Damos un agradecimiento especial a Lino Kim, Steve Guzmán y Satyarthi UJIT de asistencia técnica durante el desarrollo de este método. Myron Hawthorne, Spengel Richard, Rojas y Roberto máquina las cámaras utilizadas aquí y siempre muy necesaria asistencia técnica. Cabe destacar que, Roberto Rojas produjo la Figura 4. También estamos agradecidos por valiosos consejos de Scott Fraser, antes del desarrollo de la prueba de la quimiotaxis de arriba. Este trabajo fue apoyado en parte por un marcador-5S06GM048680-13 NIH-SAM para Medb y por un premio de la CSU Programa, Northridge apoyo de tesis de grado para CW.

1. Día 1: El aislamiento de los tubos neurales del tronco de la cultura durante la noche en cubreobjetos <ol><li> Huevos se incuban chica de 56 horas a 38 ° C. Retire los huevos de incubación, rociar ligeramente con el 70% de etanol, y luego dejar que se sequen. Rompa los huevos se abren en una bandeja de vidrio UV-esterilizados. </li><li> Extracto de cada embrión de su yema y colocarlo en chica de Ringer. Para ello, el primer corte en torno a las islas de sangre con tijeras curvas, y luego, con una pinza roma, elegir el embrión por la membrana extraembrionarias y colocarlo en una placa de Petri estéril de plástico que contiene la solución de Ringer chica. </li><li> Aislar el tronco de cada embrión por el recorte el exceso de membranas extraembrionarias, así como los niveles axial del cráneo, vagal, y sacra usando una aguja de tungsteno (Fig. 1). Primero, seleccione un 9 embriones que se encuentran entre las etapas HH15-17 11. Para los estadios HH15 y superiores, los ejes del cerebro anterior y posterior del cerebro forman un ángulo agudo y por lo tanto, la cabeza parece inclinación caudal. EnHH17 etapa, la yema de cola está presente y se inclina ventral, pero no contiene todavía somitas. Con una aguja de tungsteno, recorte membranas extraembrionarias a alrededor de 2 mm a partir del embrión y corte los tejidos embrionarios anteriores a somite 10. También eliminar todos los tejidos embrionarios caudal de partida de todo el somite quinto más reciente formación. </li><li> Coloque los troncos aislados de embriones en Dispasa (0,24 U / ml DMEM) y se incuba durante 1 hora a 15 minutos a 37 ° C y 5% CO 2. Una vez que los troncos de comenzar la incubación, empiece a preparar 6 cubreobjetos (CS) para el cultivo de explantes de NT (medidas 1.5 a 1.8). </li><li> Enjuague 6 CS en el 70% de etanol (diluido en agua destilada, ultrapura), y luego dejar que se sequen. Con un marcador de laboratorio, dibujar un círculo en el centro de cada CS, que es de aproximadamente 1 cm de diámetro (el círculo más adelante le ayudará a identificar en una capa de fibronectina se ha aplicado). En la misma cara de cada CS, escriba la palabra &quot;ser&quot; (o alguna otra palabra o forma asimétrica) fuera del círculo dibujado (esto ayudará you identificar si la cara marcada de la CS es hacia arriba o hacia abajo). </li><li> Coloque cada CS en un aparte 40 x 10 mm plato estéril con la superficie marcada hacia abajo y permitir que el plato que se siente libre debajo de una lámpara germicida UV durante 10 minutos. </li><li> Aplicar 60 l fibronectina (FN, 10 mg / ml DMEM) a la superficie sin marcas de la CS, mientras que asegurarse de que toda el área dentro del círculo de 1 cm está recubierto. Coloque los platos a incubar a 37 ° C durante 30 minutos y luego, con cuidado aspirar el fibronectina de cada CS. </li><li> Añadir 250 l &quot;cultura&quot; medio [DMEM con L-glutamina (2 mM), penicilina (100U/ml), estreptomicina (100 mcg / ml), y el 8% de suero fetal bovino (FBS)] a la zona de FN-revestido de el CS. Colocar las cápsulas que contienen cada uno de CS a 37 ° C y 5% de CO 2 hasta que el NT han sido aislados. </li><li> La transferencia de todos los troncos de embriones se incuban a un plato de 5 cm de vidrio de Petri con medio L15 y comenzar la disección de cada NT usando unas pinzas finas y una aguja de tungsteno (Fig. 1). Carefully corte a lo largo de la frontera de la NT y somitas con una aguja de tungsteno afilada ser prudentes para no dañar el NT. A menudo es más fácil para empezar a aislar cada NT desde el extremo caudal, la mayor parte de la cajuela. </li><li> Seleccione 6 de la recta más larga y NT a la cultura durante la noche (NT entre unos 8 y 15 somitas largas se recomienda). Con una punta de micropipeta preparadas con medio de cultivo, la transferencia de cada uno de los seis NT a su propio preparado previamente CS (1.5 a través de los pasos 1,8). Asegúrese de que el NT no se quede flotando en la superficie. Si el NT es flotante, por goteo en medio de ella hasta que se hunda con micropipeta. </li><li> Lugar de cada plato a 37 º C CO 2 y el 5% durante la noche. Preste atención a cada uno de NT se encuentra dentro del área de FN-revestido de sus respectivos CS inmediatamente antes de colocar el plato en la incubadora (utilizando el círculo dibujado en el paso 1.5 como referencia). Una micropipeta se puede utilizar para ajustar mejor la posición de cada NT si es necesario. </li><li> A cabo enpor lo menos 2 ml de medio de cultivo (sin suero) en un tubo de centrífuga estéril 15 ml y se incuba durante la noche a 37 ° C y 5% CO 2. Deje la tapa ligeramente desenrosca para permitir que el pH del medio para ajustar la noche a la mañana. Pre-incubación medio es importante para ayudar a prevenir la formación de burbujas en la cámara, que puede interrumpir la creación de un gradiente molecular. Como &quot;preincubaron&quot; medio se debe utilizar en todos los pasos futuros. Cuando no se utilizan, este medio debe estar incubando a 37 ° C. </li></ol> 2. Día 2: Carga de la cámara modificada Zigmond y time-lapse análisis de la migración celular <ol><li> De los 6 NT cultivadas, seleccione las 3 culturas más adecuado para el análisis. En general, las culturas NCC que tienen al menos uno de los bordes largos, rectos deben ser seleccionados (Fig. 2A). Los 3 mejores cultivos se utiliza para cargar y modificar película en 3 cámaras Zigmond lo largo del día, cada uno con un tratamiento diferente. De las tres culturas, elija uno de Loading de la primera cámara y volver a los otros a la incubadora para su uso posterior. </li><li> El uso de un hisopo de algodón, aplique una capa fina y uniforme de vaselina alrededor de los embalses y el puente de una cámara modificada Zigmond. </li><li> Con una aguja de tungsteno, retire suavemente el Nuevo Testamento de la CS, dejando alrededor de los NCC adheridos a la superficie de la CS. Marcar el plato con un lápiz para recordar la orientación de la recta borde de la cultura NCC. </li><li> Ponga unas gotas de medio de incuba en el puente. Levante el CS con unas pinzas finas, aplique el borde del CS contra una Kimwipe para eliminar la mayor parte del medio de cultivo de edad, e inmediatamente después colocar el CS de la cámara modificada Zigmond lo que la regla de la cultura para ser filmado se centra en la longitud del puente y casi perpendicular al puente fronterizo con depósito (Fig. 2A, B). </li><li> Utilizando un microscopio invertido, mover la recta frontera NCC a estar en el lado del puente más cercano a thdepósito electrónico que contendrá los chemotactant sospecha (Fig. 2B, para los controles de esto corresponderá a cualquier depósito está cargado segundo). Además, con más precisión alinear el borde recto de la cultura a ser perpendicular al puente fronterizo con depósito. </li><li> Con cuidado, pero firmemente presione el CS en la jalea de petróleo presentes en la cámara Zigmond, asegurándose de que está completamente sellado a la cámara, y luego coloque adicionales vaselina en el borde de la CS para garantizar aún más que será hermético. Un ajuste preciso del ángulo de la frontera NCC de nuevo para corregir cualquier movimiento durante el proceso de sellado. </li><li> Cargar el depósito que no contienen la sospecha chemotactant primero (Fig. 2B). Hacerlo mediante la carga de una jeringa de 1 ml (25 G x 1,5 pulgadas aguja), con cerca de 300 l medio preincubados y se inyecta el medio en el depósito hasta que se llena (teniendo cuidado de no generar burbujas en el depósito). Conecte el depósito por ambos lados con un suficient cantidad de vaselina antes de cargar el depósito de al lado. </li><li> Repita el paso 2.7, pero esta vez utilizando un medio que contiene el preincubaron chemotactant candidato. Es de suma importancia cuando se genera un gradiente molecular a través de la cultura a la carga siempre el depósito que contiene la molécula a ensayar después de cargar el depósito que carecen de la molécula de la prueba. </li><li> Coloque la cámara de carga Zigmond a 37 ° C y se incuba durante 1 h antes de la filmación. La imagen de la recta frontera de la cultura NCC durante 3 horas a 90 s, mientras que los intervalos de incubación de aproximadamente 37 ° C (Fig. 2A, B). Antes de crear cualquier película, asegúrese de alinear la cámara de modo que el borde de las imágenes que se obtengan y se alinean con tocar el borde del puente que bordea el embalse de última carga (Fig. 2B, panel superior, cuadro de líneas discontinuas representan ideales posición para la imagen). Esto facilitará el análisis posterior de software mediante la estandarización de la direccionalidad de la pendiente molecular aplicada y thdistancia e del depósito filmado en cada película producida. </li><li> Para los controles, repita los pasos del 2,2-2,9 por cada uno de los otros dos culturas NCC seleccionado (en el paso 2.1), pero llenar cada tanque con un medio apropiado. Para un tipo de control de llenado ambos depósitos con el medio preincubados no contiene la molécula para ser probado. Para un tratamiento de control en segundo lugar, el puente principal con unas gotas de medio preincubaron que contiene el chemotactant sospechosos antes de montar el CS. Entonces, la carga de los depósitos con el mismo medio que contiene el chemotactant sospecha. </li><li> Utilice ImageJ (NIH) de seguimiento manual <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html">(rsb.info.nih.gov / ij / plugins / pista / track.html)</a> y la quimiotaxis y migración v1.01 <a href="http://www.ibidi.de/applications/ap_chemo.html">(www.ibidi.de / aplicaciones / ap_chemo.html)</a> plugins para realizar un seguimiento la migración de los países contribuyentes netos periféricos a lo largo de la frontera hacia la cultura de la just imágenes y analizar diversos parámetros de las trayectorias migratorias obtenidos (Fig. 2B-C). </li></ol> 3. Los resultados representativos: Una muestra de la trayectoria de células a partir de una película en la que los países contribuyentes netos muchos tronco fueron sensibles a un quimioatrayente candidato usando la técnica anterior se muestra (Fig. 2D). La mayoría de las células en este ejemplo de una respuesta positiva muestra un movimiento neto el gradiente quimiotáctico (como se muestra en rojo). Datos de trayectoria puede ser utilizada para analizar otras propiedades de la migración celular, así. Con el fin de evaluar visualmente un gradiente aplicado en cámara modificada Zigmond, un Alexa Fluor 488 IgM conjugado (MW ~ 900 kDa) fue cargado en el segundo depósito de una cámara modificada Zigmond (aproximadamente 40 mg / ml de H 2 O). Un gradiente fue establecido por una hora y todavía un poco la actualidad, después de 26 h, pero muy disminuido en un 50 h (Fig. 3). Si la molécula a la prueba es menor, entonces la aplicación del gradiente will degradan más rápidamente que lo que se muestra. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3330/3330fig1.jpg" /> Figura 1. Explantación de NT nivel del tronco, para el cultivo durante la noche en cubreobjetos recubiertos de fibronectina. Debido a que el tronco delaminate NCC de la dorsal NT ubicado junto a somitas 8-28, este segmento de la NT está aislada por microdisección y se cultivan durante la noche en un CS recubiertos de fibronectina para permitir la emigración de los países contribuyentes netos de la explante NT. NT aislados que se encuentran entre 8-15 somitas largas y rectas relativamente son las más adecuadas para el cultivo durante la noche, ya que tienden a producir cultivos de NCC con más fronteras recta. Regiones del tubo neural que dan origen a otros niveles de la cresta neural axial se muestran en una fuente más pequeña. s, somite. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3330/3330fig2.jpg" /> Figura 2. Método para evaluar la migración de los países contribuyentes netos tronco explantadosutilizando una cámara modificada Zigmond. (A) alargado tronco culturas NCC se preparan mediante el cultivo de una noche de NT y culturas resultante NCC con al menos una frontera larga y recta son seleccionados para la experimentación. La frontera más larga recta de una cultura seleccionado se coloca perpendicular a la frontera-puente embalse, y por lo tanto, paralelo al vector del gradiente de futuro aplicada. (B) Después de ajustar con el ajuste de la posición de la cultura de NCC en la cámara Zigmond y sellado el cubreobjetos a la cámara, la cámara se carga. Cuando se prueba la quimiotaxis, el embalse que no contendrá el chemotactant sospecha (-) se carga primero y sellado. Entonces, el otro depósito se carga con la sospecha de chemotactant (+) y se sella. NCC periféricos a lo largo de la frontera previamente seleccionados puede ser fotografiado y seguido usando el plugin Manual de seguimiento para ImageJ (panel inferior). (C) Numerosas características migratorias en respuestapara el gradiente aplicado puede ser evaluada sobre la base de datos de seguimiento. Por ejemplo, un índice de quimiotaxis puede ser el resultado de dividir el desplazamiento de una célula a lo largo del eje x de la distancia total que ha emigrado. (D) Un ejemplo de una respuesta atractiva se muestra en un gráfico la trayectoria de células generadas inicialmente por la quimiotaxis y la migración herramienta plug-in para ImageJ. El punto de partida de cada trayectoria está en el origen (0,0). Tenga en cuenta cuántas células migran hacia el centro source.The quimioatrayente de la masa de todas las células en su posición final (cruz azul, todas las células con igual ponderación) es también más cercano a la fuente quimiotáctica. NCC, las células de la cresta neural, las pistas rojas, las células que emigraron hacia el depósito cargado con una sospecha de chemoattractant; pistas Negro, las células que emigraron; (+), la mayor concentración chemotactant; (-), baja concentración chemotactant. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3330/3330fig3.jpg" /> <strong&gt; Figura 3. Perfiles de intensidad a través del puente de una cámara modificada Zigmond en diferentes momentos después de la adición de un Alexa Fluor 488 conjugado IgM. La cámara se ha cargado de forma similar a la descrita en el protocolo con las principales excepciones que el agua preincubaron (en lugar de medio preincubados) se utiliza para diluir el anticuerpo a 40 mg / ml, y pequeñas bolsas de aire se presentan en los extremos del puente (lejos de la corte, donde los perfiles de intensidad por encima de donde se toma). Inicialmente, no estaba presente gradiente en la mayor parte del puente. Por un gradiente de hectáreas se estableció y se mantuvo presente a través de a 26 h. Por 50 h la presencia de la pendiente era incompatible en las diferentes áreas del puente, y cuando está presente, la inclinación de la pendiente era muy disminuido. Todos los perfiles se generaron a partir de una porción idéntica a través del puente (de un puente fronterizo depósito a otro) utilizando el software AxioVision 4.6. Tenga en cuenta que aún cuando el airebolsillos estaban presentes, la pendiente no se interrumpió. Alta, de alta intensidad, de baja intensidad y baja; eje X, distancia a través de todo el ancho del puente (2 mm), (+), el depósito cargado con el conjugado de Alexa Fluor 488 IgM (-), el depósito no se ha cargado con el conjugado. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3330/3330fig4.jpg" /> Figura 4. Modificado Zigmond las especificaciones de la cámara. Se muestra un diagrama de la cámara modificada Zigmond se usa aquí, junto con sus especificaciones dimensionales (± 0,2 mm). Las medidas pueden ser moderadamente ajustado con el fin de ajustarse a las preferencias individuales. Protocolo Suplementario: Fabricación de una cámara modificada Zigmond Por favor refiérase a la Figura 4 como referencia para el protocolo siguiente: <ol><li> Compra de una hoja de 3 / 16 &quot;de espesor de acrílico pulido (4,45 mm de espesor real). </li><li> Utilizando una sierra de mesa, cortar los espacios en blanco de gran tamaño a la cámaradimensiones aproximada de 33,25 mm x 64,57 mm. Esto permite a los 3.175 mm de material adicional para el mecanizado. </li><li> Set en blanco la cámara en un tornillo de banco. Con una fresadora y un 6,35 mm (1 / 4 &quot;) poco la fresa, el acabado de mecanizado de los lados de la cámara a sus dimensiones exactas: 30,07 mm x 61,39 mm. </li><li> La posición de la cámara en blanco en la máquina de fresado y localizar el centro del blanco a lo largo de los dos ejes X e Y con un palpador de aristas, y luego a cero la ubicación del centro. </li><li> Adquirir la altura de la cámara (eje Z) al tocar la fresa final a la superficie superior y el cero de la altura. </li><li> El uso de un 3,91 mm (0,154 &quot;) poco la fresa, compensar el poco 3,03 mm a lo largo del eje X (dirección positiva) para el primer depósito. Comience mecanizado en la cámara hasta una profundidad de 2,84 mm mientras que se mueve a lo largo del eje y (sentido positivo) de 7,62 mm (0,300 &quot;) y luego atravesar a 7,62 mm (0,300&quot;) en la dirección opuesta (negativa) en dirección a un depósito completo longitud de 15,24 mm (0,600 &quot;). Compensarel bit a 3,03 mm (0,119 &quot;) a lo largo del eje X (sentido negativo) y repetir el mismo proceso para el segundo depósito. </li><li> Posición de la cámara en su extremo y un agujero con un 1,09 mm (0,043 pulgadas) broca en el extremo de cada depósito (4 en total) que conecta el extremo del depósito al lado de la cámara de carga media durante la experimentación. </li><li> Sumerja la cámara bien en agua tibia y jabón para ayudar a eliminar todos los contaminantes químicos. </li><li> Remojo y enjuague la cámara bien en agua doblemente destilada para eliminar todo el jabón. Las cámaras están ahora listos para su uso como se describió anteriormente. </li></ol>

<ol>
	<li>Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+avian+embryo+as+a+model+to+study+the+development+of+the+neural+crest:+a+long+and+still+ongoing+story.">The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story.</a> Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).</li><li>Baker, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural Crest and Cranial Ectodermal Placodes. , (2005).</li><li>Gammill, L. S., Roffers-Agarwal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Division+of+labor+during+trunk+neural+crest+development.">Division of labor during trunk neural crest development.</a> Dev. Biol. 344, 555-565 (2010).</li><li>Kulesa, P. M., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+migration:+patterns,+phases+and+signals.">Neural crest migration: patterns, phases and signals.</a> Dev. Biol. 344, 566-568 (2010).</li><li>Wang, H. U., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eph+family+transmembrane+ligands+can+mediate+repulsive+guidance+of+trunk+neural+crest+migration+and+motor+axon+outgrowth.">Eph family transmembrane ligands can mediate repulsive guidance of trunk neural crest migration and motor axon outgrowth.</a> Neuron. 18, 383-396 (1997).</li><li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+Eph-related+receptors+and+ligands+confer+rostrocaudal+pattern+to+trunk+neural+crest+migration.">Interactions of Eph-related receptors and ligands confer rostrocaudal pattern to trunk neural crest migration.</a> Curr. Biol. 7, 571-580 (1997).</li><li>Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+of+trunk+neural+crest+migration+requires+neuropilin+2/semaphorin+3F+signaling.">Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling.</a> Development, Cambridge, England. , 133-199 (2006).</li><li>De Bellard, M. E., Rao, Y., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+function+of+Slit2+in+repulsion+and+enhanced+migration+of+trunk,+but+not+vagal,+neural+crest+cells.">Dual function of Slit2 in repulsion and enhanced migration of trunk, but not vagal, neural crest cells.</a> The Journal of cell biology. 162, 269-279 (2003).</li><li>Kasemeier-Kulesa, J. C., McLennan, R., Romine, M. H., Kulesa, P. M., Lefcort, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR4+controls+ventral+migration+of+sympathetic+precursor+cells.">CXCR4 controls ventral migration of sympathetic precursor cells.</a> J. Neurosci. 30, 13078-13088 (2010).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> The Journal of Cell Biology. 75, 606-616 (1977).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chicken+embryo.">A series of normal stages in the development of the chicken embryo.</a> J. Morph. 88, 49-52 (1951).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li><li>Davis, E. M., Trinkaus, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+cell-to+cell+contacts+for+the+directional+movement+of+neural+crest+cells+within+a+hydrated+collagen+lattice.">Significance of cell-to cell contacts for the directional movement of neural crest cells within a hydrated collagen lattice.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 63, 29-51 (1981).</li><li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber.">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> Journal of Cell Science. 99, 769-775 (1991).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

La realización de investigaciones sobre la quimiotaxis de los países contribuyentes netos tronco ha demostrado ser un reto para una serie de razones. NCC tronco constituyen una población heterogénea de células madre que va a diferenciar si se cultivan a largo plazo, por lo tanto, los países contribuyentes netos tronco ha de ser obtenida de la explantación de la primaria del tronco a nivel de NT. Los métodos convencionales para estudiar la respuesta quimiotáctica de las poblaciones de células distribuidas homog...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Omega Científico </td><td> DM-22 </td><td></td></tr><tr><td> Solución de penicilina estreptomicina </td><td> Omega Científico </td><td> PS-20 </td><td> Concentración de 100X </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Omega Científico </td><td> GS-60 </td><td> Concentración de 100X </td></tr><tr><td> El suero fetal bovino </td><td> Omega Científico </td><td> FB-11 </td><td> Lote # 105247 (o cualquier otro que sea comparable) </td></tr><tr><td> Modificado Zigmond cámara </td><td> Hecho en casa </td><td> N / A </td><td> Volumen de embalse: 160 ~ ea l, para obtener especificaciones adicionales, ver fig. 4 y el protocolo adicional de fabricación </td></tr><tr><td> Placa de cultivo celular </td><td&gt; Denville </td><td> T6040 </td><td> 40 x 10 mm </td></tr><tr><td> Fibronectina </td><td> BD </td><td> 354008 </td><td> Foto 10 veces más preparada mediante la dilución de 1 mg FN en 1 ml de H 2 O y 9 ml DMEM </td></tr><tr><td> Cubreobjetos </td><td> Pescador </td><td> 12-548-B </td><td> Precleaned, 22 x 22 mm </td></tr><tr><td> L15 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30525.02 </td><td></td></tr><tr><td> Jalea de petróleo </td><td> Comodidades </td><td> 011110794642 </td><td> 100% </td></tr><tr><td> Tubo de centrífuga </td><td> Biologix </td><td> 10-9152 </td><td> 15 ml </td></tr><tr><td> Dispasa </td><td> Sistemas de Celdas de </td><td> 4Z0-850 </td><td> Concentración de 10X </td></tr><tr><td> Jeringa </td><td> BD </td><td> 309602 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Aguja </td><td> BD </td><td> 305127 </td><td> 25 G x 1,5 pulgadas </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488-IgM </td><td> Yonvitrogen </td><td> A21042 </td><td> Archivo es de 2 mg / ml, 7 moles tinte / mol IgM </td></tr><tr><td> Pinza de disección </td><td> FST </td><td> Misc. </td><td> Dumont n º 5 o el 55, con punta recta, acero inoxidable o titanio </td></tr><tr><td> Aguja de tungsteno </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Hecho en casa, coloca en un soporte de pasador </td></tr><tr><td> Blunt Forceps </td><td> Tiemann </td><td> 160-18 </td><td> Se utiliza para transferir los embriones al Ringer de yema de huevo </td></tr></tbody></table> Protocolo Suplementario: Fabricación de una cámara modificada Zigmond Por favor refiérase a la Figura 4 como referencia para el protocolo siguiente: <ol><li> Compra de una hoja de 3 / 16 &quot;de espesor de acrílico pulido (4,45 mm de espesor real). </li><li> Utilizando una sierra de mesa, cortar los espacios en blanco cámara de gran tamaño a las dimensiones aproximada de 33,25 mm x 64,57 mm. Esto permite a los 3.175 mm de material adicional para el mecanizado. </li><li> Set en blanco en una cámara de vise. Con una fresadora y un 6,35 mm (1 / 4 &quot;) poco la fresa, el acabado de mecanizado de los lados de la cámara a sus dimensiones exactas: 30,07 mm x 61,39 mm. </li><li> La posición de la cámara en blanco en la máquina de fresado y localizar el centro del blanco a lo largo de los dos ejes X e Y con un palpador de aristas, y luego a cero la ubicación del centro. </li><li> Adquirir la altura de la cámara (eje Z) al tocar la fresa final a la superficie superior y el cero de la altura. </li><li> El uso de un 3,91 mm (0,154 &quot;) poco la fresa, compensar el poco 3,03 mm a lo largo del eje X (dirección positiva) para el primer depósito. Comienza de mecanizado en la cámara hasta una profundidad de 2,84 mm mientras que se mueve a lo largo del eje Y ( dirección positiva) de 7,62 mm (0,300 &quot;) y luego atravesar a 7,62 mm (0,300&quot;) en la dirección opuesta (negativa) en dirección a una longitud total de embalse de 15,24 mm (0,600 &quot;). Compensar el poco a 3,03 mm (0,119 &quot;) a lo largo del eje X (sentido negativo) y repetir el mismo proceso para el segundo depósito. </li><li> Posición de la cámara en su extremoy hacer un agujero con un 1,09 mm (0,043 pulgadas) broca en el extremo de cada depósito (4 en total) que conecta el extremo del depósito al lado de la cámara de carga media durante la experimentación. </li><li> Sumerja la cámara bien en agua tibia y jabón para ayudar a eliminar todos los contaminantes químicos. </li><li> Remojo y enjuague la cámara bien en agua doblemente destilada para eliminar todo el jabón. Las cámaras están ahora listos para su uso como se describió anteriormente. </li></ol>

analysis of trunk neural crest cell migration using a modified zigmond chamber assay

Las células de la cresta neural (CCN) son una población transitoria de células presentes en el desarrollo de vertebrados que emigrar del tubo neural dorsal (NT) tras someterse a un 1,2 transición epitelio-mesenquimal. Después de la EMT, los países contribuyentes netos migrar grandes distancias a lo largo de las vías estereotipados hasta alcanzar sus objetivos. NCC diferenciarse en una amplia gama de tipos de células incluyendo neuronas, células gliales, los melanocitos, células cromafines y 1-3. La capacidad de los países contribuyentes netos para alcanzar y reconocer a sus lugares de destino adecuado es fundamental para la formación adecuada de todas las estructuras que contienen tronco NCC componentes derivados 3. Elucidar los mecanismos de orientación para el tronco NCC migración ha sido por lo tanto, una cuestión de gran importancia. Numerosas moléculas se ha demostrado que guía la migración NCC 4. Por ejemplo, los países contribuyentes netos tronco se sabe que son repelidos por las señales negativas como la orientación semaforina, efrina, y ligandos de hendidura 5-8. Sin embargo, nohasta hace poco cualquier quimiotácticos de los países contribuyentes netos tronco se han identificado 9. Convencionales métodos in vitro para estudiar el comportamiento quimiotáctico de células adherentes mejor trabajar con inmortalizado, las células homogéneamente distribuidos, pero son más difíciles de aplicar a ciertos cultivos primarios de células madre que inicialmente carecen de una distribución homogénea y diferenciar rápidamente (por ejemplo, los países contribuyentes netos). Un enfoque para homogeneizar la distribución de los países contribuyentes netos del tronco de los estudios de quimiotaxis es aislar a los países contribuyentes netos tronco de cultivos primarios de explantes NT, a continuación, levante y replate a ser casi el 100% confluente. Sin embargo, este enfoque requiere de placas grandes cantidades de tiempo y esfuerzo para explante número suficiente de células, es duro, y distribuye los países contribuyentes netos del tronco de una manera diferente a la que se encuentra en condiciones in vivo. Aquí, se presenta un enfoque in vitro que es capaz de evaluar la quimiotaxis y otras respuestas migratorias de los países contribuyentes netos tronco sin requiringa la distribución de células homogéneas. Esta técnica utiliza imágenes a intervalos de tiempo de la primaria, imperturbable NCC tronco dentro de una cámara modificada Zigmond (una cámara estándar de Zigmond se describe en otro 10). Mediante la exposición de los países contribuyentes netos del tronco en la periferia de la cultura a un gradiente de chemotactant que es perpendicular a su direccionalidad predijo naturales, las alteraciones en la polaridad migratorios inducidos por el gradiente de chemotactant aplicada puede ser detectado. Esta técnica es de bajo costo, requiere el cultivo de sólo dos explantes por tratamiento NT replicar, evita la elevación de células duras (por ejemplo, tripsina), las hojas de los países contribuyentes netos tronco en una distribución más similar a las condiciones in vivo, reduce la cantidad de tiempo que transcurre entre la explantación y la experimentación (lo que probablemente reduce el riesgo de diferenciación), y permite lapso de tiempo la evaluación de numerosas características migratorias.

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Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

Un enfoque para analizar la migración de las células explantados (células troncales de la cresta neural) se describe. Este método es barato, amable y capaz de distinguir la quimiotaxis de los dos quimiocinesis y otras influencias en la polaridad migratorias, como las derivadas de las interacciones célula-célula en el tronco principal cultivo de células neuronales de la cresta.

El análisis de la migración de células troncales neurales Crest utilizando una versión modificada del ensayo Zigmond Cámara

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after ...

analysis-trunk-neural-crest-cell-migration-using-modified-zigmond

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.4K vistas.  California State University, Northridge. Un enfoque para analizar la migración de las células explantados (células troncales de la cresta neural) se describe. Este método es barato, amable y capaz de distinguir la quimiotaxis de los dos quimiocinesis y otras influencias en la polaridad migratorias, como las derivadas de las interacciones célula-célula en el tronco principal cultivo de células neuronales de la cresta.

Video: Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

El aislamiento y la expansión de las células troncales nerviosas de ratones adultos mediante el ensayo de neuroesfera

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Investigación

Neurociencias

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

El establecimiento de embriones de ratón con células madre neurales Cultura mediante el ensayo de neuroesfera

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

Neural formadoras de colonias ensayo de células: un ensayo para discriminar Bona Fide células troncales nerviosas de células progenitoras neurales

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a well-characterized niche for adult stem cells1. This segment of the outer root sheath contains a number of different types of stem cells, including epithelial stem cells2, melanocyte stem cells3 and neural crest like stem cells4-7. Hair follicles represent an accessible and rich source for different types of human stem cells. We and others have isolated neural crest stem cells (NCSCs) from human fetal and adult hair follicles4,5. These human stem cells are label-retaining cells and are capable of self-renewal through asymmetric cell division in vitro. They express immature neural crest cell markers but not differentiation markers. Our expression profiling study showed that they share a similar gene expression pattern with murine skin immature neural crest cells. They exhibit clonal multipotency that can give rise to myogenic, melanocytic, and neuronal cell lineages after in vitro clonal single cell culture. Differentiated cells not only acquire lineage-specific markers but also demonstrate appropriate functions in ex vivo conditions. In addition, these NCSCs show differentiation potential toward mesenchymal lineages. Differentiated neuronal cells can persist in mouse brain and retain neuronal differentiation markers. It has been shown that hair follicle derived NCSCs can help nerve regrowth, and they improve motor function in mice transplanted with these stem cells following transecting spinal cord injury8. Furthermore, peripheral nerves have been repaired with stem cell grafts9, and implantation of skin-derived precursor cells adjacent to crushed sciatic nerves has resulted in remyelination10. Therefore, the hair follicle/skin derived NCSCs have already shown promising results for regenerative therapy in preclinical models.
Somatic cell reprogramming to induced pluripotent stem (iPS) cells has shown enormous potential for regenerative medicine. However, there are still many issues with iPS cells, particularly the long term effect of oncogene/virus integration and potential tumorigenicity of pluripotent stem cells have not been adequately addressed. There are still many hurdles to be overcome before iPS cells can be used for regenerative medicine. Whereas the adult stem cells are known to be safe and they have been used clinically for many years, such as bone marrow transplant. Many patients have already benefited from the treatment. Autologous adult stem cells are still preferred cells for transplantation. Therefore, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin/hair follicles are a valuable source for regenerative medicine.

This article presents a robust protocol for isolation and culture of neural crest stem cells from human hair follicles.

Aislamiento y cultivo de células troncales de la cresta neural de los folículos del cabello humano

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Ratón reproducible aplastamiento del nervio ciático y posterior evaluación de la regeneración mediante el análisis de músculo entero Monte

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. Chimeric avian embryos, in which quail donor tissue is transplanted into a chick embryo in ovo, combine the power of indelible genetic labeling of cell populations with the ease of manipulation presented by the avian embryo.
Quail-chick chimeras are a classical tool for tracing migratory neural crest cells (NCCs)1-3. NCCs are a transient migratory population of cells in the embryo, which originate in the dorsal region of the developing neural tube4. They undergo an epithelial to mesenchymal transition and subsequently migrate to other regions of the embryo, where they differentiate into various cell types including cartilage5-13, melanocytes11,14-20, neurons and glia21-32. NCCs are multipotent, and their ultimate fate is influenced by 1) the region of the neural tube in which they originate along the rostro-caudal axis of the embryo11,33-37, 2) signals from neighboring cells as they migrate38-44, and 3) the microenvironment of their ultimate destination within the embryo45,46. Tracing these cells from their point of origin at the neural tube, to their final position and fate within the embryo, provides important insight into the developmental processes that regulate patterning and organogenesis.
Transplantation of complementary regions of donor neural tube (homotopic grafting) or different regions of donor neural tube (heterotopic grafting) can reveal differences in pre-specification of NCCs along the rostro-caudal axis2,47. This technique can be further adapted to transplant a unilateral compartment of the neural tube, such that one side is derived from donor tissue, and the contralateral side remains unperturbed in the host embryo, yielding an internal control within the same sample2,47. It can also be adapted for transplantation of brain segments in later embryos, after HH10, when the anterior neural tube has closed47.
Here we report techniques for generating quail-chick chimeras via neural tube transplantation, which allow for tracing of migratory NCCs derived from a discrete segment of the neural tube. Species-specific labeling of the donor-derived cells with the quail-specific QCPN antibody48-56 allows the researcher to distinguish donor and host cells at the experimental end point. This technique is straightforward, inexpensive, and has many applications, including fate-mapping, cell lineage tracing, and identifying pre-patterning events along the rostro-caudal axis45. Because of the ease of access to the avian embryo, the quail-chick graft technique may be combined with other manipulations, including but not limited to lens ablation40, injection of inhibitory molecules57,58, or genetic manipulation via electroporation of expression plasmids59-61, to identify the response of particular migratory streams of NCCs to perturbations in the embryo's developmental program. Furthermore, this grafting technique may also be used to generate other interspecific chimeric embryos such as quail-duck chimeras to study NCC contribution to craniofacial morphogenesis, or mouse-chick chimeras to combine the power of mouse genetics with the ease of manipulation of the avian embryo.62

An approach for analyzing migration and eventual fate of avian neural crest cells in quail-chick chimeric embryos is described. This method is a simple and straightforward technique for tracing neural crest cells during migration and differentiation that are otherwise difficult to distinguish within an unmanipulated chick embryo.

Análisis de la migración de la cresta neural y la diferenciación de las especies cruzadas Trasplante

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of the central nervous system (CNS); namely, astrocytes, oligodendrocytes and neurons. These characteristics make neural stem and progenitor cells an invaluable renewable source of cells for in vitro studies such as drug screening, neurotoxicology and electrophysiology and also for cell replacement therapy in many neurological diseases. In practice, however, heterogeneity of NSC progeny, low production of neurons and oligodendrocytes, and predominance of astrocytes following differentiation limit their clinical applications. Here, we describe a novel methodology for the generation and subsequent purification of immature neurons from murine NSC progeny using fluorescence activated cell sorting (FACS) technology. Using this methodology, a highly enriched neuronal progenitor cell population can be achieved without any noticeable astrocyte and bona fide NSC contamination. The procedure includes differentiation of NSC progeny isolated and expanded from E14 mouse ganglionic eminences using the neurosphere assay, followed by isolation and enrichment of immature neuronal cells based on their physical (size and internal complexity) and fluorescent properties using flow cytometry technology. Overall, it takes 5-7 days to generate neurospheres and 6-8 days to differentiate NSC progeny and isolate highly purified immature neuronal cells.

This video protocol demonstrates a novel method for the generation and subsequent purification of neuronal progenitor cells from a renewable source of neural stem cells (NSCs) based on their physical (size and internal granularity) and fluorescent properties using flow cytometry technology.

El ensayo neuroblasto: un ensayo para la generación y enriquecimiento de las células progenitoras neuronales de la diferenciación de la progenie de células madre neurales Usando citometría de flujo

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Co-analysis of Brain Structure and Function using fMRI and Diffusion-weighted Imaging

The study of complex computational systems is facilitated by network maps, such as circuit diagrams. Such mapping is particularly informative when studying the brain, as the functional role that a brain area fulfills may be largely defined by its connections to other brain areas. In this report, we describe a novel, non-invasive approach for relating brain structure and function using magnetic resonance imaging (MRI). This approach, a combination of structural imaging of long-range fiber connections and functional imaging data, is illustrated in two distinct cognitive domains, visual attention and face perception. Structural imaging is performed with diffusion-weighted imaging (DWI) and fiber tractography, which track the diffusion of water molecules along white-matter fiber tracts in the brain (Figure 1). By visualizing these fiber tracts, we are able to investigate the long-range connective architecture of the brain. The results compare favorably with one of the most widely-used techniques in DWI, diffusion tensor imaging (DTI). DTI is unable to resolve complex configurations of fiber tracts, limiting its utility for constructing detailed, anatomically-informed models of brain function. In contrast, our analyses reproduce known neuroanatomy with precision and accuracy. This advantage is partly due to data acquisition procedures: while many DTI protocols measure diffusion in a small number of directions (e.g., 6 or 12), we employ a diffusion spectrum imaging (DSI)1, 2 protocol which assesses diffusion in 257 directions and at a range of magnetic gradient strengths. Moreover, DSI data allow us to use more sophisticated methods for reconstructing acquired data. In two experiments (visual attention and face perception), tractography reveals that co-active areas of the human brain are anatomically connected, supporting extant hypotheses that they form functional networks. DWI allows us to create a "circuit diagram" and reproduce it on an individual-subject basis, for the purpose of monitoring task-relevant brain activity in networks of interest.

We describe a novel approach for simultaneous analysis of brain function and structure using magnetic resonance imaging (MRI). We assess brain structure with high-resolution diffusion-weighted imaging and white-matter fiber tractography. Unlike standard structural MRI, these techniques allow us to directly relate anatomical connectivity to functional properties of brain networks.

Co-análisis de la estructura y función cerebral mediante resonancia magnética funcional y la difusión de imágenes ponderado

The study of complex computational systems is facilitated by network maps, such as circuit diagrams. Such mapping is particularly informative when ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Aislamiento y cultivo de células de la cresta neural de embriones murinos del Tubo Neural

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

The discovery of neural stem and progenitor cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult mammalian brain has led to a body of research aimed at utilizing the multipotent and proliferative properties of these cells for the development of neuroregenerative strategies. A critical step for the success of such strategies is the mobilization of NPCs toward a lesion site following exogenous transplantation or to enhance the response of the endogenous precursors that are found in the periventricular region of the CNS. Accordingly, it is essential to understand the mechanisms that promote, guide, and enhance NPC migration. Our work focuses on the utilization of direct current electric fields (dcEFs) to promote and direct NPC migration - a phenomenon known as galvanotaxis. Endogenous physiological electric fields function as critical cues for cell migration during normal development and wound repair. Pharmacological disruption of the trans-neural tube potential in axolotl embryos causes severe developmental malformations1. In the context of wound healing, the rate of repair of wounded cornea is directly correlated with the magnitude of the epithelial wound potential that arises after injury, as shown by pharmacological enhancement or disruption of this dcEF2-3. We have demonstrated that adult subependymal NPCs undergo rapid and directed cathodal migration in vitro when exposed to an externally applied dcEF. In this protocol we describe our lab's techniques for creating a simple and effective galvanotaxis assay for high-resolution, long-term observation of directed cell body translocation (migration) on a single-cell level. This assay would be suitable for investigating the mechanisms that regulate dcEF transduction into cellular motility through the use of transgenic or knockout mice, short interfering RNA, or specific receptor agonists/antagonists.

In this protocol we demonstrate how to construct custom chambers that permit the application of a direct current electric field to enable time-lapse imaging of adult brain derived neural precursor cell translocation during galvanotaxis.

Un ensayo Galvanotaxis por análisis de la cinética precursoras neurales migración celular en un campo aplicado externamente directo Corriente Eléctrica

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...