס: היחס של חלוקת המרחק chemotaxis ידי מרחק ההגירה ברקמות. </li></ol></li></ol> 5. נציג תוצאות: למרות מיקרוסקופיה bightfield intravital משמש ללימוד ליקוציט-אנדותל האינטראקציות התא לא יכול להיות בהכרח נויטרופילים, אנו מאשרים כי, על ידי מחקרים היסטולוגיה שלנו, יותר מ -95% של התאים שגויסו chemoattractant שטופלו השרירים נויטרופילים cremaster אכן נויטרופילים . בדו&quot;ח זה, באמצעות נויטרופילים סלקטיבית chemoattractants, אנו מציגים את נהלי המעקב הגיוס של נויטרופילים in vivo. באופן ספציפי, אנו מתארים פרוטוקול של זחילה מעקב intraluminal נויטרופילים, הגירה transendothelial ו chemotaxis ברקמת השריר cremaster בעכברים מורדמים באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופיה וידאו intravital ו ImageJ. Chemoattractant ג&#39;ל המכילים agarose על השריר cremaster לאט משחרר chemoattractant ומאפשר שיפוע chemoattractant שתוקם רקמות. Chemoattractant נויטרופילים גורם נויטרופילים-אנדותל האינטראקציות תא venules postcapillary cremasteric בעכברים. הניסוי כולו דמיינו תחת מיקרוסקופ brightfield זקוף intravital עם תמונות וידיאו המוקרנת על ידי מצלמת צבע וידאו כדי לפקח טלוויזיה נרשמו על ידי וידיאו. אנחנו נקבע נויטרופיליםזחילה intraluminal, הגירה transendothelial והגירה ו chemotaxis ברקמת השריר בתגובה נויטרופילים chemoattractant MIP-2 ו WKYMVm שהוכנו agarose ג&#39;ל (איור 2). מצאנו כי MIP-2 (ב 0.5 מיקרומטר) ו WKYMVm (ב 0.1 מ&quot;מ) שהושרו זחילה intraluminal נויטרופילים במהירות דומה, הגירה transendothelial נויטרופילים וניתוק מן ורדיד לאורך זמן דומה, נדידת נויטרופילים ו chemotaxis ברקמת השריר על כמעט ובאותה מהירות עם מדדים דומים נויטרופילים chemotaxis (P&gt; 0.05 הבדיקה, סטודנט t). <img src="/files/ftp_upload/3296/3296fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. האיור סכימטי של מערכת מיקרוסקופ intravital. שריר העכבר cremaster הוא exteriorized על הכן צפייה ברורה של הלוח שריר cremaster על הבמה מיקרוסקופ superfused עם 37 ° C-חימם ביקרבונט שנאגרו מלוחים. המיקרוסקופ מחובר זקוף עם מצלמת וידאו CCD צבע עבור מיקרוסקופיה intravital brightfield. המצלמה בצבע עמוק מקורר CCD דיגיטלי קשור גם ליציאת מיקרוסקופ פלואורסצנטי intravital עבור מיקרוסקופיה, תמונות שממנו מעובדים ישירות על ידי מחשב. <img src="/files/ftp_upload/3296/3296fig2.jpg" alt="איור 2" /> 2. איור גיוס נויטרופילים פרמטרים של מיקרוסקופיה brightfield intravital. גיוס נויטרופילים היה המושרה על ידי שחרור הדרגתי של chemoattractant נויטרופילים MIP-2 או WKYMVm בהכנת agarose ג&#39;ל להציב 350 מיקרומטר הסמוכים ורדיד postcapillary. זמן נושן נתוני וידאו נותחו על ידי ImageJ לאחר עיבוד בזמן אמת, הקלטת וידאו של הניסוי. זחילה נויטרופילים intraluminal (A), גלגול זמן וזמן ניתוק (ב), מהירות ההעברה ומהירות chemotaxis ברקמות (C), ומדד chemotaxis בשריר cremaster (ד) נקבעו לאחר מתן של MIP-2 או WKYMVm agarose ג&#39;ל על cremaster השריר בעכברים C57BL / 6 (n = 3, # של תאים מסומנים = 22 (ב A ו-B) ו 27 (ב C ו-D) בהתאמה MIP-2, ו = 26 (ב A ו-B) ו 44 ( ב C ו-D) בהתאמה WKYMVm).

<ol>
	<li>Liu, L., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+leukocyte+recruitment:+organ-specific+mechanisms+of+action.">Molecular mechanisms of leukocyte recruitment: organ-specific mechanisms of action.</a> Thromb. Haemost. 89, 213-220 (2003).</li><li>Petri, B., Phillipson, M., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+leukocyte+recruitment:+an+in+vivo+perspective.">The physiology of leukocyte recruitment: an in vivo perspective.</a> J. Immunol. 180, 6439-6446 (2008).</li><li>Phillipson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraluminal+crawling+of+neutrophils+to+emigration+sites:+a+molecularly+distinct+process+from+adhesion+in+the+recruitment+cascade.">Intraluminal crawling of neutrophils to emigration sites: a molecularly distinct process from adhesion in the recruitment cascade.</a> J. Exp. Med. 203, 2569-2575 (2006).</li><li>Wong, C. H., Heit, B., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulators+of+leucocyte+chemotaxis+during+inflammation.">Molecular regulators of leucocyte chemotaxis during inflammation.</a> Cardiovasc. Res. 86, 183-191 (2010).</li><li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research:+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations.">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li><li>Bullen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+imaging+techniques+for+drug+discovery.">Microscopic imaging techniques for drug discovery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).</li><li>Hazelwood, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entering+the+Portal:+Understanding+the+Digital+Image+Recorded+Through+a+Microscope.">Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope.</a> Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).</li><li>Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-selectin+facilitates+emigration+and+extravascular+locomotion+of+leukocytes+during+acute+inflammatory+responses+in+vivo.">L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo.</a> J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).</li><li>Cara, D. C., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+as+a+tool+for+studying+recruitment+and+chemotaxis.">Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).</li><li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSP1+is+an+endothelial+gatekeeper+of+leukocyte+transendothelial+migration.">LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration.</a> J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).</li><li>Heit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+accelerates,+but+is+not+required+for,+neutrophil+chemotaxis+to+fMLP.">PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP.</a> J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

מיקרוסקופיה Intravital הוא כלי חיוני לחשוף את מנגנוני תאית ומולקולרית של גיוס לויקוציטים במהלך דלקת. ויזואליזציה כמותיים לקביעת ליקוציט-אנדותל האינטראקציות תא microvasculature transluscent של רקמות כמו שריר cremaster ו mesentery נותר תקן הזהב עבור היישום של הטכניקה 1,5. מיקרוסקופיה קונב?...

טבלה: חומרים, ריאגנטים ספציפיים ציוד <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> שם מגיב / ציוד </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> צינורות פוליאתילן, PE10 </td><td> בקטון דיקינסון </td><td> 427401 </td><td> מזהה 0.28mm × 0.61mm OD </td></tr><tr><td> הודו דיו </td><td> כדור האש לאמנות </td><td> שחורים סופר </td><td> פיגמנט לא 100% פחמן שחור צבעים </td></tr><tr><td> כויה </td><td> אהרון רפואי </td><td> AA03 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazine </td><td> Bayer בריאות, באייר בע&quot;מ </td><td> DIN 02169592 </td><td></td></tr><tr><td> קטמין הידרוכלוריד </td><td> Bioniche לבריאות בעלי חיים קנדה, Inc </td><td> DIN 01989529 </td><td></td></tr><tr><td> MIP-2 רקומביננטי Murine </td><td> R &amp; D מערכות </td><td> 452-M2 </td><td></td></tr><tr><td> WKYMVm </td><td> הפניקס Pharmaceuticals, Inc </td><td> 072-12 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-027 </td><td> Ultrapure </td></tr><tr><td> הפרין </td><td> סיגמא </td><td> H-3393 </td><td></td></tr><tr><td> זקוף מיקרוסקופ </td><td> אולימפוס </td><td> BX61WI </td><td></td></tr><tr><td> צבע 3CCD מצלמת וידאו </td><td> SONY </td><td> DXC-990 </td><td></td></tr><tr><td> HD-DVD מקליט וידאו </td><td> LG אלקטרוניקה בע&quot;מ </td><td> RH398H-M </td><td></td></tr><tr><td> טלוויזיה צג </td><td> LG אלקטרוניקה בע&quot;מ </td><td> 22LG30 </td><td></td></tr><tr><td> מים circulator </td><td> Thermo Scientific </td><td> HAAKE DC10 </td><td></td></tr><tr><td> Peristaltic משאבה </td><td> Gilson; Pharmacia </td><td> Gilson MINIPULS 3; Pharmacia P-3 </td><td></td></tr><tr><td> Cremaster לוח שריר </td><td> אוניברסיטת Saskatchewan </td><td></td><td> מתוצרת בית </td></tr></table>

tracking neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in tissue by intravital video microscopy

מחזורי גיוס של לויקוציטים מזרם הדם אל הרקמה הדלקתית היא תהליך חיוני ומורכב של 1,2 דלקת. ב venules postcapillary של רקמה דלקתית, leukocytes בתחילה לקשור אנד רול על פני השטח של הקיר luminal venular. רולינג מעצר leukocytes על האנדותל ולעבור הידבקות המשרד בתגובה chemokine או chemoattractants אחרים על פני venular. Leukocytes חסיד רבים לעבור מאתר הראשונית של הידבקות לאתר extravasation junctional ב האנדותל, תהליך שמכונה intraluminal זחילה 3. לאחר זחילה, leukocytes לנוע על פני האנדותל (גלגול) ולהעביר ברקמות extravascular לעבר מקור chemoattractant (chemotaxis) 4. מיקרוסקופיה Intravital הוא כלי רב עוצמה המאפשר הדמיה ליקוציט-אנדותל האינטראקציות תא in vivo ו חושף מנגנונים תאית ומולקולרית של גיוס לויקוציטים 2,5. בדו&quot;ח זה, אנו מספקים תיאור מקיף של באמצעות מיקרוסקופ brightfield intravital לחזות ולקבוע את תהליכי מפורט של גיוס נויטרופילים בשריר cremaster עכבר בתגובה שיפוע של chemoattractant נויטרופילים. כדי לגרום לגיוס נויטרופילים, פיסה קטנה של ג&#39;ל agarose (~ 1-3 מ&quot;מ גודל) המכיל chemoattractant נויטרופילים MIP-2 (CXCL2, chemokine CXC) או WKYMVm (TRP-Lys-Tyr-Val-D-Met, אנלוגי סינתטי של פפטיד חיידקי) מושם על ברקמת השריר הסמוך ורדיד postcapillary ציין. עם הזמן שחלף צילום וידאו במחשב תוכנה ImageJ, זחילה נויטרופילים intraluminal על האנדותל, הגירה transendothelial נויטרופילים ואת הגירה chemotaxis ברקמות הם דמיינו מסומנים. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח אמין כמותי של פרמטרים רבים לגיוס נויטרופילים כגון מהירות זחילה intraluminal, גלגול זמן, זמן הניתוק, מהירות העברה, מהירות chemotaxis ומדד chemotaxis ברקמות. אנו מראים כי בפרוטוקול זה, פרמטרים אלה גיוס נויטרופילים ניתן לקבוע ביציבות לבין תנועה תא בודד מעקב נוח in vivo.

Watch this Scientific Journal Video about Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy at JoVE.com

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

אנו מתארים פרוטוקול של מיקרוסקופיה brightfield intravital למדידת דינמי נויטרופילים-אנדותל האינטראקציות התא במהלך לגיוס נויטרופילים בתגובה מקור chemoattractant נויטרופילים in vivo. זחילה נויטרופילים intraluminal, הגירה chemotaxis transendothelial ו ברקמת השריר cremaster העכבר הם דמיינו עם הצילום בזמן שחלף וידאו מעקב עם ImageJ.

מעקב זחילה Intraluminal נויטרופילים, הגירה Chemotaxis Transendothelial ועל רקמות על ידי מיקרוסקופית וידאו Intravital

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

tracking-neutrophil-intraluminal-crawling-transendothelial-migration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.5K Views.  University of Saskatchewan. אנו מתארים פרוטוקול של מיקרוסקופיה brightfield intravital למדידת דינמי נויטרופילים-אנדותל האינטראקציות התא במהלך לגיוס נויטרופילים בתגובה מקור chemoattractant נויטרופילים in vivo. זחילה נויטרופילים intraluminal, הגירה chemotaxis transendothelial ו ברקמת השריר cremaster העכבר הם דמיינו עם הצילום בזמן ש?...

Video: Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them intracellularly when their antimicrobial granules fuse with the phagosome. We found that neutrophils have an additional way of killing microorganisms: upon activation, they release granule proteins and chromatin that together form extracellular fibers that bind pathogens. These novel structures, or Neutrophil Extracellular Traps (NETs), degrade virulence factors and kill bacteria1, fungi2 and parasites3. The structural backbone of NETs is DNA, and they are quickly degraded in the presence of DNases. Thus, bacteria expressing DNases are more virulent4. Using correlative microscopy combining TEM, SEM, immunofluorescence and live cell imaging techniques, we could show that upon stimulation, the nuclei of neutrophils lose their shape and the eu- and heterochromatin homogenize. Later, the nuclear envelope and the granule membranes disintegrate allowing the mixing of NET components. Finally, the NETs are released as the cell membrane breaks. This cell death program (NETosis) is distinct from apoptosis and necrosis and depends on the generation of Reactive Oxygen Species by NADPH oxidase5. 
Neutrophil extracellular traps are abundant at sites of acute inflammation. NETs appear to be a form of innate immune response that bind microorganisms, prevent them from spreading, and ensure a high local concentration of antimicrobial agents to degrade virulence factors and kill pathogens thus allowing neutrophils to fulfill their antimicrobial function even beyond their life span. There is increasing evidence, however, that NETs are also involved in diseases that range from auto-immune syndromes to infertility6.
We describe methods to isolate Neutrophil Granulocytes from peripheral human blood7 and stimulate them to form NETs. Also we include protocols to visualize the NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are an important innate immune mechanism to fight pathogenic bacteria, fungi and parasites. Here we describe methods to isolate neutrophil granulocytes from human blood and to activate them to form NETs. We present preparation techniques to visualize NETs in light and electron microscopy.

מלכודות תאי נויטרופילים: כיצד ליצור מדמיינים אותם

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

מיקרוסקופית Intravital של הצומת לימפה מפשעתי

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

במבחנה Coculture Assay כדי להעריך פתוגן המושרה נדידת נויטרופילים טרנס אפיתל

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. During infection of the urinary bladder, polymorphonuclear leukocytes (PMN; neutrophils) migrate from the bloodstream and traverse the bladder epithelium. Failure to resolve infection in the absence of a neutrophilic response demonstrates the importance of PMN in bladder defense. To facilitate colonization of the bladder epithelium, uropathogenic Escherichia coli (UPEC), the causative agent of the majority of urinary tract infections (UTIs), dampen the acute inflammatory response using a variety of partially defined mechanisms. To further investigate the interplay between host and bacterial pathogen, we developed an in vitro model of this aspect of the innate immune response to UPEC. In the transuroepithelial neutrophil migration assay, a variation on the Boyden chamber, cultured bladder epithelial cells are grown to confluence on the underside of a permeable support. PMN are isolated from human venous blood and are applied to the basolateral side of the bladder epithelial cell layers. PMN migration representing the physiologically relevant basolateral-to-apical direction in response to bacterial infection or chemoattractant molecules is enumerated using a hemocytometer. This model can be used to investigate interactions between UPEC and eukaryotic cells as well as to interrogate the molecular requirements for the traversal of bladder epithelia by PMN. The transuroepithelial neutrophil migration model will further our understanding of the initial inflammatory response to UPEC in the bladder.

We developed an in vitro model that mimics an important component of the acute inflammatory response during infection of the bladder with uropathogenic Escherichia coli. The transuroepithelial neutrophil migration assay enables quantitative assessment of human neutrophil migration across bladder epithelia, cultured on permeable supports, in response to bacterial infection or chemoattractant substances.

הערכה כמותית של אדם נויטרופילים הגירה מעבר מתורבת שלפוחית ​​השתן האפיתל

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

מיקרוסקופית Intravital הפסים תאורה נפתר מאוד של מרכזי ז&#39;רמינל

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

הדמיה נויטרופילים ומונוציטים בmesenteric ורידים על ידי מיקרוסקופית Intravital על עכברים מורדמים בזמן אמת

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that enhances the phagocytic functionality of neutrophils. Although extensive studies have unveiled the existence and importance of neutrophil priming during infection and injury, means of visualizing this process in vivo have been unavailable. The protocol provided enables monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals by combining three methodologies: 1) DsRed reporter signal &#8212; used as a measure of priming 2) in vivo neutrophil labeling &#8212; achieved by injection of fluorescence-conjugated anti-lymphocyte antigen 6G (Ly6G) monoclonal antibody (mAb) and 3) intravital confocal imaging. Several critical steps are involved in this protocol: oxazolone-induced mouse ear skin inflammation, appropriate sedation of animals, repeated injections of anti-Ly6G mAb, and prevention of focus drift during imaging. Although a few limitations have been observed, such as the limit of continuous imaging time (~ 8 hr) in one mouse and the leakage of fluorescein isothiocyanate-dextran from blood vessels in the inflammatory state, this protocol provides a fundamental framework for intravital imaging of primed neutrophil behavior and function, which can easily be expanded to examination of other immune cells in mouse inflammation models.

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&amp;#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

הדמיה Intravital של Priming נויטרופילים שימוש IL-1β מונחה יזם עכברים Reporter DsRed

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil migration and chemotaxis owing to their advantages in real-time visualization, precise control of chemical concentration gradient generation, and reduced reagent and sample consumption. Recently, a growing effort has been made by the microfluidic researchers toward developing integrated and easily operated microfluidic chemotaxis analysis systems, directly from whole blood. In this direction, the first all-on-chip method was developed for integrating the magnetic negative purification of neutrophils and the chemotaxis assay from small blood volume samples. This new method permits a rapid sample-to-result neutrophil chemotaxis test in 25 min. In this paper, we provide detailed construction, operation and data analysis method for this all-on-chip chemotaxis assay with a discussion on troubleshooting strategies, limitations and future directions. Representative results of the neutrophil chemotaxis assay testing a defined chemoattractant, N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), and sputum from a chronic obstructive pulmonary disease (COPD) patient, using this all-on-chip method are shown. This method is applicable to many cell migration-related investigations and clinical applications.

This article provides the detailed method of performing a rapid neutrophil chemotaxis assay by integrating the on-chip neutrophil isolation from whole blood and the chemotaxis test on a single microfluidic chip.

שיטה All-on- שבב עבור ניתוח נויטרופילי מהיר Chemotaxis ישירות מתוך ירידה של דם

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with histones and antimicrobial proteins. Excessive NET formation (NETosis) and citH3 release during sepsis is associated with multiple organ dysfunction and mortality in mice and humans but its implications in dogs are unknown. Herein, we describe a technique to isolate canine neutrophils from whole blood for observation and quantification of NETosis. Leukocyte-rich plasma, generated by dextran sedimentation, is separated by commercially available density gradient separation media and granulocytes collected for cell count and viability testing. To observe real-time NETosis in live neutrophils, cell permeant and cell impermeant fluorescent nucleic acid stains are added to neutrophils activated either by lipopolysaccharide (LPS) or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Changes in nuclear morphology and NET formation are observed over time by fluorescence microscopy. In vitro NETosis is further characterized by co-colocalization of cell-free DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) and citrullinated histone H3 (citH3) using a modified double-immunolabelling protocol. To objectively quantify NET formation and citH3 expression using fluorescence microscopy, NETs and citH3-positive cells are quantified in a blinded manner using available software. This technique is a specific assay to evaluate the in vitro capacity of canine neutrophils to undergo NETosis.

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

We describe methods to isolate canine neutrophils from whole blood and visualize NET formation in live neutrophils using fluorescence microscopy. Also described are protocols to quantify NET formation and citrullinated histone H3 (citH3) expression using immunofluorescence microscopy.

במבחנה מבנה הכלבי נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית: דינמי וניתוח כמותי על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

אינטראקציה תא הדמיה ב רירית והכו אותי במהלך זיהום בנגיף שפעת באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים Intravital

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...