Los autores agradecen a los miembros del laboratorio Lwigale para la crítica del manuscrito. SLG se apoya en una Ruth L. Kirschstein NRSA beca del National Eye Institute (F32 EY02167301). PYL es apoyada por el National Eye Institute (EY018050).

1. Incubar de pollo y huevos de codorniz a la etapa deseada Para HH9 embriones, los tiempos típicos de incubación van desde 29-33 horas a 38 ° C. 63 <ol><li> Lave todos los residuos de los huevos con agua tibia. </li><li> Organizar los huevos de gallina en la bandeja en posición horizontal. Marcar la cara superior con lápiz; esto corresponderá a la región donde se localiza el embrión. Incubar los huevos de codorniz final contundente arriba. </li><li> Lugar en los 38 ° C humidificado incubadora. Encienda la función de balanceo. </li></ol> 2. Prepare los huevos de ventanas y la disección <ol><li> Retire los huevos de incubadora, y esterilizar las tapas con el 70% de etanol. Lo mejor es rociar en el etanol y límpiela rápidamente con una toalla de papel o Kimwipe para evitar la absorción de etanol a través de la cáscara del huevo. </li><li> Lugar huevo de gallina en un soporte individual de los huevos (se utiliza una placa de Petri cubierta con toallas de papel doblado, por ejemplo, &quot;Kimwipes&quot;). Con unas pinzas de AA, puntee en una pequeña holE en la superficie superior de la cáscara del huevo en el extremo puntiagudo del huevo. </li><li> Retire 1,5 3 ml de la luz de la albúmina de huevo de gallina con una aguja hipodérmica 18 ½ G y jeringa de 5 ml. Lo mejor es insertar la aguja verticalmente en el agujero, con el bisel hacia el extremo puntiagudo del huevo (Figura 2A). De esta manera, cuando se retira la albúmina, existe poco riesgo de dañar accidentalmente a través de la yema de succión. Deseche la albúmina. Este paso reducirá la yema de huevo y el embrión dentro del huevo para permitir una ventana que se abrirá en la cáscara del huevo. </li><li> Limpie el agujero con un 70% de etanol como se describió anteriormente y sellarlo con cinta adhesiva. Es importante que la cáscara de huevo que rodea el agujero está totalmente desprovisto de albúmina y seco o el adhesivo no se sellan. </li><li> Con las pinzas de AA, toque otro agujero en la superficie marcada superior del huevo horizontal, no del todo en el ápice. Tenga cuidado de no dejar las pinzas de ir demasiado lejos a través de la cáscara de los huevos para evitar dañar la yema de huevo o embrión. </li><li> Eninserte un lado de las curvas fórceps iris en el orificio paralelo a la cáscara huevos. Pinchazos hacia abajo en la cáscara, que trabaja en un movimiento circular para romper un ~ 2 cm de diámetro en la ventana en la cáscara del huevo de pollo. Deseche la cáscara de los huevos eliminados. Otra forma es cubrir la superficie superior del huevo con cinta de embalaje y utilizar un par de tijeras para cortar por la ventana. Esto minimiza la posibilidad de escombros cascarón caer en el huevo. El embrión debe aparecer como un disco opaco en la parte superior de la yema. Deseche todos los huevos no fertilizados (identificado por una pequeña mancha blanca en la superficie de la yema de huevo, o la ausencia de blastodermo). </li><li> Inyectar una pequeña cantidad de tinta china (diluido 1:10 en solución de Ringer estéril que contiene &quot;Pen / Strep&quot; antibiótico: concentración final 100 mg / ml de penicilina y 100 ug / ml de estreptomicina) por debajo de la blastodermo para ayudar a organizar el embrión. Utilizar una jeringa de 1 ml y 26 ½ aguja hipodérmica G, doblado en un ángulo de 45 ° en la base de la aguja, con el bisel hacia arriba, alternativamente, un may utilizar una tira de vidrio pipeta de Pasteur y de aparato bucal de pipeteado (gafas de protección cuando se inclina la aguja hipodérmica o romper la aguja de vidrio). La punción de la membrana de la yema fuera del perímetro de la blastodermo y deslice la punta de la aguja por debajo del embrión, cerca de la superficie de la yema, pero no en las capas embrionarias (Figura 2B). Inyectar sólo tinta suficiente para delinear el embrión, luego, con cuidado retire la aguja (Figura 2C). La inyección de tinta en exceso puede conducir a la muerte del embrión. Es importante no inyectar cualquier burbuja de aire debajo del embrión, ya que esto puede ser una fuente de contaminación. Nota: Todos solución de Ringer utilizado en este procedimiento se esteriliza y contiene Pen / Strep como se definió anteriormente. Fosfato estéril (PBS) también es una alternativa aceptable a la solución de Ringer en todos los pasos de este protocolo. </li><li> Etapa del embrión según Hamburger y Hamilton 63 y grabar la escena en la cáscara de los huevos con tinta indeleble o lápiz. Las etapas se evalúan mejor en estéreoomicroscopy, con fibra óptica de las fuentes de luz &quot;cuello de cisne&quot;, que tienen una carga térmica limitada. </li><li> Aplicar 2-3 gotas de solución de Ringer estéril caliente a la superficie del embrión para evitar la deshidratación y la contaminación. Temporalmente sellar la ventana con parafilm estirada sobre la superficie del huevo. </li><li> Repita los pasos 2.2-2.9, con todos los huevos de pollo antes de comenzar los experimentos de transplante. </li><li> Dado que los embriones de codorniz sólo se utilizan para tejidos de donantes, en los pasos ovo 2.2-2.9 puede omitirse. Para la preparación de ex ovo de embriones de donantes, huevos de codorniz se incuban parte roma y abrió sus puertas en esta región con pinzas curvas para mostrar el embrión. Utilizando unas tijeras de disección, hacer cuatro cortes en la forma de un cuadrado a través de la membrana vitelina y blastodermo fuera del embrión (asegúrese de que todos los cortes se encuentran). El uso de un fórceps de iris curvas, agarre suavemente un borde de corte y levante el embrión del huevo y la transfiere a la solución de Ringer en una placa de Petri. Alternativamente, se puede utilizar la curvad iris fórceps para levantar el embrión extirpados de debajo, o una cuchara embrión o pipeta de transferencia de plástico cortar a través de la parte más ancha del cilindro, puede ser utilizado para transferir el embrión del huevo. Retire con cuidado la membrana vitelina por el n º 5 fórceps. Recoger los embriones de codorniz restantes como anteriormente, y la etapa bajo un microscopio de disección. </li></ol> 3. Preparar el embrión de acogida para recibir el injerto <ol><li> Retirar parafina desde el host (chica) de embriones y el uso de una aguja de tungsteno afilado o unas pinzas # 5, arrancar un pequeño agujero en la membrana vitelina en la región deseada del tubo neural (Figura 3). </li><li> Añadir una gota de solución de Ringer para el embrión. Tenga cuidado de mantener el embrión completamente sumergido en la solución de Ringer durante todo el procedimiento para evitar la deshidratación del tejido. Mantener la adición de gotas de solución de Ringer a la superficie del embrión a través de una pipeta de transferencia, si es necesario. </li><li> Usando una aguja de vidrio tirado, cuidadosamente haga rostral y caUdal incisiones transversales correspondientes a la longitud y la región de interés en el tubo neural dorsal. (Pulled agujas de vidrio se generan a partir de silicio tubos capilares de vidrio que han sido extraídos por medio de calor con una aguja tirando aparato.) Para los injertos unilaterales las incisiones sólo debe extenderse a la luz del tubo neural dorsal, y para los injertos bilaterales, hacer las incisiones a través la totalidad del tubo neural dorsal. A continuación, corte bilateral entre el tubo neural y el dorsal del mesodermo paraxial. </li><li> Separar cuidadosamente el explante escindió del tubo neural luego retirarlo del embrión por aspiración en una micropipeta de vidrio (Figura 3B). </li></ol> 4. Prepare el tejido del injerto del donante <ol><li> Elige una etapa de concordancia de embriones de codorniz. Sostenga el embrión hacia abajo con unas pinzas de AA, retire la membrana vitelina, y los impuestos especiales de una región de tamaño similar del tubo neural como se describió anteriormente (3.3 a 3.4) (Figura 3A&#39;-B &#39;). Dependiendo de las necesidades de su experimento, esta región puede ser unregión complementaria de la de acogida (de pollo) del tubo neural o de una región diferente a lo largo del eje rostro-caudal. (Nota: para las grandes injertos regionales, incluyendo injertos completos del tubo neural, los investigadores pueden desear agregar una digestión de la proteasa en este paso para eliminar los tejidos adherentes mesenquimales del tejido del donante antes del trasplante Sin embargo, para los pequeños injertos dorsales del tubo neural en las primeras etapas. , como se detalla aquí, la digestión de proteasa no es necesario ya que el tubo neural se separa fácilmente de mesénquima adyacente por medio de técnicas quirúrgicas estrictamente.) </li></ol> 5. Injerto del tejido <ol><li> Aspirar el explante donante en una micropipeta de vidrio que contenía la solución de Ringer. Tenga cuidado de no introducir burbujas en la pipeta. </li><li> Transferir el explante adyacente a la región escindió del huésped polluelo. Utilizando aguja tira de cristal, orientar el explante y guiar suavemente en la región ablacionada (Figura 3C). </li><li> Añadir con cuidado unas gotas de solución de Ringerpara el embrión para evitar la deshidratación. Tenga cuidado de no dejar caer el líquido directamente en el sitio del injerto, ya que puede desplazar el injerto. </li><li> Cierre la ventana con cinta de embalaje. Asegúrese de que la cinta de juntas de toda la región del huevo ventana. Esto evita la deshidratación y la contaminación del embrión durante la incubación posterior. </li><li> Vuelva a colocar el huevo a la incubadora hasta el punto deseado. Asegúrese de que la &quot;mecedora&quot; la función está desactivada, mientras que la incubación de las quimeras. Los huevos se pueden girar con la mano suavemente dos veces al día ya que esto puede aumentar su viabilidad si las etapas posteriores del desarrollo se dirigen. </li></ol> 6. Preparar embriones quiméricos para seccionar <ol><li> En el punto final experimental, cortó la cinta que cubre la ventana con unas tijeras finas. </li><li> Sujete el borde del blastodermo con unas pinzas curvas iris (más fácil que ver con puntas estriadas), a continuación, cortar el embrión fuera de la yema de huevo con 4 grandes cortes fuera de los límites del blastodermo. </li&gt; <li> Transferir el embrión a una placa de Petri que contenía solución de Ringer. Tenga cuidado para minimizar la exposición del embrión al aire con el fin de evitar la deshidratación del tejido. </li><li> Bajo microscopía estereoscópica, con cuidado separar la membrana vitelina del blastodermo usando # 5 fórceps. </li><li> Con cuidado, organizar el embrión en el plato para que el embrión se encuentra en la misma orientación, ya que estaba en el huevo, con membranas que rodean el plano presentado. </li><li> El uso de disección agujas hechas de tungsteno 64 cables para eliminar limpiamente el blastodermo circundante del embrión por la organización de la aguja en el límite del embrión y tejidos extraembrionarias, con la longitud del alambre de tungsteno paralelo a la parte inferior del plato. Use un movimiento suave para cortar a través de los tejidos. </li><li> Retire con cuidado el amnios por el n º 5 fórceps. En este punto usted puede, o bien desea más disección de la región de su interés, o dejar todo el embrión. </li><li> Transferencia del embrión a la helada PARAF 4%ormaldehyde y el rock la noche a 4 ° C. </li><li> Preparar las muestras e incorporar para la sección crio-o parafina. </li></ol> Trace el tejido injertado en el embrión de acogida. Existen varias técnicas para la identificación de los tejidos de codorniz en un embrión de pollo, incluyendo la detección de codorniz nucleolos por tinción hematoxilina (núcleos de codorniz tienen muy grandes, más oscuros que los núcleos de tinción de inclusiones de pollo), la reacción de Feulgen-Rossenbeck, naranja de acridina-o biz benzamida mancha de combinado con microscopia electrónica, o inmunomarcaje para la codorniz antígenos específicos 3,47,65,66. Aquí se utiliza el antígeno QCPN estándar y todo el montaje o la sección de técnicas de inmunofluorescencia para identificar las células de la cresta neural de codorniz en la codorniz, pollo quimeras (Figura 4). Esta técnica proporciona la mayor flexibilidad en el diseño experimental, como la inmunofluorescencia QCPN también puede combinarse con otros anticuerpos para identificar las células diferenciadas derivadas del donante (codornices) del tejido. Utilice Standaª todo el montaje o las técnicas de la sección de inmunofluorescencia para etiquetar las células derivadas de la codorniz en quimeras. 7. Los resultados representativos Una imagen representativa de la región injertada del tubo neural después de 6 horas de re-incubación (para HH11) muestra la incorporación de la espera del donante injertadas (codornices) tejidos en el huésped (pollo) del tubo neural (Figura 4). Los embriones que muestran la integración incompleta del injerto, o el desarrollo asimétrico de la región craneal o somitas después reincubación debe ser desechada. Sección transversal de la región injertado en HH11 CCN muestran marcadas con el HNK-1 migrar lateralmente hacia fuera del tubo neural. Las células de codorniz que contribuyen a la corriente migratoria del NCC, y el tubo neural, están claramente etiquetados con QCPN (Figura 4B). En etapas posteriores, codorniz CNC derivados de células se puede buscar a su tejido diana final. QCPN células marcadas se intercalan en el mesénquima del embrión de pollodel proceso maxilar en E5 (Figura 4C). El anticuerpo QCPN se puede combinar fácilmente con otros anticuerpos para examinar la diferenciación de las codornices derivados de los países contribuyentes netos en el entorno de acogida. Codorniz CNC derivados de las neuronas sensoriales del trigémino son etiquetados por QCPN y Tuj1 anticuerpos (Figura 4D). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3622/3622fig1.jpg" /> Figura 1. Descripción del procedimiento experimental y los instrumentos necesarios. Un anfitrión) (chica) y embriones de donantes (codornices) debe estar en el escenario acompañado. Para etiquetar la corriente que contribuye a la CNC el ganglio del trigémino y la región maxilo-mandibular, HH9 es ideal. En HH9, el tubo neural se está empezando a cerrarse en la región rostral, pero aún no está completamente sellada. La línea gris en el diagrama representa la línea media del tubo neural de cierre. Las líneas blancas punteadas indican las líneas de corte para extirpar una región mesencéfalo del lado derecho del tubo neural del anfitrión y el donante embryos. La región escindió del embrión huésped se desecha y el tejido del donante trasplantadas para generar en el embrión quimérico. B) Los instrumentos necesarios son: una jeringa) 5 ml con 18 ½ aguja de calibre hipodérmica, b) 1 ml jeringa con 26 ½ hipodérmica G inclinación de la aguja en ángulo de 45 °, c) la tinta china, d) la cinta de embalaje transparente, e) pipeta de vidrio con la boca pipeteo aparato, f) 60 mm de placa de Petri, g) AA fórceps, h) con fórceps curvos iris con puntas estriadas, i) # 5 pinzas, tijeras finas j), k) afilado alambre de tungsteno, l) sacó aguja de cristal, m) Parafilm cuadrados. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3622/3622fig2.jpg" /> Figura 2. Preparación de los huevos y embriones. A) transversal diagrama del huevo, incluyendo el punto de inserción ideal de 18 ½ aguja hipodérmica G para la retirada de la luz de albúmina. B) Después de la retirada de la luz ~ 3 ml de albúmina, la yema de huevo y el embrión dentro del huevo disminuye, permitiendo a los investigadores para cortar una &quot;ventana&quot; (flechas) en tque la cáscara de huevo para acceder al embrión. Tinta china, diluido 1:10 en solución de Ringer estéril, entonces puede ser inyectada debajo de la blastodermo para proporcionar un contraste de montaje fácil de los embriones. C) de embrión de pollo después de entintar. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3622/3622fig3.jpg" /> Figura 3. Esquema y ejemplos de la etapa 9 HH embriones de donantes y de acogida en cada paso del procedimiento de injerto. Un embrión) El polluelo de acogida. Las líneas punteadas en el diagrama indica que la membrana vitelina debe ser arrancada para acceder a la región craneal para el injerto. Una vez rota la aleta triangular de membrana vitelina deben ser peladas caudalmente. Caja de imagen indica el recuadro utilizado en (BC). A &#39;) de los donantes de embriones de codorniz. La imagen es de embriones de donantes extirpados de huevo y colocar en placa de Petri para la disección del tejido injertado. Caja de imagen indica el recuadro utilizado en (B &#39;). Las líneas punteadas en el diagrama esquemático (A &#39;) indican que la vitelina y las membranas yema se debe cortar con el fin de eliminar el tél embrión del huevo. B) Host de embriones con la región del mesencéfalo unilateral del tubo neural extirpado (flechas blancas) en espera de injerto. La línea de puntos en el diagrama esquemático indica que los cortes deben hacerse extirpar el tubo neural en la región del cerebro medio. ) B &#39;de embriones de donantes con el dorsal de tejido neural injerto de tubo extirpado (injerto de tejido indicado por flechas negras). La línea de puntos en el diagrama indica que los cortes deben hacerse en el embrión de codorniz de extirpar tejido del donante para el injerto unilateral de la región del cerebro medio del tubo neural. C) embrión quimérico después del injerto de codorniz explante dorsal del tubo neural en la región del cerebro medio pollito. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3622/3622fig4.jpg" /> Figura 4. Inmunofluorescencia para detectar la codorniz específica QCPN antígeno nuclear de células derivadas del donante en el embrión quimérico. A) todo el montaje de la imagen de quimera HH11 (injertado en HH9) que muestra tinción QCPN en rojo, y HNK-1 tinción (un marcador de la migración de los países contribuyentes netos) enverde. Un aumento de 10X, vista dorsal. B) Sección transversal a través del embrión en (A), mostrando QCPN células positivas derivadas de codorniz en el tubo neural y migratorias NCC co-teñidos con HNK-1 (verde). Ampliación 40X. C) Sección transversal del maxilar a través del proceso de quimera E5 (se incubaron durante 3 días después del injerto), mostrando QCPN NCC-positivos derivados de las células (en rojo), que han emigrado de la región injertada del tubo neural en su ubicación final en el embrión. Un aumento de 10X. D) Sección a E5 quimera que muestra la contribución de codorniz deriva NCC al ganglio trigémino (rojo) y la diferenciación en Tuj1 neuronas positivas (verde). Ampliación 40X. *, Los países contribuyentes netos, MP, proceso maxilar, NT, del tubo neural; ganglio de TG, del trigémino.

Los autores no tienen nada que revelar.

El injerto de tubo neural codorniz en embriones de pollo de acogida se describe aquí es una técnica sencilla y de bajo costo para el seguimiento de subpoblaciones específicas de la migración de los países contribuyentes netos provenientes de diferentes regiones a lo largo del eje rostro-caudal 21,67-69. Esta técnica aprovecha las ventajas de la facilidad de acceso a los embriones aviares (en comparación a los embriones de mamíferos) y se puede combinar con otras técnicas, tales como la ablación del ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Los huevos del polluelo </td><td> Varios - usamos la Texas A &amp; M University, Departamento de Ciencias Avícolas, TX. </td><td></td></tr><tr><td> Huevos de codorniz </td><td> Varios - usamos Empresa Ozarks huevo, MO. </td><td></td></tr><tr><td> Huevo de incubadora (Lectura Digital 1502 Sportsman Incubadora w / Humedad de 110-120 voltios de CA) </td><td> <a href="http://www.poultrysupply.com" target="_blank">www.poultrysupply.com</a> </td><td> 1502 </td></tr><tr><td> Dumont AA fórceps, Inox con recubrimiento epóxico </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11210-10 </td></tr><tr><td> Cinta adhesiva </td><td> Cualquier tienda de suministros de oficina </td><td></td></tr><tr><td> Curva pinza Iris </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11065-07 </td></tr><tr><td> Yondia de tinta </td><td> Cualquier tienda de arte </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina (penicilina, estreptomicina) Solución </td><td> VWR International </td><td> 101447-068 </td></tr><tr><td> La cinta de embalaje transparente </td><td> Cualquier tienda de suministros de oficina </td><td></td></tr><tr><td> Aguja aparato tirando </td><td> Narashige, Japón </td><td> PE-21 </td></tr><tr><td> Vidrio sacó la aguja, hizo 1,5 a 1,8 x 100 mm tubo de vidrio de borosilicato capilar </td><td> Kimble Chase, </td><td> 34500 99 </td></tr><tr><td> Tirado pipeta de vidrio, a partir de 5 ¾ &quot;pipeta Pasteur </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-6A </td></tr><tr><td> Boca pipeta de aparatos (montaje de aspiración del tubo de pipeta calibrada microcapilar) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5177-52A </td></tr><tr><td> Dumont n º 5 con fórceps </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11251-30 </td></tr><tr><td> Tonelalambre de gsten, diámetro 0,1 mm </td><td> VWR International </td><td> AA10404-H2 </td></tr><tr><td> Los porta-agujas (niquelado soporte del pasador) </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 26018-17 </td></tr><tr><td> QCPN antisuero </td><td> Hibridoma Estudios del Desarrollo del Banco, de la Universidad de Iowa. </td><td> QCPN </td></tr><tr><td> Alexa Fluor anticuerpo secundario (por ejemplo, Alexa Fluor 594 cabra anti-ratón IgG1) </td><td> Invitrogen </td><td> A21125 </td></tr><tr><td> Solución de Ringer (2L): <ul><li> 14,4 g de NaCl </li><li> 0,34 g de CaCl 2 </li><li> 0,74 g de KCl </li><li> 0.230g de Na 2 HPO 4 </li><li> 0,04 g KH 2 PO 4 </li><li> ddH2O a 2L </li><li> Filtro y autoclave </li></ul></td><td> Todos los reactivos de Fisher Scientific </td><td><ul><li> 7647-14-5 </li><li> 10043-52-4 </li><li> 7447-40-7 </li><li> 7558-79-4 </li><li> 7778-77-0 </li></ul></td></tr></tbody></table>

analysis of neural crest migration and differentiation by cross-species transplantation

Embriones de aves proporcionar una plataforma única para el estudio de muchos procesos de desarrollo de vertebrados, debido a la facilidad de acceso de los embriones dentro del huevo. Quiméricos embriones de aves, en los que se trasplantan tejidos de donantes de codorniz en un embrión de pollo in ovo, se combinan el poder de etiquetado indeleble genética de las poblaciones de células con la facilidad de manipulación presentada por el embrión aviar. Pollo Codorniz-quimeras son una herramienta clásica para el seguimiento de las células migratorias de la cresta neural (CCN) 1-3. NCC son una población flotante migratorio de las células en el embrión, que se originan en la región dorsal del tubo neural en desarrollo 4. Se someten a un epitelio mesenquimal de transición y posteriormente migrar a otras regiones del embrión, donde se diferencian en varios tipos de células incluyendo el cartílago 5-13, 11,14-20 melanocitos, neuronas y células de 21-32. NCC son multipotentes, y su destino final es influirinfluenciados por 1) la región del tubo neural en el que se originan a lo largo del eje rostro-caudal del embrión 11,33-37, 2) las señales de las células vecinas a medida que migran 38-44, y 3) el microambiente de su última destino en el embrión 45,46. Seguimiento de estas células desde su punto de origen en el tubo neural, a su posición final y el destino en el embrión, aporta datos importantes en los procesos de desarrollo que regulan los patrones y la organogénesis. El trasplante de regiones complementarias del tubo neural de los donantes (homotópica injerto) o las diferentes regiones del tubo neural del donante (injerto heterotópico) puede revelar las diferencias en la pre-especificación de los países contribuyentes netos a lo largo del eje rostro-caudal 2,47. Esta técnica puede ser adaptado para el trasplante unilateral de un compartimiento del tubo neural, de tal manera que una parte se deriva de tejido de un donante, y los restos lado contralateral imperturbable en el embrión de acogida, yiElding un control interno dentro de la misma muestra, 2,47. También se puede adaptar para el trasplante de segmentos cerebrales de embriones posteriores, después de HH10, cuando el tubo neural anterior ha cerrado 47. Aquí mostramos las técnicas para la generación de pollos de codorniz-quimeras mediante el trasplante del tubo neural, lo que permite el seguimiento de los países contribuyentes netos migratorios derivados de un segmento discreto del tubo neural. Específicos de una especie de etiquetado de las células derivadas del donante con el anticuerpo específico de la codorniz QCPN 48-56 permite al investigador para distinguir los donantes y las células huésped en el punto final experimental. Esta técnica es sencilla, barata y tiene muchas aplicaciones, incluyendo el destino de mapeo, linaje de células de seguimiento, y la identificación de pre-eventos de modelado a lo largo del eje rostro-caudal 45. Debido a la facilidad de acceso para el embrión aviar, la técnica de injerto codorniz-polluelo puede combinarse con otras manipulaciones, incluyendo pero no limitado a ablación lente 40, la inyección de moléculas inhibidoras 57,58, o la manipulación genética a través de electroporación de 59-61 plásmidos de expresión, para identificar la respuesta de determinados flujos migratorios de los países contribuyentes netos a las perturbaciones en el programa de desarrollo del embrión. Además, esta técnica de injerto también puede utilizarse para generar otros embriones interespecíficos quiméricos tales como codorniz-pato quimeras para estudiar la contribución NCC a la morfogénesis craneofacial, o quimeras pollo ratón para combinar el poder de la genética del ratón con la facilidad de manipulación del embrión aviar 62.

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Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation

Un enfoque para el análisis de la migración y el destino final de las aves las células de la cresta neural en la codorniz, pollo embriones quiméricos se describe. Este método es una técnica simple y directa para el seguimiento de las células de la cresta neural durante la migración y la diferenciación que son difíciles de distinguir dentro de un embrión de pollo no manipulado.

Análisis de la migración de la cresta neural y la diferenciación de las especies cruzadas Trasplante

Avian embryos provide a unique platform for studying many vertebrate developmental processes, due to the easy access of the embryos within the egg. ...

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22.7K vistas.  Rice University. Un enfoque para el análisis de la migración y el destino final de las aves las células de la cresta neural en la codorniz, pollo embriones quiméricos se describe. Este método es una técnica simple y directa para el seguimiento de las células de la cresta neural durante la migración y la diferenciación que son difíciles de distinguir dentro de un embrión de pollo no manipulado.

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Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent progenitor cells to be an integral part of the neural crest1. Phenotypically, neural crest stem cells (NCSC) are defined by simultaneously expressing p75 (low-affine nerve growth factor receptor, LNGFR) and SOX10 during their migration from the neural crest2,3,4,5. These progenitor cells can differentiate into smooth muscle cells, chromaffin cells, neurons and glial cells, as well as melanocytes, cartilage and bone6,7,8,9. To cultivate NCSC in vitro, a special neural crest stem cell medium (NCSCM) is required10. The most complex part of the NCSCM is the preparation of chick embryo extract (CEE) representing an essential source of growth factors for the NCSC as well as for other types of neural explants. Other NCSCM ingredients beside CEE are commercially available. Producing CCE using laboratory standard equipment it is of high importance to know about the challenging details as the isolation, maceration, centrifugation, and filtration processes. In this protocol we describe accurate techniques to produce a maximized amount of pure and high quality CEE.

To cultivate neural crest stem cells (NCSC) in vitro, a special medium (NCSCM) is required. Essential part of NCSCM is chick embryo extract (CEE). We here describe accurate techniques to produce a maximized amount of pure and high quality CEE, including details as the isolation, maceration, centrifugation, and filtration processes.

La producción de extracto de embrión de pollo para el Cultivo de murino crestas de células neurales madre

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent ...

Investigación

Neurociencias

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor functions. Most investigations of sensorimotor mechanisms rely on either examination of neurons while an animal is static1,2 or record extracellular neuronal activity during a movement.3,4 While these studies have provided the fundamental background for sensorimotor function, they either do not evaluate functional information which occurs during a movement or are limited in their ability to fully characterize the anatomy, physiology and neurochemical phenotype of the neuron. A technique is shown here which allows extensive characterization of individual neurons during an in vivo movement. This technique can be used not only to study primary afferent neurons but also to characterize motoneurons and sensorimotor interneurons. Initially the response of a single neuron is recorded using electrophysiological methods during various movements of the mandible followed by determination of the receptive field for the neuron. A neuronal tracer is then intracellularly injected into the neuron and the brain is processed so that the neuron can be visualized with light, electron or confocal microscopy (Fig. 1). The detailed morphology of the characterized neuron is then reconstructed so that neuronal morphology can be correlated with the physiological response of the neuron (Figs. 2,3). In this communication important key details and tips for successful implementation of this technique are provided. Valuable additional information can be determined for the neuron under study by combining this method with other techniques. Retrograde neuronal labeling can be used to determine neurons with which the labeled neuron synapses; thus allowing detailed determination of neuronal circuitry. Immunocytochemistry can be combined with this method to examine neurotransmitters within the labeled neuron and to determine the chemical phenotypes of neurons with which the labeled neuron synapses. The labeled neuron can also be processed for electron microscopy to determine the ultrastructural features and microcircuitry of the labeled neuron. Overall this technique is a powerful method to thoroughly characterize neurons during in vivo movement thus allowing substantial insight into the role of the neuron in sensorimotor function.

A technique is described to quantify the in vivo physiological response of mammalian neurons during movement and correlate the physiology of the neuron with neuronal morphology, neurochemical phenotype and synaptic microcircuitry.

Caracterización fisiológicas, morfológicas y neuroquímicas de las neuronas modulada por el Movimiento

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a well-characterized niche for adult stem cells1. This segment of the outer root sheath contains a number of different types of stem cells, including epithelial stem cells2, melanocyte stem cells3 and neural crest like stem cells4-7. Hair follicles represent an accessible and rich source for different types of human stem cells. We and others have isolated neural crest stem cells (NCSCs) from human fetal and adult hair follicles4,5. These human stem cells are label-retaining cells and are capable of self-renewal through asymmetric cell division in vitro. They express immature neural crest cell markers but not differentiation markers. Our expression profiling study showed that they share a similar gene expression pattern with murine skin immature neural crest cells. They exhibit clonal multipotency that can give rise to myogenic, melanocytic, and neuronal cell lineages after in vitro clonal single cell culture. Differentiated cells not only acquire lineage-specific markers but also demonstrate appropriate functions in ex vivo conditions. In addition, these NCSCs show differentiation potential toward mesenchymal lineages. Differentiated neuronal cells can persist in mouse brain and retain neuronal differentiation markers. It has been shown that hair follicle derived NCSCs can help nerve regrowth, and they improve motor function in mice transplanted with these stem cells following transecting spinal cord injury8. Furthermore, peripheral nerves have been repaired with stem cell grafts9, and implantation of skin-derived precursor cells adjacent to crushed sciatic nerves has resulted in remyelination10. Therefore, the hair follicle/skin derived NCSCs have already shown promising results for regenerative therapy in preclinical models.
Somatic cell reprogramming to induced pluripotent stem (iPS) cells has shown enormous potential for regenerative medicine. However, there are still many issues with iPS cells, particularly the long term effect of oncogene/virus integration and potential tumorigenicity of pluripotent stem cells have not been adequately addressed. There are still many hurdles to be overcome before iPS cells can be used for regenerative medicine. Whereas the adult stem cells are known to be safe and they have been used clinically for many years, such as bone marrow transplant. Many patients have already benefited from the treatment. Autologous adult stem cells are still preferred cells for transplantation. Therefore, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin/hair follicles are a valuable source for regenerative medicine.

This article presents a robust protocol for isolation and culture of neural crest stem cells from human hair follicles.

Aislamiento y cultivo de células troncales de la cresta neural de los folículos del cabello humano

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

T-maze Forced Alternation and Left-right Discrimination Tasks for Assessing Working and Reference Memory in Mice

Forced alternation and left-right discrimination tasks using the T-maze have been widely used to assess working and reference memory, respectively, in rodents. In our laboratory, we evaluated the two types of memory in more than 30 strains of genetically engineered mice using the automated version of this apparatus. Here, we present the modified T-maze apparatus operated by a computer with a video-tracking system and our protocols in a movie format. The T-maze apparatus consists of runways partitioned off by sliding doors that can automatically open downward, each with a start box, a T-shaped alley, two boxes with automatic pellet dispensers at one side of the box, and two L-shaped alleys. Each L-shaped alley is connected to the start box so that mice can return to the start box, which excludes the effects of experimenter handling on mouse behavior. This apparatus also has an advantage that in vivo microdialysis, in vivo electrophysiology, and optogenetics techniques can be performed during T-maze performance because the doors are designed to go down into the floor. In this movie article, we describe T-maze tasks using the automated apparatus and the T-maze performance of &alpha;-CaMKII+/- mice, which are reported to show working memory deficits in the eight-arm radial maze task. Our data indicated that &alpha;-CaMKII+/- mice showed a working memory deficit, but no impairment of reference memory, and are consistent with previous findings using the eight-arm radial maze task, which supports the validity of our protocol. In addition, our data indicate that mutants tended to exhibit reversal learning deficits, suggesting that &alpha;-CaMKII deficiency causes reduced behavioral flexibility. Thus, the T-maze test using the modified automatic apparatus is useful for assessing working and reference memory and behavioral flexibility in mice.

This article presents the protocol of T-maze tests using a modified automated apparatus for assessing the learning and memory functions in mice.

T-laberinto alternancia forzada y la izquierda-derecha para la evaluación de las tareas de discriminación y de trabajo de la memoria de referencia en ratones

Forced alternation and left-right discrimination tasks using the T-maze have been widely used to assess working and reference memory, respectively, in ...

Analysis of Trunk Neural Crest Cell Migration using a Modified Zigmond Chamber Assay

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after undergoing an epithelial-mesenchymal transition 1,2. Following EMT, NCCs migrate large distances along stereotypic pathways until they reach their targets. NCCs differentiate into a vast array of cell types including neurons, glia, melanocytes, and chromaffin cells 1-3. The ability of NCCs to reach and recognize their proper target locations is foundational for the appropriate formation of all structures containing trunk NCC-derived components 3. Elucidating the mechanisms of guidance for trunk NCC migration has therefore been a matter of great significance. Numerous molecules have been demonstrated to guide NCC migration 4. For instance, trunk NCCs are known to be repelled by negative guidance cues such as Semaphorin, Ephrin, and Slit ligands 5-8. However, not until recently have any chemoattractants of trunk NCCs been identified 9. 
Conventional in vitro approaches to studying the chemotactic behavior of adherent cells work best with immortalized, homogenously distributed cells, but are more challenging to apply to certain primary stem cell cultures that initially lack a homogenous distribution and rapidly differentiate (such as NCCs). One approach to homogenize the distribution of trunk NCCs for chemotaxis studies is to isolate trunk NCCs from primary NT explant cultures, then lift and replate them to be almost 100% confluent. However, this plating approach requires substantial amounts of time and effort to explant enough cells, is harsh, and distributes trunk NCCs in a dissimilar manner to that found in in vivo conditions. 
Here, we report an in vitro approach that is able to evaluate chemotaxis and other migratory responses of trunk NCCs without requiring a homogenous cell distribution. This technique utilizes time-lapse imaging of primary, unperturbed trunk NCCs inside a modified Zigmond chamber (a standard Zigmond chamber is described elsewhere10). By exposing trunk NCCs at the periphery of the culture to a chemotactant gradient that is perpendicular to their predicted natural directionality, alterations in migratory polarity induced by the applied chemotactant gradient can be detected. This technique is inexpensive, requires the culturing of only two NT explants per replicate treatment, avoids harsh cell lifting (such as trypsinization), leaves trunk NCCs in a more similar distribution to in vivo conditions, cuts down the amount of time between explantation and experimentation (which likely reduces the risk of differentiation), and allows time-lapse evaluation of numerous migratory characteristics.

An approach to analyze the migration of explanted cells (trunk neural crest cells) is described. This method is inexpensive, gentle, and capable of distinguishing chemotaxis from both chemokinesis and other influences on migratory polarity such as those derived from cell-cell interactions within the primary trunk neural crest cell culture.

El análisis de la migración de células troncales neurales Crest utilizando una versión modificada del ensayo Zigmond Cámara

Neural crest cells (NCCs) are a transient population of cells present in vertebrate development that emigrate from the dorsal neural tube (NT) after ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

La detección de la hipoxia Microrregional en corteza cerebral de ratón por la imagen de dos fotones de fluorescencia endógena NADH

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Ratón reproducible aplastamiento del nervio ciático y posterior evaluación de la regeneración mediante el análisis de músculo entero Monte

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Aislamiento y cultivo de células de la cresta neural de embriones murinos del Tubo Neural

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

The discovery of neural stem and progenitor cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult mammalian brain has led to a body of research aimed at utilizing the multipotent and proliferative properties of these cells for the development of neuroregenerative strategies. A critical step for the success of such strategies is the mobilization of NPCs toward a lesion site following exogenous transplantation or to enhance the response of the endogenous precursors that are found in the periventricular region of the CNS. Accordingly, it is essential to understand the mechanisms that promote, guide, and enhance NPC migration. Our work focuses on the utilization of direct current electric fields (dcEFs) to promote and direct NPC migration - a phenomenon known as galvanotaxis. Endogenous physiological electric fields function as critical cues for cell migration during normal development and wound repair. Pharmacological disruption of the trans-neural tube potential in axolotl embryos causes severe developmental malformations1. In the context of wound healing, the rate of repair of wounded cornea is directly correlated with the magnitude of the epithelial wound potential that arises after injury, as shown by pharmacological enhancement or disruption of this dcEF2-3. We have demonstrated that adult subependymal NPCs undergo rapid and directed cathodal migration in vitro when exposed to an externally applied dcEF. In this protocol we describe our lab's techniques for creating a simple and effective galvanotaxis assay for high-resolution, long-term observation of directed cell body translocation (migration) on a single-cell level. This assay would be suitable for investigating the mechanisms that regulate dcEF transduction into cellular motility through the use of transgenic or knockout mice, short interfering RNA, or specific receptor agonists/antagonists.

In this protocol we demonstrate how to construct custom chambers that permit the application of a direct current electric field to enable time-lapse imaging of adult brain derived neural precursor cell translocation during galvanotaxis.

Un ensayo Galvanotaxis por análisis de la cinética precursoras neurales migración celular en un campo aplicado externamente directo Corriente Eléctrica

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout the developing vertebrate embryo. In addition to providing peripheral glia and neurons, NCC generate melanocytes as well as most of the cranio-facial skeleton. NCC migration and differentiation is controlled by a combination of their axial origin along the neural tube and their exposure to regionally distinct extracellular cues. Such contribution of extracellular ligands is especially evident during the formation of the enteric nervous system (ENS), a complex interconnected network of neural ganglia that locally controls (among other things) gut muscle movement and intestinal motility. Most of the ENS is derived from a small initial pool of NCC that undertake a long journey in order to colonize - in a rostral to caudal fashion - the entire length of the prospective gut. Among several signaling pathways known to influence enteric NCC colonization, GDNF/RET signaling is recognized as the most important. Indeed, spatiotemporally controlled secretion of the RET ligand GDNF by the gut mesenchyme is chiefly responsible for the attraction and guidance of RET-expressing enteric NCC to and within the embryonic gut. Here, we describe an ex vivo cell migration assay, making use of a transgenic mouse line possessing fluorescently labeled NCC, which allows precise quantification of enteric NCC migration potential in the presence of various growth factors, including GDNF.

We present an ex vivo cell migration assay that allows precise quantification of enteric neural crest cell migration potential in the presence of various growth factors.

Un ensayo de migración celular cuantitativa para murinos entéricas Neuronales Progenitores

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...